分子診斷技術(shù)平臺的進展及展望

1、分子診斷技術(shù)平臺的進展及展望分子診斷技術(shù)平臺的進展及展望內(nèi)內(nèi) 容容 病原體檢測技術(shù)概述病原體檢測技術(shù)概述 病原體核酸檢測技術(shù)概述病原體核酸檢測技術(shù)概述 病原體核酸檢測新技術(shù)應(yīng)用病原體核酸檢測新技術(shù)應(yīng)用 核酸檢測新技術(shù)存在問題及發(fā)展核酸檢測新技術(shù)存在問題及發(fā)展治治 療療 近近1010年新發(fā)傳染病絕大多數(shù)是病毒引起年新發(fā)傳染病絕大多數(shù)是病毒引起病毒與亞病毒6819種408屬動物病毒1917種204屬感染人296種37屬背景背景背景檢測技術(shù)概述 形態(tài)學(xué)（電鏡）形態(tài)學(xué)（電鏡） 組織學(xué)（細胞培養(yǎng)）組織學(xué)（細胞培養(yǎng)） 免疫學(xué)（免疫學(xué)（ELISA,Western Blot,ELISA,Western Blo

2、t, IF,NT,HI IF,NT,HI） 分子生物學(xué)（分子生物學(xué)（PCR,RT-PCR,qPCR,mPCR,PCR,RT-PCR,qPCR,mPCR, Microarray,Sequencing Microarray,Sequencing） 傳統(tǒng)檢測方法的局限性傳統(tǒng)檢測方法的局限性 膠體金膠體金 （靈敏度（靈敏度 窗口期）窗口期） ELISA ELISA （靈敏度（靈敏度 窗口期）窗口期） PCR/RT-PCR PCR/RT-PCR （通量（通量 未知病原）未知病原） Real-time PCR Real-time PCR （通量（通量 未知病原未知病原) ) 巣式巣式PCR/RT-PCR

3、(PCR/RT-PCR (污染，電泳）污染，電泳） 核酸擴增檢測技術(shù)概述核酸擴增檢測技術(shù)概述 核酸擴增技術(shù)是一種常規(guī)生物技術(shù)，是分子生物學(xué)的基礎(chǔ)研究方法。核酸擴增技術(shù)是一種常規(guī)生物技術(shù)，是分子生物學(xué)的基礎(chǔ)研究方法。作為主流檢測技術(shù)被廣泛應(yīng)用于實驗室、醫(yī)院。作為主流檢測技術(shù)被廣泛應(yīng)用于實驗室、醫(yī)院。 核酸擴增技術(shù)可分為核酸擴增技術(shù)可分為變溫擴增技術(shù)變溫擴增技術(shù)和和等溫擴增技術(shù)等溫擴增技術(shù)。變變 溫溫 擴擴 增增PCRPCRRealtime PCRRealtime PCRRT PCRRT PCRNested PCRNested PCRMultiplex PCRMultiplex PCRDigita

4、l PCRDigital PCR等等 溫溫 擴擴 增增TMA/NASBATMA/NASBASMARTSMARTHDAHDASDA/NDASDA/NDARCA/MDARCA/MDALAMPLAMP/ /基于基于T7 PromoterT7 Promoter基于解旋酶基于解旋酶基于鏈置換活性的基于鏈置換活性的DNA DNA 聚合酶聚合酶鏈置換和重組酶鏈置換和重組酶核酸檢測新技術(shù)核酸檢測新技術(shù) LAMP/IMSA/RPA LAMP/IMSA/RPA Multiplex PCR Multiplex PCR Nested PCR ( Nested PCR (一步法）一步法） Digital PCR Dig

