第八章非線性色譜原理及其在蛋白質(zhì)分離與純化中的應(yīng)用

1、第八章非線性色譜原理及其在妥。分,與純化中的應(yīng)用第一節(jié)概述色譜法起源于20世紀(jì)初，1906年俄國(guó)植物學(xué) 彖米哈伊東茨維特用碳酸鈣填充豎立的玻璃管， 以石油隧洗脫植物色素的提取液，經(jīng)過一段時(shí)間洗 脫之后，植物色素在碳酸鈣柱中實(shí)現(xiàn)分離，由一條 色帶分散為教條平行的色帶。由于這一實(shí)驗(yàn)將混合 的植物色素分離為不同的色帶，因此茨維特將這種 方法命名為XpoMaTO r p a（|）m利，這個(gè)單 詞錄終被英語等拼音語言接受，成為色譜法的名稱。 漢語中的色譜也是對(duì)這個(gè)單詞的意譯。1952年馬丁和詹林斯提出用氣體作為流動(dòng)相進(jìn)行色譜分離的想 法，他們用硅藻土吸附的硅酮油作為固定相， 用氮作為流動(dòng)相分離了若干種小

2、分子量揮發(fā) 性有機(jī)酸。卷和色譜出現(xiàn)使色譜技術(shù)從錄初的定性分離手段進(jìn)一步演化 為具有分離功能的定量測(cè)定手段，并且極大的剌激了 色譜技術(shù)和理論的發(fā)徵。相比于早期的液相色譜，以專體為 流動(dòng)相的色譜對(duì) 設(shè)備的要求更高，這促進(jìn)了色譜技術(shù)的機(jī)械化、標(biāo)準(zhǔn) 化和自動(dòng)化；氣相色譜需要特殊和更靈敏的檢測(cè)裝置，這促迷了 檜測(cè)器的開發(fā)；而氣相色譜的標(biāo)準(zhǔn)化又使得色譜學(xué)理 論得以形成色譜學(xué)理論中有著重要地位的塔板理論和 Van Deemter方程,以及保留時(shí)間、侏紹指數(shù)、峰寬 等概念都是在研究氣相色譜行為的過程中形成的。60年代，為了分,要。質(zhì)、核酸等不易沌化的大分子物質(zhì)，趨和色譜的理合和方 法板重新引入經(jīng)典液相色譜。6

3、0年代末科克蘭、哈佝、苻瓦斯、菌 黑斯、里普斯克等人開發(fā)了世界上第一臺(tái)嵩 效法相色譜儀，開啟了需效法相色譜的時(shí)代。 高效法相色譜使用拉控更細(xì)的固定和填充色 譜樁，提高色譜樁的緣板數(shù)，以需壓驅(qū)動(dòng)流 動(dòng)相，使得經(jīng)典法相色譜需要數(shù)目乃至教月 完成的分書工作得以在幾個(gè)小時(shí)/至幾十分 鐘內(nèi)完成。1971年科克絲等人出版了法相色譜的 現(xiàn)代實(shí)戲一書，標(biāo)志著高效法和色譜法 CHPLCJ正式也立。在此后的時(shí)間里，需 效液相色譜成為景為帝用的分甫和檢測(cè)手段, 在有機(jī)化學(xué)、生物化學(xué)、醫(yī)學(xué).藥物開發(fā)與 檢測(cè)、化工、食品科學(xué)、環(huán)境監(jiān)測(cè).商檢和 法檢等方面都有廣泛的應(yīng)用。高效法相色譜同時(shí)還極大的剌激了固定相材料、檢測(cè)技術(shù)

