moflo XDP流式細(xì)胞儀基本原理以及應(yīng)用

1、細(xì)胞研究必備的儀器細(xì)胞研究必備的儀器細(xì)胞成像、定位細(xì)胞成像、定位（單個(gè)細(xì)胞（單個(gè)細(xì)胞） 細(xì)胞定量測(cè)定細(xì)胞定量測(cè)定（群體細(xì)胞特征（群體細(xì)胞特征）分析型分析型：一個(gè)細(xì)胞的身世：我是誰(shuí)：一個(gè)細(xì)胞的身世：我是誰(shuí)混雜的細(xì)胞群激光激發(fā)標(biāo)記在細(xì)胞上的熒光素Directly to waste儀器的電子系統(tǒng)收集熒光信號(hào)并處理 信號(hào)計(jì)算機(jī)工作站對(duì)信號(hào)進(jìn)行收集和統(tǒng)計(jì)流式細(xì)胞儀是通過(guò)對(duì)目標(biāo)細(xì)胞上的熒光信號(hào)進(jìn)行識(shí)別流式細(xì)胞儀是通過(guò)對(duì)目標(biāo)細(xì)胞上的熒光信號(hào)進(jìn)行識(shí)別而實(shí)現(xiàn)對(duì)細(xì)胞的定量而實(shí)現(xiàn)對(duì)細(xì)胞的定量一個(gè)細(xì)胞的命運(yùn)一個(gè)細(xì)胞的命運(yùn)混雜的細(xì)胞群身份的鑒定識(shí)別和通過(guò)的速度分選是一個(gè)復(fù)雜的過(guò)程流式細(xì)胞儀是細(xì)胞組學(xué)的定量工具流式細(xì)胞儀

2、是細(xì)胞組學(xué)的定量工具可以做以下定量： 細(xì)胞相對(duì)定量（） 細(xì)胞絕對(duì)定量（細(xì)胞/l） 細(xì)胞膜蛋白表達(dá)定量（蛋白分子/細(xì)胞）流式細(xì)胞儀的檢測(cè)范圍流式細(xì)胞儀的檢測(cè)范圍細(xì)胞結(jié)構(gòu)=細(xì)胞大小=細(xì)胞粒度=細(xì)胞表面面積=核漿比例=DNA含量與細(xì)胞周期=RNA含量=蛋白質(zhì)含量細(xì)胞功能= 細(xì)胞表面/胞漿/核的特異性抗原= 細(xì)胞活性= 細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞因子= 酶活性= 激素結(jié)合位點(diǎn)= 細(xì)胞受體流式細(xì)胞儀基本原理流式細(xì)胞儀基本原理通過(guò)激光激發(fā)高速流動(dòng)的細(xì)胞或微粒所攜帶的熒光染料或熒光素，并檢測(cè)由此產(chǎn)生各種光信號(hào)，如散射光、自發(fā)熒光、特異性熒光的強(qiáng)弱，來(lái)反映各項(xiàng)待檢測(cè)指標(biāo)。成功的流式實(shí)驗(yàn)需要三步走：下游實(shí)驗(yàn),培養(yǎng)或者其他生物手

3、段驗(yàn)證u單細(xì)胞懸液制備u樣本保存u熒光標(biāo)記u設(shè)置對(duì)照單細(xì)胞懸液制備單細(xì)胞懸液制備樣本濃度要求：建議105106/ml血樣本 樣本要求：EDTA、肝素、檸檬酸鈉抗凝全血 凝血、溶血樣本應(yīng)當(dāng)棄用 白細(xì)胞樣本白細(xì)胞樣本：需裂解去除紅細(xì)胞 裂解液的選擇：甲酸 作用強(qiáng)，適用于一般檢測(cè) 氯化銨 作用溫和，適用于低含量細(xì)胞 注意：溫度過(guò)低會(huì)影響裂解效果 紅細(xì)胞樣本紅細(xì)胞樣本：PBS或生理鹽水稀釋1000倍 血小板樣本血小板樣本：避免使用肝素抗凝血， PBS或生理鹽水稀釋20倍 培養(yǎng)細(xì)胞l一般處理：消化分散成單細(xì)胞，過(guò)300目濾網(wǎng)去除細(xì)胞團(tuán)塊l易聚集的細(xì)胞：可在緩沖液中加13%的小牛血清或BSA或0.05%E

