干擾素制備的工藝流程ppt課件

1、精選ppt 干擾素的制備流程干擾素的制備流程 精選ppt 干擾素干擾素什么是干擾素? 概念(interferon,IFN):機體免疫細胞產(chǎn)生的一類細胞因 子,是機體受到病毒感染時,免疫細胞通過抗病毒應(yīng)答反 應(yīng)而產(chǎn)生的一組結(jié)構(gòu)類似、功能接近的生物調(diào)節(jié)蛋白。 根據(jù)分子結(jié)構(gòu)和抗原性的差異分為、等4個 類型。 干擾素又依其結(jié)構(gòu)分為1b、2a、2b等亞型 其區(qū)別在于個別氨基酸的差異上,早期干擾素是用病毒 誘導(dǎo)人白血球產(chǎn)生的,產(chǎn)量低、價格昂貴,不能滿足需要， ,現(xiàn)在可利用基因工程技術(shù)并在大腸桿菌中發(fā)酵、表達 來進行生產(chǎn)。精選ppt 基因工程菌的制備目的基因的分離 目的基因與克隆 重組導(dǎo)入大腸桿菌K12 克

2、隆載體 載體的體外重組 受體菌的培養(yǎng) 從受體菌中獲取目的基因 及篩選 重組質(zhì)粒 表達載體 導(dǎo)入大腸桿菌 受體菌的篩選（表達性、穩(wěn)定性等檢測） 工程菌 精選ppt精選ppt目的基因的分離與獲得目的基因的分離與獲得重組體引入宿主細胞重組體引入宿主細胞提取重組質(zhì)粒提取重組質(zhì)粒 質(zhì)粒質(zhì)粒DNA的純化的純化目的基因與克隆載體進行體外重組目的基因與克隆載體進行體外重組從大腸桿菌從大腸桿菌K12獲取目的基因獲取目的基因?qū)χ亟M質(zhì)粒的檢測與目的基因提取對重組質(zhì)粒的檢測與目的基因提取目的基因與表達載體的組合與導(dǎo)入目的基因與表達載體的組合與導(dǎo)入工藝流程精選ppt目的基因的分離與獲得設(shè)計合成干擾素基因的兩端引物(完全

3、的),每條引物內(nèi)或5-端最好有內(nèi)切酶酶切位點。1有藥物誘導(dǎo)細胞,如佛波酯,使細胞表達干擾素升高。2破碎細胞,提取細胞總mRNA.345用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒逆轉(zhuǎn)錄,把總mRNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA以cDNA為模板、干擾素引物為引物,PCR,得到完全的干擾素基因的PCR產(chǎn)物精選ppt 目的基因與克隆載體進行體外重組1.提取載體(質(zhì)粒、病毒等),雙酶切,再 把干擾素基因的PCR產(chǎn)物用相應(yīng)的 酶酶切,用連接酶連接2.連接完成后分離純化,測序,與原干擾 素序列比對。3.鑒定序列無誤后(無義突變也行),導(dǎo) 入受體細胞,篩選精選ppt重組體引入宿主細胞將cDNA克隆到含有四環(huán)素、氨芐青霉素抗性基因的質(zhì)粒pBR322中

4、,轉(zhuǎn)化到大腸桿菌,重組的載體 DNA 分子在一定條件下轉(zhuǎn)化入大腸桿菌,形成攜帶質(zhì)粒的菌株。精選ppt從大腸桿菌K12獲取目的基因由于質(zhì)粒重組時有3種基本方式,即:目的基因與克隆載體重組,目的基因片段與目的基因片段重組,克隆載體與克隆載體重組;另外重組過程可能會發(fā)生基因突變情況流程:步驟一:將細菌涂布到含氨芐青霉素的培養(yǎng)基上培養(yǎng),就可得到質(zhì)粒 PBR322或重組質(zhì)粒的細菌單菌落。 步驟二:步驟一獲得的每一個細菌單菌落標記為a、b、c、d等,在每一 個單菌落中挑取部分細菌轉(zhuǎn)涂到含有四環(huán)素的培養(yǎng)基上,不能生長的是絕大部分含有重組質(zhì)粒的細菌及少量可能發(fā)生突變的非重組質(zhì)粒的細菌單菌落。原因:因為PBR3