4、、數(shù)據(jù)處理技術(shù)以及色譜理企的發(fā)展。色譜法的基本特點(diǎn)1、分,效率需2、應(yīng)用范圍廣3.操作參數(shù)多4、高靈敏度在線檢測(cè)5、快速分禽6、連續(xù)自動(dòng)化操作保留日寸間/min圖8-1 TSK-十八烷基無孔聚合物反相柱分離蛋白質(zhì)色譜柱：-NPR (內(nèi)徑 4.6mmX 35mm);沂tiM 1 -5 ml/rrrin; 溫l度 25 P ; 樣品：1核糖核酸酶；2一胰島素；檢測(cè)器一UV：nm3一細(xì)胞色素C; 4一溶菌醒；5 a-乳清蛋白；6一肌紅蛋白；7一卵清蛋白淋洗條件：線性梯度為乙廉在0 05%三氯乙酸中8 min 內(nèi)從，20 %80 %1、分宙效率需每米可達(dá)十幾萬個(gè)理合塔板，幾個(gè)度來的色譜 樁就可以分喜多

5、如分的蛋。質(zhì)混合物。2、應(yīng)用范陽廣從極性到非極性，禽子型到非肉子型，小分子 列大分子，無機(jī)到有機(jī)及生活物去，以及其它熟 穩(wěn)定或熱不穩(wěn)定的化合物，可以說無所不包。尤 其是對(duì)生物樣品的分言分析，是其他方法無法代 琴的。3、操作參數(shù)多流動(dòng)相可以是工體、液體或婕臨界流體。各種 流體中又有不同的物質(zhì)可選用。固定和可用液、四兩大類，令類中又有許多種 可供選擇。4、離靈敏度在線檢測(cè)與其他分喜手度相比，色譜具有高靈敏度左線檢測(cè) 的特性。有各種不同的檢測(cè)黑，適合于多種千差萬別 的樣品需要。5、快速分禽HPLC由于采用了高壓漆劑傳輸條統(tǒng)，即使采用高效 細(xì)顆拉埴料，也能保證分害過程在一定的線速下進(jìn)行, 而且由于精效

6、提高，更加快了分毒速度。6、連姨色動(dòng)化掾作電腦用于色譜分害過程以后，從錄切的簡(jiǎn)單數(shù)據(jù)處理 發(fā)裝到圖葡作為控制恭作的中心，夜大量的樣品可以 按事先設(shè)置的程序進(jìn)行完全自動(dòng)連鎮(zhèn)的標(biāo)作。二、線性色譜與非線性色譜線性和非愛性是就學(xué)帝敦的概念，表示自支 量與度變量之間的關(guān)系。在色譜學(xué)中，如果流動(dòng) 相中樣品濃及Cm與固定粕中樣品的濃度Cs之間 呈愛性關(guān)東，那么在這種情況下的色譜分酩過程 就是線性色譜，即：Cs=KCmK為分配余數(shù)。Cm流動(dòng)相中樣品的濃度。CS 固定相中樣品的濃度規(guī)律如果Cs和Cm之間不存在線性關(guān)余，而是出 現(xiàn)其他的翦教關(guān)東，那么對(duì)應(yīng)的色譜分宙過程 就稱為非線性色譜。在實(shí)踐過程中得知，當(dāng)樣品忒

7、度很低時(shí)， Cs和Cm之間往往保持愛性關(guān)系。在高濃度對(duì) Cs和Cm之間往往不出現(xiàn)戰(zhàn)性關(guān)東。非線性和線性色譜行為的根本不同表現(xiàn)在以下幾個(gè)方面1、樣品的保留值可變。2、崢形不對(duì)稱。3、色譜蜂的蜂嵩與濃度不是線性關(guān)東第二節(jié)非線性色譜理論基礎(chǔ)非線性色譜理論是研究樣品在固定相 與流動(dòng)相中的濃度處于非線性關(guān)東的狀忠 下，各種實(shí)除參數(shù)對(duì)色譜分宙過程的影響, 戲立起板參致、溶質(zhì)性質(zhì)及操作條件之間 的定量關(guān)東式。由于此時(shí)Cs與Cm不呈端性 關(guān)東，所以必須首先了解他們之間的翦數(shù) 關(guān)東，也既要研究吸附等溫線及相應(yīng)的吸 附模型。一、吸附過程及吸附等溫線，雙附指一種通常發(fā)生左兩粕界面上的現(xiàn)象：處于 界面上的分子 或原子