5、ital PCR 自動化檢測自動化檢測 再測序芯片再測序芯片 PCR PCR 陣列陣列 二代測序（二代測序（NGSNGS） POCT POCT（現(xiàn)場檢測）（現(xiàn)場檢測） 核酸檢測技術(shù)發(fā)展趨勢 未知病原 多病原 高通量 自動化 現(xiàn)場技術(shù) (POCT)中中 心心 實實 驗驗 室室 科科 研研 方方 向向 簡簡 介介 未知病原檢測技術(shù)平臺 高通量自動化工作站技術(shù)平臺 多病原、癥候群檢測技術(shù)平臺 現(xiàn)場檢測技術(shù)平臺4123u 現(xiàn)場檢測技術(shù) - LAMP, IMSAu 多病原檢/監(jiān)測技術(shù) - GeXP, Qiaxcel, RPMu 未知病原鑒定未知病原鑒定 - NGS，VIDISCA, RPM u 自動化檢

6、測- Liquid handling systemu 生物信息學(xué)支持- VIP軟件 檢測檢測/ /監(jiān)測監(jiān)測/ /鑒定鑒定技術(shù)平臺定位功能實際應(yīng)用相關(guān)英文文章（中文文章略）未知病原鑒定國家級技 術(shù) 服務(wù) 和 支撐T e m b u s u V i r u s i n ducks, China, Echo 33Echo33J. Virol. 2012, 86(6):3406Emerging Infect Dis, 2011. 17 (10):1873Archive virology, 2014，DOI 10.1007自動化檢測 國家級技 術(shù) 服務(wù) 和 支撐全國分子和血清學(xué)流行病學(xué)調(diào)查，大規(guī)模SNP

7、分析J. Infection 2011，62(1):107BMC Infect Dis, 2010， 10:178Inflam. Bowel Dis 2011,1 7(12):2472PLOS One , 2013, 8(1): e55197多病原檢測/監(jiān)測省級高 通 量檢 測 和癥 候 群監(jiān)測呼吸道(9+7)，手足口，流感，腹瀉，HPV分型，SNP，耐藥,轉(zhuǎn)基因，腦炎J Virol Met. 168 (2010) 255258Adv. in Virology 2011: 129134J. Clin. Microbiol 2012, 50(2):288J.Med Virol. 2012, 84

8、:957J. Clin. Microbiol. 2012, 50(7)：2384BMC Infect Dis, 2012,12:189BMC Microbiology 2013, 13:58PLOS One, 2013 (accepted)現(xiàn)場檢測地市級現(xiàn) 場 初步篩查手足口，H1N1H1N1，H7N9H7N9流感流感，諾如病毒, HPV，HIV，HCV,MERS, EbolaJ Virol Met 2010,167(2), 214J Virol Met 2011,175:283J. Clin. Microbiol 2011, 49(10）3545PLOS One ,2012,7(12): e

9、52486Adv. in Infect Dis, 2012, 2, 110-118 生物信息學(xué)軟件DS2，VIP 國家級技 術(shù) 服務(wù) 和 支撐表位分析，抗原抗體相互作用J Virol Met 181 (2012) 182 187 Biomed Environ Sci, 2012; 25(1): 98-103 病毒檢測病毒檢測/監(jiān)測監(jiān)測/簽定技術(shù)平臺及生物信息學(xué)簽定技術(shù)平臺及生物信息學(xué) 核酸檢測新技術(shù)核酸檢測新技術(shù) LAMP/ Multiplex PCR Nested PCR (一步法） Digital PCR 自動化檢測 再測序芯片 PCR 陣列 二代測序（NGS） POCT（現(xiàn)場檢測） LA

10、MPLAMP技術(shù)特點技術(shù)特點u 特異性強特異性強: 2: 2對引物配對對引物配對6 6個區(qū)域或個區(qū)域或3 3對引物配對對引物配對8 8個區(qū)域個區(qū)域u 靈敏度高：靈敏度高： 10-100 copies10-100 copiesu 設(shè)備要求低設(shè)備要求低: : 不需要不需要PCRPCR儀器，儀器，65 65 水浴（等溫）水?。ǖ葴兀﹗ 檢測快速：檢測快速： 1 1小時小時u 操作簡單：操作簡單： 一步法（單管）一步法（單管）u 結(jié)果判定方便：顏色（肉眼觀察顏色變化和沉淀）結(jié)果判定方便：顏色（肉眼觀察顏色變化和沉淀） 吸光值（半定量，吸光值（半定量，650nm650nm比色）比色） 普通瓊脂糖電泳普通