4、DTA 單細(xì)胞懸液制備單細(xì)胞懸液制備組織細(xì)胞組織細(xì)胞 脾細(xì)胞，在緩沖液中將血洗凈，剪成數(shù)塊，直接在300目濾網(wǎng)上研碎過(guò)篩 肝、腎組織及結(jié)腸癌等富含實(shí)質(zhì)細(xì)胞的組織，于緩沖液中充分剪碎，細(xì)胞分散于緩沖液中，過(guò)100目濾網(wǎng)，再過(guò)300目濾網(wǎng) 肺、腸粘膜等結(jié)締組織較多的組織，剪碎并用胰酶、膠原酶等消化分散 骨、軟骨、心肌、骨骼肌、腦組織等，可嘗試機(jī)械剪碎及酶消化后于培養(yǎng)液中靜置貼壁分離細(xì)胞，但可用的細(xì)胞往往較少，最好進(jìn)行原代培養(yǎng) 單細(xì)胞懸液制備單細(xì)胞懸液制備外周血樣本：在不處理的情況下于4度存放35天，仍可用于大多數(shù) 表面分子標(biāo)記檢測(cè)。但做細(xì)胞絕對(duì)計(jì)數(shù)應(yīng)在24h內(nèi)檢測(cè)固定：低濃度的甲醛或多聚甲醛固定（

5、1%）可用于培養(yǎng)細(xì)胞或已 分散成單細(xì)胞的組織來(lái)源樣本的短期保存（80%），固定時(shí) 震蕩逐滴加入，避免結(jié)塊，12ml/樣本，存放于-20度（1月）注意：已標(biāo)記熒光的樣本和對(duì)細(xì)胞活力有要求的樣本應(yīng)盡快檢測(cè)， 以免熒光淬滅及細(xì)胞活力喪失樣本保存樣本保存熒光標(biāo)記熒光標(biāo)記表面抗原標(biāo)記：抗體用量106cells/test 凍干粉可以0.51ug/106cells為起始量脂溶性染料：可直接進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞內(nèi)抗原標(biāo)記及水溶性染料：需要膜通透試劑處理 膜通透試劑的選擇 甲醇：中等，可能導(dǎo)致部分蛋白變性 皂素：溫和，對(duì)細(xì)胞形態(tài)影響小 Triton-X100：強(qiáng)烈，對(duì)細(xì)胞形態(tài)影響大 商品化試劑：含有上述多種成分，不同

6、組合用途不同熒光素的選擇激發(fā)波長(zhǎng)激發(fā)波長(zhǎng)發(fā)射波長(zhǎng)發(fā)射波長(zhǎng)激光激光熒光通道熒光通道熒光素的選熒光素的選擇擇CD8-FITCCD8-PECD8-ECDCD8-PC5CD8-PerCPCD8-APCPerCP FITC APC ECD PC5 PC770,000eps for 2hrs 如何設(shè)門1.遠(yuǎn)離碎片，便于圈門 2.分群不清晰，加大電壓 軟件去除粘細(xì)胞適合所有應(yīng)用的細(xì)胞接收系統(tǒng)分選角度定位 4路分選Cyclone克隆分選裝置支持任意廠家的標(biāo)準(zhǔn) 6, 24, 96, 384, 1536 微孔板, 客戶定制的微孔板, 波片客戶任意指定矩陣的細(xì)胞芯片，并且操作簡(jiǎn)單 Summit SoftwareWi

7、ndows XP 系統(tǒng)SUMMIT軟件涵蓋所有的數(shù)據(jù)和圖形處理功能SUMMIT軟件以數(shù)據(jù)庫(kù)儲(chǔ)存為基礎(chǔ)，支持自動(dòng)補(bǔ)償，離線補(bǔ)償，多文件分析報(bào)告等最先進(jìn)流式軟件性能SUMMIT軟件完全開放安裝，可以分析所有國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)LMD/FCS數(shù)據(jù)，方便使用SUMMIT軟件界面簡(jiǎn)單，易學(xué)易用SUMMIT軟件獨(dú)有單參數(shù)圖顏色示蹤功能軟件對(duì)分選效果的影響 軟件放大功能流式細(xì)胞儀的應(yīng)用流式細(xì)胞儀的應(yīng)用支持最全面的生命科學(xué)研究?jī)?nèi)容免疫功能研究（包括淋巴細(xì)胞亞群分析、細(xì)胞絕對(duì)計(jì)數(shù)、細(xì)胞活化、細(xì)胞因子、調(diào)節(jié)性T細(xì)胞、樹突細(xì)胞、抗原特異性T細(xì)胞、Th17細(xì)胞等）腫瘤相關(guān)研究（腫瘤相關(guān)基因表達(dá)、抗腫瘤藥物作用機(jī)制及多藥耐藥等）細(xì)