8、與其內(nèi)部的分子或原子具痞不 同的能量與性質(zhì)，產(chǎn)生了一種不平街的傾向，造成 界面的分子或原子數(shù)與內(nèi)部不同，這種差異就形成 了吸附現(xiàn)象。/雙附過程主要分為兩大類：化學(xué)吸附和物理吸附/化學(xué)嫉附熱大，吸附過程往往是不可逆的，而物 理吸附熱小，吸附往往是可逆的。物理吸附與化學(xué)吸附產(chǎn)生物理雙附的作用力是分子同力，即范德華力.產(chǎn)生化學(xué)吸附的作用力是化學(xué)如力.化學(xué)吸附時(shí) 可發(fā)生電子的轉(zhuǎn)移，原子的重排，化學(xué)校的斷裂與形 成等微見過程.物理吸附和化學(xué)吸附往往可以同時(shí)發(fā)生，如02 在W上的雙附.在不同的溫度下，起主導(dǎo)作用的雙附 可以發(fā)生變化.物理吸附與化學(xué)吸附的比較物理吸附化學(xué)吸附吸附力范德華力化學(xué)鍵力吸附層數(shù)單層

9、或多層單層吸附熱小，近于液化熱大，近于反應(yīng)熱選擇性 "-無或很差段強(qiáng)可逆性可逆不可逆吸附平衡易達(dá)到不易達(dá)到A吸附等溫線是指成一定溫度下物質(zhì)分子在兩相界面上叱行的吸附過程達(dá)到平衡對(duì)他們?cè)趦上嘀袧舛戎g的關(guān)系。A在HPLC領(lǐng)域內(nèi)常逐利的吸附等溫線可 分為以下幾類，即凸形、3形、S形、H 形和階梯形。吸附等溫線大致可歸納為五種類型，只有(a)符合單分子層吸附.其余皆 為多分子層吸附。PN2在活性炭上的N?在硅膠上的吸Rr,在硅膠上基在氧化鐵凝膠水氣在活性碳上的 吸附(-195P)附(-195C)的顯附(79 P)上的吸附(50。)吸附(100。(a)(b)(c)(d)(e)幾種類型的吸附等

10、溫線A凸形吸附等溫線是液固條統(tǒng)中常見的一種，通 常出現(xiàn)于大多數(shù)小分子化合物，它反映了溶質(zhì)分子在固體表面達(dá)到飽和時(shí)生成了單分子吸附層。AH形等溫線是凸形等溫線的特殊狀態(tài)，它代表了一類很叁易在固體表面吸附的物質(zhì)，而且很看易達(dá)到飽和態(tài)，這類吸附主要是一些分子量大的聚合物，如聚乙稀、聚笨乙稀等高聚物及酶、核 酸、蛋由質(zhì)、糖等生物大分子。A凹形吸附等溫線是適用于在低濃度下 已吸附 的狼吸附分子又能吸附在液相中的分子、從而 生成多分子吸附層的那些物質(zhì)。AS形等溫線實(shí)際上是凹形和臼形兩種等溫線疊 加的產(chǎn)物，它代表了故吸附的分子之間具有很 強(qiáng)的作用力，能進(jìn)一步吸附其它分子，而濠質(zhì)分子與固體表的作用力相對(duì)較弱，

11、或者與表面覆蓋率無關(guān)。吸附等溫線信息1、可以預(yù)測(cè)代表了該吸附等溫線的組分在 非線性色譜中色譜峰的形狀。2 .為非戰(zhàn)性色譜分,與先化物質(zhì)選擇聚佳 條件。3 .反映極分,物質(zhì)分子與國(guó)定相表面的作 用，從而研究分子的構(gòu)型與吸附狀忠。4 .災(zāi)立分子結(jié)構(gòu)-吸附之間的定量關(guān)東，從而由分子結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)吸附性能。吸附等溫線的測(cè)定及附等溫線的測(cè)定可以分為普態(tài)法與動(dòng)態(tài)法兩大類。1、靜香法：較簡(jiǎn)單，是一種經(jīng)典的方法，是將被 測(cè)物質(zhì)流斛在灌制中配成一定濃度的漆浪，再敵人 一定量的閡相吸附劑，等體未達(dá)到平街后，根據(jù)漳 法濃度的戒少CACJ、漳液體積CVJ和吸附劑量(G),就可以計(jì)算漳質(zhì)在吸附制上的濃度(q)q= ACXV/