5、22含有抗四環(huán)素基因,重組質(zhì)粒中目的基因插在抗四環(huán)素基因中,使其結(jié)構(gòu)破壞,失去抗四環(huán)素作用。精選ppt。 提取重組質(zhì)粒1、對上一步獲得含目的基因的大腸桿菌在含有氯霉素的培養(yǎng)基中擴大培養(yǎng) 15h。培養(yǎng)時 間:前人實驗證實大腸桿菌K12生長前6h為遲緩期, 615. 5h為對數(shù)增時期, 15. 5 19. 5h為 穩(wěn)定期, 19. 5h后為衰亡期。氯霉素:氯霉素可抑制宿主的蛋白質(zhì)合成,結(jié)果阻止了細菌染色體的復(fù)制,然而,松弛型質(zhì)粒仍可繼續(xù)復(fù)制。2、細菌的收獲和裂解1）用合適轉(zhuǎn)頭于4以4000轉(zhuǎn)/分離心15分鐘,棄上清,敞開離心管口并倒置離心管使上清全部流盡。2）將細菌沉淀重懸于100ml用冰預(yù)冷的S

6、TE中。 STE 0.1mol/L NaCl 10mmol/L Tris.Cl(Ph8.0) 1mmol/L EDTA(Ph8.0) 按步驟1）所述方法離心，以收集細菌細胞。精選ppt3、堿裂解法1）將洗過的500ml培養(yǎng)物的細菌沉淀物來自收獲細菌的步驟3重懸于10ml(18ml)溶液中。 溶液：50mmol/L 葡萄糖 25mmol/L Tris.Cl(Ph8.0) 10mmol/L EDTA(Ph8.0) 溶液可分批配制，在10 1bf/in2(6.895x104Pa)高壓下蒸汽滅菌15分鐘， 貯存于4 。2）加1ml(2ml)新配制的溶菌酶溶液10mg/ml,溶于10mmol/L Tri

7、s.Cl(Ph8.0)。當溶液的pH值低于8.0時，溶菌酶不能有效工作。3）加20ml(40ml)新配制的溶液。 溶液：0.2molL NaOH(臨用前用10molL貯存液現(xiàn)用現(xiàn)稀釋) 1%SDS 蓋緊瓶蓋，緩緩顛倒離心瓶數(shù)次，以充分混勻內(nèi)容物。于室溫放置5-10分鐘。提取重組質(zhì)粒精選ppt提取重組質(zhì)粒4）加15ml(20ml)用冰預(yù)冷的溶液。 溶液：5mol/L 乙酸鉀60ml 冰乙酸 11.5ml 水 28.5ml 所配制的的溶液對鉀是3mol/L,對乙酸跟是5mol/L。 封住瓶口，搖動離心瓶數(shù)次以混勻內(nèi)容物，此時應(yīng)不再出現(xiàn)分明的兩個液相。置冰 上放10分鐘，應(yīng)形成一白色絮狀沉淀。于0

8、放置后所形成的沉淀應(yīng)包括染體DNA、高分子量RNA和鉀-SDS-蛋白質(zhì)-膜復(fù)合物。5）用合適轉(zhuǎn)頭于4 以4000轉(zhuǎn)/分離心15分鐘，不開剎車而使轉(zhuǎn)頭自然停轉(zhuǎn)。如果細 菌碎片貼壁不緊，可以5000轉(zhuǎn)/分再度離心20分鐘，然后盡可能將上清全部轉(zhuǎn)到另一瓶中，棄去殘留在離心管內(nèi)的粘稠狀液體。未能形成致密沉淀塊原因通常是由于溶液與細菌裂解物混合不充分。6）上清過濾至一250ml離心瓶中，加0.6體積的異丙醇，充分混勻，于室溫放置10分鐘。 精選ppt提取重組質(zhì)粒7)用合適轉(zhuǎn)頭于室溫以5000轉(zhuǎn)/分離心15分鐘，回收核酸。如于4 離心，鹽也會生成了沉淀。8)小心倒掉上清,敞開瓶口倒置離心瓶使殘余上清液流盡

9、,于室溫用70%乙醇洗滌沉積管壁。倒出乙醇，用與真空裝置相聯(lián)的巴期德吸出附于瓶壁的所有液滴，于室溫將瓶倒置在紙巾上，使最后殘余的痕量乙醇揮殆盡。9)用3mlTE(pH8.0)溶解核酸沉淀.10)純化。精選ppt（一）聚乙二醇沉淀法提取質(zhì)粒（一）聚乙二醇沉淀法提取質(zhì)粒DNA1)將核酸溶液所得轉(zhuǎn)入15mlCorex管中，再加3ml用冰預(yù)冷的5mo1/L LiCl溶液， 充分混勻，用合適轉(zhuǎn)頭于4 下以10000轉(zhuǎn)/分離心I0分鐘。LiCI可沉淀高分子RNA。2)將上清轉(zhuǎn)移到另一30mlCorex管內(nèi)，加等量的異丙醇，充分混勻，用SorvallSS34轉(zhuǎn)頭(或與其相當?shù)霓D(zhuǎn)尖)于室溫以10000轉(zhuǎn)/分離