11、瓊脂糖電泳 濁度（濁度儀，實時監(jiān)測，半定量）濁度（濁度儀，實時監(jiān)測，半定量） 實時熒光定量PCR儀2小時水浴、熱塊、PCR儀、濁度儀電泳、濁度、顏色指示劑、肉眼觀察1小時25￥/Reaction儀器要求實驗結(jié)果反應(yīng)時間實驗成本Realtime PCR 與 LAMPLAMP 特點比較Realtime PCRLAMPVS實時熒光定量PCR儀50￥/Reaction病原體檢測LAMP擴 展J Virol Met 2010,167(2), 214H1N1J Virol Met 2011,175:283Advances in Infect. Dis. 2012EV71CA16J Clin. Microb

12、iol 2011,49(10):3545HPVNorVPLOS One 2012, 7(12)direct LAMP定量 HIVIMSA/EV71/CA16 JCM,2014, 52（6): 1862MERS (submitted)Gene, 2014, 541, 123-128Food and enviromental virology ,2014GEAR/HRVClin Microbiol Infect. 2013H7N9submitted 內(nèi)容：LAMP檢測技術(shù)應(yīng)用于手足口病例的現(xiàn)場評價 合作單位：湖南、山東、河北省CDC 標(biāo)本數(shù)量：手足口500份（每?。㎜AMP 技術(shù)的現(xiàn)場評價LAMP

13、 技術(shù)現(xiàn)場評價LAMP 檢測技術(shù)應(yīng)用于手足口病例的評價 (湖南)2012, 4(2) 110-118試驗真陽性(TP)真陰性(TN)合計LAMP陽性233(DP)0(FP)233LAMP陰性0(FN)282(DN)282總數(shù)233282515腸道病毒EV71型核酸檢測結(jié)果比較腸道病毒CoxA16型核酸檢測結(jié)果比較試驗真陽性(TP)真陰性(TN)合計LAMP陽性103(DP)0 (FP)103LAMP陰性2(FN)410(DN)412總數(shù)105410515p小結(jié)臨床標(biāo)本515份EV71符合率100%CA16符合率99.6%參照：國產(chǎn)RealTime PCR 檢測試劑盒IMSAIMSA (Isot

14、hermal Multiple (Isothermal Multiple Self-matching-initiated AmplificationSelf-matching-initiated Amplification) ) 目的：建立具有自主知識產(chǎn)權(quán)的等溫多自配體 引發(fā)擴增反應(yīng) 專利進入實質(zhì)審查 引物設(shè)計軟件：www.imsa-IMSA 與 LAMP 的特點比較IMSALAMP引物6條4-6條靶基因上的7個位點靶基因上的6-8個位點外引物為混合型：對應(yīng)2個位點外引物只對應(yīng)1個位點內(nèi)引物5端互補-外/內(nèi)/莖=1/4/8外/內(nèi)/環(huán)=1/8/4擴增反應(yīng)產(chǎn)生4種可自我循環(huán)復(fù)制的基本結(jié)構(gòu)產(chǎn)生1種可

15、自我循環(huán)復(fù)制的基本結(jié)構(gòu)所有引物在反應(yīng)中持續(xù)起作用外引物只在反應(yīng)初始起作用IMSA 與 LAMP 方法檢測手足口病結(jié)果IMSA方法在常見傳染病檢測中的應(yīng)用方法在常見傳染病檢測中的應(yīng)用IMSA法針對EV71和CVA16 檢測的最低檢測線：利用概率元分析法（probit analysis）拷貝數(shù)（copies/反應(yīng)）陽性數(shù)/總測試數(shù)，括號外為 EV71的測試，括號內(nèi)為CVA16的測試IMSA實時濁度法mHNB顏色判定法（IMSA）HNB顏色判定法（IMSA）LAMP實時濁度法1000015/15 (15/15)15/15 (15/15)15/15 (15/15)15/15 (15/15)500015