12、G始制一條列漳浪濃度，可以得到一系列q值，將q 與其相平褥的：做圖，即可得到該注質(zhì)在波固系統(tǒng) 中的吸附等溫線。2、功忠法動(dòng)態(tài)法最早是用氣相色譜原理來測(cè)定氣 固或4氣液兩相中的吸附等溫線的，常用的有 4種方式：前'沿分析fFAJ ；特征點(diǎn)的沿分析CFACPJ ；特征或洗脫CECPJ ；平臺(tái)洗脫f EPJ o18-2 FA、FA(R ECP、Em定R聘溫發(fā)恥燃方法mimm透gFA福大繳小ft*FACP蝙小大可以ECP 孀.觸；一次大:-發(fā)EP福然小«可以困 S-3微坦吸附普遍絨網(wǎng)走儀流:建國(guó)1而工裁；2動(dòng)眄；3電磁網(wǎng)；4 店也空54 9 64 r5Zi A. ; *7iffi.

13、A. ; 8i®. B ;9 樣品膏 13; IO吸附柱， 11遍水咨1 12檢洪4錯(cuò); 132己裝儀、14詼:計(jì)；15 座費(fèi)曲=:=g=;= =:=0=圖8-4 前沿分析測(cè)定a-胰凝乳蛋白酶A在弱陽離子交換劑（WCX）上吸附等溫線的色譜圖,沿分析法(frontal analysis, FA)是由 James和Philips, 1964年看先提出并將其用于單組分等溫線的測(cè)定。 FA賣膾過程是左色譜樁入口處每隔一定時(shí)間連鎮(zhèn)壓 入大量濃度不斷通增的持測(cè)樣舄。在FA中，對(duì)每一 個(gè)濃度的樣品，進(jìn)樣量要足夠大，以保證其洗脫曲 端中與進(jìn)樣濃度呈愛性關(guān)系出現(xiàn)濃度平臺(tái)。由于FA 在測(cè)定單如分等溫線時(shí)

14、僅需要洗脫,沿出現(xiàn)時(shí)的保 留時(shí)間和與其濃度相對(duì)度的平臺(tái)高度，可以克服由 低濃度數(shù)據(jù)點(diǎn)產(chǎn)生的誤差所造成的摟個(gè)等溫線偏喜 的缺陷。二、非線性色譜基本理企非線性色譜理論是通過研究故分離物質(zhì)在 兩相中呈高濃度情況下的濃度變化與吸附等溫 線、傳質(zhì)速率、進(jìn)樣方式等因素的關(guān)東，建立 起定量的函數(shù)形式，從而能預(yù)測(cè)最佳分離條件, 得到滿意的分離結(jié)果。1、雙附平街想力學(xué)芻極分害的物質(zhì)在色譜條饒中達(dá)到熱力學(xué)平街時(shí)， 它在液相與固相中的濃度關(guān)系可用雙附平街方程式表4JV oKa S+A ;SAKd2、灰附平街動(dòng)力學(xué)色譜分禽過程實(shí)際上是一個(gè)由不平街列平街、周而 復(fù)始的連續(xù)過程。平街的速率由下式可以表達(dá)為：dQ_=Ka(

15、Qo-Q)-KQ第三節(jié)非線性色譜的實(shí)除方法由于非線性色譜涉及的樣品忒度大大需 于線性r分析型）色譜的，因此通常的分析 型色譜儀及其流程就不完全符合非線性色譜 的要求，某些部件必須加以改造才能滿足要 求，以便于在優(yōu)化條件下使用，而且在實(shí)驗(yàn) 方法上也需加以適當(dāng)?shù)母淖儭Ｒ?、非線性色譜中的固定相及色譜柱1、固定相在生物大分子分析型高效液相色譜中的 固定相耳骨幾乎都是用細(xì)顆粒大扎徑的填 料，但是云非說我色譜中，粗和細(xì)的可以 兩者都在使用。原則上林細(xì)顆粒埴料的柱 效要高，但價(jià)格也貴。粗顆粒填料雖粒效 低，但價(jià)格便宜，而且柱壓降低適合于大 型制備核。材料：填料的基體仍以硅膠和有機(jī)樹脂兩大類為主。 如系硅朕和