8、胞周期和DNA倍體分析、細(xì)胞周期蛋白干細(xì)胞研究（干細(xì)胞的分離、鑒定、功能分析等）細(xì)胞治療藥物篩選、抗體研發(fā)，疫苗評(píng)估細(xì)胞凋亡及凋亡相關(guān)蛋白細(xì)胞增殖、轉(zhuǎn)染效率檢測(cè)磷酸化蛋白的檢測(cè)及信號(hào)傳導(dǎo)通路的研究細(xì)胞生理功能研究（死活鑒定、細(xì)胞內(nèi)pH值、細(xì)胞內(nèi)鈣流、膜電位）細(xì)胞多色分選0.0017%極低含量的肝癌細(xì)胞系HuH7干細(xì)胞分析分選。獲取數(shù)量超過(guò)1300萬(wàn)細(xì)胞，CD133陽(yáng)性細(xì)胞含量低于1/10萬(wàn)（0.0017%），總共收集到100多個(gè)細(xì)胞，直接注射裸鼠皮下進(jìn)行成瘤觀察Unpulished data shanghai極低含量的目標(biāo)細(xì)胞（十萬(wàn)分之一）需要一次性海量獲取樣本細(xì)胞才能檢測(cè)到和分選到淋巴細(xì)胞亞

9、群的分析和分選淋巴細(xì)胞亞群的分析和分選T T淋巴細(xì)胞淋巴細(xì)胞(CD3+)(CD3+)名名 稱稱功功 能能輔助性/誘導(dǎo)性T細(xì)胞(Th/Ti)輔助和誘導(dǎo)細(xì)胞免疫和體液免疫 CD3+CD4+CD29+ CD3+CD4+CD29-輔助性T細(xì)胞(Th)誘導(dǎo)性T細(xì)胞(Ti)輔助細(xì)胞免疫和體液免疫誘導(dǎo)細(xì)胞免疫和體液免疫抑制性/殺傷性T細(xì)胞(Ts/Tc)抑制免疫反應(yīng)/殺傷異源細(xì)胞 CD3+CD8+CD28- CD3+CD8+CD28+抑制性T細(xì)胞(Ts)殺傷性T細(xì)胞(Tc)抑制細(xì)胞和體液免疫細(xì)胞毒性T細(xì)胞CD3+CD4+CD8+活化的T細(xì)胞在T細(xì)胞惡性增生時(shí)升高 CD3+CD4-CD8- 有調(diào)節(jié)功能的T細(xì)胞,

10、其表達(dá) / T細(xì)胞受體(TCR / ) CD45RA+CD45RO- 幼稚的/靜止的T淋巴細(xì)胞 當(dāng)免疫系統(tǒng)沒(méi)有能力更新輔助性或抑制性/細(xì)胞毒性淋巴細(xì)胞的祖細(xì)胞時(shí)此細(xì)胞亞群較低 CD45RA-CD45RO+ 記憶性T淋巴細(xì)胞 病菌感染時(shí)升高, 但在慢性病毒感染, 如HIV患者中降低CD45RA+CD45RO+ 活化的T細(xì)胞, 感染時(shí)升高 感染時(shí)升高活化活化T淋巴細(xì)胞淋巴細(xì)胞名名 稱稱功功 能能CD3+HLA-DR+活化T細(xì)胞CD4+HLA-DR+ 活化的輔助性/誘導(dǎo)性T細(xì)胞CD8+HLA-DR+活化的抑制性/殺傷性T細(xì)胞CD4+CD25+ 活化的輔助性/誘導(dǎo)性T細(xì)胞CD8+ CD25+ CD8+

11、CD38+HLA-DR+活化的抑制性/殺傷性T細(xì)胞在病毒感染的患者中增加; 其增加意味著HIV患者的預(yù)后較差CD19+CD23+ 活化的B細(xì)胞過(guò)敏患者中升高 CD19+CD5+ 在自身免疫性疾病中升高 CD19+CD5+CD23+ 慢性B細(xì)胞白血病及單克隆B淋巴細(xì)胞 自身免疫性疾病時(shí)降低, 而病毒感染時(shí)升高 CD3+CD57+CMV(巨細(xì)胞病毒)感染的強(qiáng)烈征兆 注意事項(xiàng) 1.裂紅完全SSFS2.CD45/SS設(shè)門分選 CD44 FITC/CD133 PE細(xì)胞(腫瘤干細(xì)胞）從香港空運(yùn)到上海的手術(shù)腫瘤切塊，分離成單個(gè)細(xì)胞后進(jìn)行染色、檢測(cè)和分選MoFlo XDP，二軍大分選后的細(xì)胞皮下注射研究干細(xì)胞