16、/15 (15/15)15/15 (15/15)15/15 (15/15)15/15 (15/15)100015/15 (15/15)15/15 (15/15)15/15 (15/15)9/15 (15/15)50012/15 (15/15)10/15 (15/15)9/15 (15/15)6/15 (15/15)2509/15 (15/15)9/15 (15/15)6/15 (15/15)3/15 (12/15)1006/15 (15/15)6/15 (15/15)3/15 (15/15)3/15 (6/15)503/15 (12/15)3/15 (9/15)0/15 (9/15)0/15

17、(3/15)250/15 (9/15)0/15 (6/15)0/15 (3/15)0/15 (0/15)100/15 (3/15)0/15 (3/15)0/15 (0/15)0/15 (0/15)50/15 (3/15)0/15 (0/15)0/15 (0/15)0/15 (0/15)10/15 (0/15)0/15 (0/15)0/15 (0/15)0/15 (0/15)93710391749326667108149430JCM,2014, 52（6): 1862IMSA 與 LAMP 方法檢測手足口病臨床標(biāo)本結(jié)果IMSA法針對261份手足口臨床標(biāo)本的檢測：以商業(yè)化qRT-PCR試劑盒檢測結(jié)

18、果為標(biāo)準qRT-PCR檢測IMSA實時濁度法HNB顏色判定法（IMSA）mHNB顏色判定法（IMSA）LAMP實時濁度法 陽性陰性陽性陰性陽性陰性陽性陰性EV71 陽性（56）542524542515陰性（205）0205020502050205靈敏度（%）96.4% (95% CI: 87.7-99.6%)92.9% (95% CI: 82.7-98.0%)96.4% (95% CI: 87.7-99.6%)91.1% (95% CI: 80.4-97.0%)特異性（%）100.0% (95% CI: 98.2-100.0%)100.0% (95% CI: 98.2-100.0%)100.0

19、% (95% CI: 98.2-100.0%)100.0% (95% CI: 98.2-100.0%)陽性預(yù)測值（%）100.0% (95% CI: 93.4-100.0%)100.0% (95% CI: 93.2-100.0%)100.0% (95% CI: 93.4-100.0%)100.0% (95% CI: 93.0-100.0%)陰性預(yù)測值（%）99.0% (95% CI: 96.6-99.9%)98.1% (95% CI: 95.2-99.5%)99.0% (95% CI: 96.6-99.9%)97.6% (95% CI: 94.5-99.2%)CVA16 陽性（130）1237

20、12010122811812陰性（131）0131013101310131靈敏度（%）94.6% (95% CI: 89.2-97.8%)92.3% (95% CI: 86.3-96.3%)93.9% (95% CI: 88.2-97.3%)90.8% (95% CI: 84.4-95.1%)特異性（%）100.0% (95% CI: 97.2-100.0%)100.0% (95% CI: 97.2-100.0%)100.0% (95% CI: 97.2-100.0%)100.0% (95% CI: 97.2-100.0%)陽性預(yù)測值（%）100.0% (95% CI: 97.1-100.0%

21、)100.0% (95% CI: 97.0-100.0%)100.0% (95% CI: 97.0-100.0%)100.0% (95% CI: 96.9-100.0%)陰性預(yù)測值（%）94.9% (95% CI: 89.8-97.9%)92.9% (95% CI: 87.3-96.6%)94.2% (95% CI: 89.0-97.5%)91.6% (95% CI: 85.8-95.6%)IMSA法對手足口臨床標(biāo)本的檢測，其診斷靈敏度要高于LAMP法IMSA檢測H7N9方法的建立及評估 5份臨床標(biāo)本的實驗室檢測驗證 與國家流感中心結(jié)果（qPCR）相一致 衛(wèi)生部臨檢中心的H7N9檢測技術(shù)考核P