16、市機(jī)樹泰基體的理化性能（如扎隙度、顆 卷大小.比表面及鍵合的備能團(tuán)）卻一樣，鄴么他們 呈現(xiàn)的色譜性能沒有顯著的差別。亂隙度：填料亂桎大小的要求對(duì)不同生物大分子也 不一樣，例如分肉核酸要求乳桎至少在50nm以上，分 禽蛋白質(zhì)一般要求左30-100nm,而JL隨分子量不同而 異。3O5Onm可分啻30-100kD的蛋。質(zhì)，而分畜 100kD以上的妥。質(zhì) 要求我桎在80100nm。扎桎越大，比表面越小,而，埴料對(duì)樣品的負(fù)我量也彈低，而且機(jī)械強(qiáng)度也臧弱。但是由于傳質(zhì)阻 力戒少而使不同范圈的妥6質(zhì)都能得到分啻，故伎埴 料效率提高。aoaiyj-o-o人悔水甘油內(nèi)fit .甲氣基底院JflUE股ay,-o

17、<12Nib-配位體CHj),-o-aij-<ki. |i-c jiMWR1NalQ,NaBH4，串一如停I?X- 均一Kf 11 ie 位體-(CH2hC-CHjG總硅膠1 號(hào)二仙*. -o<CHJ)J-OH2NH KQ»t) »c J-O-Q-NOj - 1-O A-tCJhh-O-CCIIih-O-？-O-QNoJI 均N-耽體CJljJj-O-fCTIjhW8-5硅皎為亞體合成帶不同活性基團(tuán)中間體及配位體 的親和色諾填料的合成路規(guī)a*2>r-o-o«2-oh-o»< fflWHW、b) mS!位體jr(Uljh-OI

18、CIhhO0-2 J ,，2N-配位體分,生物大分子的主要填料1、反向填料：垸基鏈長(zhǎng)是根重要的因素。反向填料上鏈合的烷基鏈長(zhǎng)似乎與安質(zhì)的分子量也有反相的關(guān)東，即長(zhǎng)鏈垸 基填料適合于分,小肽，短健垸基適合 于分,多肽及安。質(zhì)。2.疏水作用填料：這種填料的跳水作用比反向填料弱，主要是填料表面垸基密度3、毒子交換填料：包括強(qiáng)陽禽子、弱的 書子.強(qiáng)陰甫子、弱陰因子4種填料。4、體余排斥填料:無機(jī)填料一硅膠為主O有機(jī)填料中常用Pharmacia出的球器類填料。5、親和填料：東和填料盡管選擇性好，但耒大的問題是商品種類太少，幾乎對(duì)每一種 生物大分子的分畜都需要合成該種大分子所 需要的特珠親和冢料。* 83

19、 l-HK.系列的總和及3c住Wfe-I-SK -Ocl 0 的RFG1OOOIT . 800011 G7OOOH* 法 乙體收槽 K0XK 分于 ,分布、令SEZmE分析3O2CXM)HW .03000PW CKiOOOfW 乙4 SI* 水醍岐、體風(fēng)抄尺憤AV、旁介*9K化02000SW . C3OOOSW .oooswAt 0B!卓水履般、體白分與分析VM-X»w C7M-SPW SP-5RW DEZkK 2»WDEAK-5PW曉JRk曲陽k十文0的（一COO-） 余水離分子加耐陽子文0刑（一8。- > 安承 分子餐 尸女 0刑一SO.Ot 岐！U94nH于文-