12、致瘤性Sorted CD44Sorted CD133兩個(gè)月后結(jié)果：表達(dá)CD44的細(xì)胞的致瘤性強(qiáng)于表達(dá)CD133的細(xì)胞MoFlo XDP，二軍大細(xì)胞周期分析細(xì)胞周期分析 / DNA含量分含量分析析G0/G1SG2/MG0：靜止期，G1：DNA合成前期，S：DNA合成期G2：DNA合成后期，M：有絲分裂期推薦設(shè)門：注意事項(xiàng)：1.“細(xì)胞去哪里了”？2.固定必須用70%冰乙醇，固定時(shí)間2h以上3.乙醇清洗干凈，否則影響RNase的效果細(xì)細(xì)胞凋胞凋亡亡細(xì)胞形態(tài)的變化細(xì)胞質(zhì)膜內(nèi)側(cè)的磷脂酰絲氨酸外翻導(dǎo)致的細(xì)胞膜不對(duì)稱性消失線粒體膜電位的改變蛋白水解酶Caspase酶 的活化核酸內(nèi)切酶活化導(dǎo)致的DNA斷裂凋亡

13、峰的檢測(cè)ANNEXIN V/PIANNEXIN V/PI凋亡分析凋亡分析DNA鏈斷裂膜PS外翻樣本制備：樣本制備： 1、未染細(xì)胞 2、單染細(xì)胞（建立凋亡模型，必須有凋亡群體存在，用于補(bǔ)償調(diào)節(jié)） 3、實(shí)驗(yàn)樣本 注意事項(xiàng)：注意事項(xiàng)： 1.PI1.PI毒性，一小時(shí)內(nèi)測(cè)完毒性，一小時(shí)內(nèi)測(cè)完 2.2.貼壁細(xì)胞消化和吹打時(shí)混勻，注意離心力和離心時(shí)間貼壁細(xì)胞消化和吹打時(shí)混勻，注意離心力和離心時(shí)間 3.3.不能固定，要在冰上操作不能固定，要在冰上操作 4.4.假陰性假陰性：并非所有凋亡細(xì)胞都會(huì)出現(xiàn)：并非所有凋亡細(xì)胞都會(huì)出現(xiàn)PSPS外翻外翻 5.5.假陽(yáng)性假陽(yáng)性：壞死細(xì)胞含少量：壞死細(xì)胞含少量PSPS；補(bǔ)體激活

14、細(xì)胞可能發(fā)生；補(bǔ)體激活細(xì)胞可能發(fā)生PSPS外外翻；血小板存在翻；血小板存在PSPS外翻；巨噬細(xì)胞或其他細(xì)胞吞飲凋亡小體外翻；巨噬細(xì)胞或其他細(xì)胞吞飲凋亡小體時(shí)，時(shí)，Annexin VAnnexin V檢測(cè)也會(huì)陽(yáng)性檢測(cè)也會(huì)陽(yáng)性 細(xì)胞增殖的檢測(cè)與分析細(xì)胞增殖的檢測(cè)與分析-CFSE-CFSE標(biāo)記標(biāo)記 羧基熒光素乙酰乙酸羧基熒光素乙酰乙酸(CFDA-SE)自由穿透細(xì)胞膜并在細(xì)胞內(nèi)被酯酶轉(zhuǎn)化成帶自由穿透細(xì)胞膜并在細(xì)胞內(nèi)被酯酶轉(zhuǎn)化成帶負(fù)電荷的熒光物質(zhì)負(fù)電荷的熒光物質(zhì)-CFSE。CFSE不可逆地通過(guò)偶聯(lián)到細(xì)胞蛋白質(zhì)上，隨細(xì)不可逆地通過(guò)偶聯(lián)到細(xì)胞蛋白質(zhì)上，隨細(xì)胞分裂平均分配胞分裂平均分配胞內(nèi)活性氧水平的檢測(cè)與分析胞內(nèi)活性氧水平的檢測(cè)與分析-DCFH-DA -DC