22、anel 共計10份標(biāo)本，結(jié)果全部符合，無漏檢及誤檢 2013年12月末，參與廣東省新發(fā)H7N9病例檢測 結(jié)果符合，顯色法結(jié)果判讀準確 H7N9檢測試劑盒轉(zhuǎn)讓北京愛普益生物科技有限公司 現(xiàn)場無儀器化提取核酸，發(fā)展直接法現(xiàn)場無儀器化提取核酸，發(fā)展直接法 多重檢測多重檢測 （含內(nèi)參）（含內(nèi)參） 污染問題污染問題存在問題核酸檢測新技術(shù)核酸檢測新技術(shù) LAMP/ Multiplex PCR Nested PCR (一步法） Digital PCR 自動化檢測 再測序芯片 PCR 陣列 二代測序（NGS） POCT（現(xiàn)場檢測）DPODPO探針熔解曲線探針熔解曲線BioPlex氨基糖苷類耐藥基因氨基糖苷類

23、耐藥基因結(jié)核桿菌多耐藥性結(jié)核桿菌多耐藥性-手足口病相關(guān)病毒手足口病相關(guān)病毒-人乳頭瘤病毒人乳頭瘤病毒流感病毒流感病毒- 648520腹瀉相關(guān)病毒腹瀉相關(guān)病毒-呼吸道病毒呼吸道病毒乳腺癌宮頸癌相關(guān)乳腺癌宮頸癌相關(guān)SNPsSNPsTemperature Switch PCR (TSP)GeXP, QIAxcelBMC Microbiology.2013, 13:582013 , 8(4): e62126BRI, 2013, 327620 研究結(jié)果研究結(jié)果 引物濃度調(diào)整：嵌合引物和通用引物的比例；各嵌合引引物濃度調(diào)整：嵌合引物和通用引物的比例；各嵌合引物濃度；擴增體系選擇物濃度；擴增體系選擇 三個退

24、火溫度調(diào)整，三個退火溫度調(diào)整， 三個循環(huán)數(shù)調(diào)整，三個循環(huán)數(shù)調(diào)整，擴增條件探索與優(yōu)化擴增條件探索與優(yōu)化研究結(jié)果：研究結(jié)果：基于基于QIAxcelQIAxcel全自動電泳儀全自動電泳儀Group A（9種）Group B（7種）流感病毒A型和B型、季節(jié)性H1N1呼吸道合胞病毒A型和B型副流感病毒1型副流感病毒2、3型冠狀病毒OC43、229E、HKU1冠狀病毒NL63人鼻病毒；腺病毒人偏肺病毒；人博卡病毒兩組中均加入兩組中均加入Rnasep-DNARnasep-DNA引物作為內(nèi)參；引物作為內(nèi)參；病原體分組病原體分組基于基于QiaxcelQiaxcel的多重的多重PCRPCR檢測技術(shù)檢測技術(shù)16種常

25、見呼吸道病毒分型檢測種常見呼吸道病毒分型檢測 呼吸道病毒多重呼吸道病毒多重PCR快速檢測試劑盒快速檢測試劑盒( ABT9+7)商業(yè)化商業(yè)化發(fā)熱呼吸道癥候群多種病原核酸檢測培訓(xùn)班發(fā)熱呼吸道癥候群多種病原核酸檢測培訓(xùn)班 -北京北京 2012. 05 “常見常見1616種呼吸道病毒檢測的多重種呼吸道病毒檢測的多重PCRPCR試劑盒試劑盒”應(yīng)用于十二五傳染病重大應(yīng)用于十二五傳染病重大專項發(fā)熱伴呼吸道癥候群監(jiān)測項目專項發(fā)熱伴呼吸道癥候群監(jiān)測項目“常見常見16種呼吸道病毒檢測的多重種呼吸道病毒檢測的多重PCR試劑盒試劑盒”應(yīng)用于全應(yīng)用于全國流感監(jiān)測網(wǎng)絡(luò)部分實驗室國流感監(jiān)測網(wǎng)絡(luò)部分實驗室呼吸道病毒多重呼吸道