20、Z , HE” ）內(nèi)分子擊水型網(wǎng)明川人女?dāng)y刑（一 N - lil£u>土。人T 忻、分，內(nèi)化Phonyl 5PW Rtlwr 5I»W*"分2親水4分于531«水作，”0科乙二f 介的余水點(diǎn)分了 F 9 水件川0 8生物大分7r m，分析9分雨P(guān)henyl-SPW-RPOct ade<-y 1-4 PW OTJB-120A.120T A KTITVICMc V>ZA RP埃 MS反和 H 1余水 分子 0» 十八%（爾內(nèi)分于？W）士人址*皮4H1A Xt a a 怏聯(lián)應(yīng)柚0X（壽水A分子SO介子大mm白質(zhì)和覘、分子小gat白

21、W、低分子 物4r.皿、|«3«>仙分析分.Amide-MOm wr.*k .#7c，g分內(nèi) T分儕ChclMto-SHWHcfrin-SfWBls-SPWHorocu*te«SPWAlA-SPW二f 儂Cit>ncron 干 F3G-A4KMM時(shí)*中睜布qJK T1 Cuae .Nn .Z/，9fd10 的分析與分內(nèi)白質(zhì).imiw*g 分析用分內(nèi)*M白、fWMt比Kk不、干擾 分析、分*W!縝、情移 RZA、校僮、1件*、*、1L 裝分忻H分內(nèi)分*HA- KMX)Suffer XXI於3er 04y文AK（E4«0：k冼）好黑型注網(wǎng)Kr/t

22、接內(nèi)41反潛撫）恪” .«» .mKM 分析 卉，Lg的分帳KnantAoP、P，L”。徑間定M10X光，弁W體分LJEAE-ISXHRSPZPRBI9J 子交掇用K Z HK”> 實(shí)心中水*we則） 幽雨于安拽加«SO>> 實(shí)心東水*眄）U門網(wǎng)怏0分儕叼”網(wǎng)2.色譜樁及填充技術(shù)A以分禽免化為主要目的的非戰(zhàn)性色譜與 分析色譜一樣，色譜樁是極關(guān)鍵的部分。A色譜板關(guān)鍵考慮兩方面：一是色譜樁的長(zhǎng)度；二是樁的填充。色譜柱長(zhǎng)度的選擇要考慮多種因素：1、為達(dá)到一定的分啻度就要求有一個(gè)起瑪?shù)陌彘L(zhǎng)， 否則分禽的組分就達(dá)不到所需的純度。2、不同的埴充方法埴充的色譜

23、樁都有一個(gè)景長(zhǎng)的 限度，疵過了這個(gè)限度，就無法得到均勻的填充床。3、精效也不是與樁長(zhǎng)永運(yùn)呈比例增長(zhǎng)，捉過某一 長(zhǎng)度，樁效不再隨樁長(zhǎng)增加。4、高壓泵的袞量不允許使用很長(zhǎng)的色譜樁。5、在置換色譜中，趣過了素佳粒長(zhǎng)，反而會(huì)澤低 產(chǎn)率，提高成本6、粒役的選擇也4艮童要。(a)徑向壓縮(b)軸向壓縮(c)環(huán)形擠壓圖8.6制備色譜柱中各種壓縮技術(shù)示意圖(箭頭指示壓力的方向及大小)樁的埴充樁的統(tǒng)無目葡主要仍用干法和濕法兩種：1、干法標(biāo)作簡(jiǎn)單、方便，不需要特殊設(shè)備，但 精效一般較差，只遺用于直程大于30Hm的顆 尬，而且更適用于直隹較大的色譜樁。2、濕法埴充主要適用于20|iim以下的顆粒統(tǒng)料， 分恒流與恒壓埴充2種。樣品溶解與進(jìn)樣方法A用非線性色譜分害與她化生物大分子時(shí)，制備 合逡的樣品涂液是成敗的關(guān)純之一。L 蛋6質(zhì)的漆解度有限，通奉需加入其他試劑 以增加它在水中的溶解度。2、漳波的性質(zhì)於須逡應(yīng)于所用的固定相，使 大量的樣舄漆波導(dǎo)人色譜樁后不馬上步做，集 中在柱頭，以達(dá)到“塞式”進(jìn)癢目的。»適當(dāng)漆液制備后，