26、病毒多重PCRPCR快速檢測試劑盒快速檢測試劑盒 存在問題：病毒變異存在問題：病毒變異 （引物優(yōu)化）（引物優(yōu)化） 病毒地區(qū)差異病毒地區(qū)差異 （引物優(yōu)化）（引物優(yōu)化） 結(jié)果判斷結(jié)果判斷 陽性對照陽性對照 （1616質(zhì)粒質(zhì)粒/RNA/RNA） 增加病原體（流感亞型）增加病原體（流感亞型） 內(nèi)參更換內(nèi)參更換 （假病毒）（假病毒） 兩管并一管（兩管并一管（1111種病毒）種病毒） 流感耐藥流感耐藥 基于基于熔熔解曲線分析的解曲線分析的多重多重PCRPCR檢測技術(shù)檢測技術(shù)六種常見食源性細菌的檢測六種常見食源性細菌的檢測目的菌種目的菌種致瀉性大腸桿菌致瀉性大腸桿菌沙門氏菌沙門氏菌志賀氏菌志賀氏菌單核細胞增

27、生性李斯特氏菌單核細胞增生性李斯特氏菌副溶血弧菌副溶血弧菌金黃色葡萄球菌金黃色葡萄球菌引物設(shè)計引物設(shè)計單引物單模板單引物單模板多引物多模板及引物分組多引物多模板及引物分組3 沙門氏菌沙門氏菌3 副溶血弧菌副溶血弧菌1 1 志賀氏菌志賀氏菌2 2 致瀉性大腸桿菌致瀉性大腸桿菌1 1 金黃色葡萄球菌金黃色葡萄球菌2 李斯特氏菌李斯特氏菌122331十二種腹瀉病原體的檢測十二種腹瀉病原體的檢測(submitted)(submitted)目的病毒目的病毒目的細菌目的細菌 諾如病毒諾如病毒GIGI型型空腸彎曲菌空腸彎曲菌札如病毒札如病毒鼠疫耶爾森菌鼠疫耶爾森菌腺病毒腺病毒F F組組副溶血弧菌副溶血弧菌諾

28、如病毒諾如病毒GIIGII型型志賀氏菌志賀氏菌輪狀病毒輪狀病毒A A組組大腸桿菌大腸桿菌人類星狀病毒人類星狀病毒沙門氏菌沙門氏菌核酸檢測新技術(shù)核酸檢測新技術(shù) LAMP/ Multiplex PCR Nested PCR (一步法） Digital PCR 自動化檢測 再測序芯片 PCR 陣列 二代測序（NGS） POCT（現(xiàn)場檢測）one-step Real-Time nested RT-PCR(ORTN RT-PCR) (submitted) 基于基于 TSP TSP 設(shè)計的新型一步法設(shè)計的新型一步法巣式巣式PCR PCR 方法方法實驗設(shè)計：實驗設(shè)計： 一管四引物兩退火溫度一管四引物兩退火溫

29、度 F1 F2R2 R1 不同長度的內(nèi)外引物不同長度的內(nèi)外引物 退火溫度不同退火溫度不同 引物濃度不同引物濃度不同 溶解曲線分析溶解曲線分析 極高靈敏度極高靈敏度實驗結(jié)果：熔解曲線實驗結(jié)果：熔解曲線& &瓊脂糖電泳瓊脂糖電泳1 1（L1L1）：陰性樣品。）：陰性樣品。 2 2（L2L2）：陽性樣品）：陽性樣品實驗結(jié)果：實驗結(jié)果：EV71 EV71 標(biāo)準曲線圖標(biāo)準曲線圖本試驗方法可用作本試驗方法可用作EV71EV71樣品的定量分析，樣品的定量分析，CTCT值可達到值可達到38.4038.40，1010倍于倍于qPCRqPCRAssaysPositive No. and Perce

30、ntage of EV71Negative No. and Percentage of EV71Ct valueORTN RT-PCR41（41%）59（59%）26-38qRT-PCR29（29%）71（71%）26.5-35傳統(tǒng)傳統(tǒng)巣式巣式PCRPCR41（41%）59（59%）新型一步法巣式巣式PCR與熒光定量探針法PCR和傳統(tǒng)兩步法巣式巣式PCRPCR比較比較（100份臨床樣品）針對針對1212例檢測結(jié)果不同樣品，采取重復(fù)試驗并測序的方法驗例檢測結(jié)果不同樣品，采取重復(fù)試驗并測序的方法驗證新型一步法檢測結(jié)果的準確性。證新型一步法檢測結(jié)果的準確性。Advantages of digital

31、 PCRAdvantages of digital PCR（優(yōu)點）（優(yōu)點） Not rely on external references Increased tolerance to enzyme-inhibiting substances Simultaneous template amplification Superior precision, sensitivity and reproducibility lower coefficient of variation Reduced background DNA and contaminant levels which consequ

32、ently increases the signal-to-noise ratio in positive reaction partitions核酸檢測新技術(shù)核酸檢測新技術(shù) LAMP/ Multiplex PCR Nested PCR (一步法） Digital PCR 自動化檢測 再測序芯片 PCR 陣列 二代測序（NGS） POCT（現(xiàn)場檢測）自動化高通量檢測Beckman Biomek NX/FXBeckman Biomek NX/FX型型實驗室自動化工作站實驗室自動化工作站 主要特點：單臂或雙臂，主要特點：單臂或雙臂，9696道、道、384384道或智能八道加樣器供選，道或智能八道加

33、樣器供選，2424個微孔盤工作區(qū)，多種分注功能及配件定位器可選個微孔盤工作區(qū)，多種分注功能及配件定位器可選未知病原檢測未知病原檢測 再測序芯片（再測序芯片（RPMRPM） PCR PCR 陣列（陣列（PCR array)PCR array) 二代測序二代測序 （NGSNGS）智能化的智能化的分析軟件分析軟件 芯片滾動芯片滾動雜交儀雜交儀芯片洗芯片洗滌工作滌工作站站定制基因芯定制基因芯片片 高分辨率的高分辨率的芯片掃描儀芯片掃描儀未知病原未知病原RPMRPMu 完成完成4 4種不同癥候群（呼吸道感染，種不同癥候群（呼吸道感染，7 7科科2323屬；胃腸道感染屬；胃腸道感染，6 6科科1313屬；

34、腦炎和神經(jīng)系統(tǒng)感染，屬；腦炎和神經(jīng)系統(tǒng)感染，6 6科科1717屬；病毒性出血血熱屬；病毒性出血血熱相關(guān)，相關(guān)，4 4科科1010屬）的相關(guān)病毒性病原體的全部引物和探針的生屬）的相關(guān)病毒性病原體的全部引物和探針的生物信息學(xué)分析、設(shè)計和芯片定制（物信息學(xué)分析、設(shè)計和芯片定制（650650片）和儲備片）和儲備u 建立了呼吸道感染和胃腸道感染再測序檢測芯片技術(shù)平臺建立了呼吸道感染和胃腸道感染再測序檢測芯片技術(shù)平臺RPM-Flu3.1：FluA(35%)12種病毒種病毒21種細菌種細菌RPM-IVDC1：86種病毒亞型種病毒亞型 22種細菌種細菌Plos One,2013 8(9) : e75704Fr

35、ontier in Microbiology,2015(accepted)Resequencing Pathogen Microarray再測序芯片（再測序芯片（RPM）高通量自動化的腦炎癥候群檢測高通量自動化的腦炎癥候群檢測PCR ArrayPCR Array方法方法方法建立的基礎(chǔ)方法建立的基礎(chǔ) 1 1：樣品體積擴大：樣品體積擴大RNA LcDNA L自動化640RNARNAcDNAcDNA方法所需樣品量方法所需樣品量3232L L（1616個孔）個孔）方法建立的基礎(chǔ)方法建立的基礎(chǔ) 2 2：9696孔板的分配孔板的分配特點：特點：1.1.引物組在引物組在9696孔板上的分布是模式化的?？装迳?/p>

36、的分布是模式化的。2.2.更快的分配體系。更快的分配體系。3.3.節(jié)省了樣品編號的時間。節(jié)省了樣品編號的時間。引物組可以安排在同一個整行或整列也可以平均分配整行或者整列ABCDEFGH12腸道病毒乙腦皰疹腮腺炎彈狀病毒副粘病毒麻疹西尼羅蜱傳腦炎細菌16s呼吸道合胞風(fēng)疹布尼亞病毒蟲媒病毒沙粒病毒黃病毒方法中所用的引物：方法中所用的引物：200200對對+ +來源來源再測序芯片的引物再測序芯片的引物文獻中查到的文獻中查到的各個科室提供的各個科室提供的根據(jù)每年流行情況不同，對引物組進行調(diào)整根據(jù)每年流行情況不同，對引物組進行調(diào)整特點：特點：1.1.每個樣品由每個樣品由1616個不同的引物組檢測個不同的

37、引物組檢測2.2.整板的整板的PCRPCR產(chǎn)物都用同一對引物測序。產(chǎn)物都用同一對引物測序。方法流程（方法流程（2424小時完成）小時完成）全自動電泳儀RNAcDNA工作站加樣與PCR可以做成預(yù)制反應(yīng)體系獲得電泳結(jié)果獲得sanger法測序結(jié)果 測序陰性樣本：做二代測序Real time Real time 結(jié)果結(jié)果PCR arrayPCR array方法結(jié)果方法結(jié)果提示提示所有樣品一般都所有樣品一般都為為Real timeReal time陰陰性樣本性樣本常見病原體陽性常見病原體陽性有突變，或方法靈敏度不同有突變，或方法靈敏度不同不常見病原體陽性不常見病原體陽性少見的病原體少見的病原體陰性陰性參

38、考參考16SRNA16SRNA結(jié)果結(jié)果結(jié)果分析結(jié)果分析臨床檢測結(jié)果：兒童醫(yī)院樣品臨床檢測結(jié)果：兒童醫(yī)院樣品lz18Pseudomonaslz32Mumpslz144EVMumpslz162EVlz136EVPseudomonaslz149Pseudomonaslz160Mumpslz130cEVMumpslz153EVlz117cEVLZ104cMumpsLZ155EVLz87MumpsLz67EVLz81EVLz85EVLz91MumpsLz75MumpsLz79Mumps陽性率：1996 (19.8%) 另有147份樣本進行中新一代測序技術(shù)應(yīng)用領(lǐng)域新一代測序技術(shù)應(yīng)用領(lǐng)域攜帶者篩查預(yù)處理藥理基因測試產(chǎn)前監(jiān)測孕后監(jiān)測孕期監(jiān)測胚胎遺傳學(xué)診斷遺傳疾病遺傳疾病腫瘤研究腫瘤研究腫瘤切除邊緣治療狀態(tài)監(jiān)測預(yù)后復(fù)發(fā)檢測風(fēng)險預(yù)警早期檢測篩查腫瘤診斷設(shè)備平臺感染疾病感染疾病動物微生物研究微生物定性病毒載量監(jiān)測微生物定量突變株鑒定病毒整合移植配型移植配型鑒定和配型組織排斥全程監(jiān)測移植后排斥監(jiān)測以及更廣闊的應(yīng)用以及更廣闊的應(yīng)用可感染人病毒的發(fā)現(xiàn)時間曲線Woolhouse M E et al. Proc. R. Soc. B 2008;275:2111-2115 隨著越來越多的病毒被發(fā)現(xiàn)了，其中可能致病的病毒種隨著越來越多的病毒被發(fā)現(xiàn)了，其中可能致病的病毒種類也隨之增加。類也隨之增加。臨