10、心10分鐘，回收沉淀的核酸。3)小心去掉上清，敞開管口，將管倒置以使最后殘留的液滴流盡。于室溫用70%乙醇洗滌沉淀及管壁，流盡乙醇，用與真空裝置相連的巴其德吸管吸去附于管壁的所有液滴，敞開管口并將管倒置，在紙巾上放置幾分鐘，以使最后殘余的痕量乙醇蒸發(fā)殆盡。4)用500l含無DNA酶的胰RNA酶(20g/ml)的TE(pH8.0)溶解沉淀,將溶液轉(zhuǎn)到一微量離心管中，于室溫放置30分鐘。5)加500l含13%(w/v)聚乙二醇(PEG8000)的1.6mol/LNaCI，充分混合，用微量離心機于4 以12000g離心5分鐘，以回收質(zhì)粒DNA。 質(zhì)粒DNA的純化精選ppt6)吸出上清，用400l T

11、E(pH8.0)溶解質(zhì)粒DNA沉淀。用酚、酚：氯仿、氯仿各抽l次。7)將水相轉(zhuǎn)到另一微量離心管中，加100l 10mol/L乙醇銨，充分混勻，加2倍體積(約lml)乙醇，于室溫放置10分鐘，于4 以12000g離心5分鐘，以回收沉淀的質(zhì)粒DNA。8)吸去上清，加200l處于4 以12000g離心2分鐘。9)吸去上清，敞開管口，將管置于實驗桌上直到最后可見的痕量乙醇蒸發(fā)殆盡。10)用500l TE(pH8.0)溶解沉淀1:100稀釋用TE(pH8.0)后測量0D 260,計算質(zhì)粒DNA的濃度(10D260=50g質(zhì)粒DNA/ml),然后將DNA貯于一20 質(zhì)粒DNA的純化精選ppt對重組質(zhì)粒的檢

12、測與目的基因提取目的基因獲取目的基因獲取對獲得的質(zhì)粒進行雙酶切，獲得目的基因與PBR322質(zhì)粒片段，通過瓊脂糖凝膠電泳，由于目的基因與PBR322質(zhì)粒片段相對分子量不同，在電泳過程中產(chǎn)生不同的條帶，通過與已知基因長度的對比，我們可以選出相應(yīng)的目的基因，接著利用Qiagen純化柱回收純化DNA。具體：用3倍體積的特殊高鹽溶液于55 融化帶有目的基因的DNA片段的瓊脂糖凝膠塊，將DNA釋放到水溶液中。然后將其通過Qiagen純化柱，經(jīng)過”結(jié)合一洗滌一洗脫”步驟，直接得到純化的DNA樣品。利用核酸探針雜交法鑒定目的基因精選ppt目的基因與表達載體的組合與導(dǎo)入表達載體：PBV220，將PBV220和目

13、的基因用雙酶切法處理，退火后連接，構(gòu)建重組質(zhì)粒，利用CaCl2法導(dǎo)入到宿主大腸桿菌中，構(gòu)建工程菌，在培養(yǎng)基中培養(yǎng)，利用干擾素性質(zhì)鑒定目的工程菌，分離工程菌，擴大培養(yǎng)，提取出質(zhì)粒，分析質(zhì)粒穩(wěn)定性。精選ppt干擾素的發(fā)酵工藝過程 啟開種子 制備種子液 發(fā)酵培養(yǎng) 粗提 精提 半成品制備 半成品鑒定 分裝 凍干 成品檢定 成品包裝精選pptl.菌種制備菌種制備 取一70下保存的甘油管菌種(工作種子批),于室溫下融化,然后，接入搖瓶,培養(yǎng)溫度30,pH7.0，250r/min活化培養(yǎng)182小時后,進行吸光值測定和發(fā)酵液雜菌檢查。2.種子罐培養(yǎng)種子罐培養(yǎng) 將已活化的菌種接入裝有30L培養(yǎng)基的種子罐中，接種

14、量10%,培養(yǎng)溫度30 ，pH7.0，級聯(lián)調(diào)節(jié)通氣量和攪拌轉(zhuǎn)速，控制溶解氧為30%，培養(yǎng)3-4小時，轉(zhuǎn)入發(fā)酵罐中，同時取樣發(fā)酵液進行顯微鏡檢查和LB培養(yǎng)基劃線檢查，控制雜菌。3.發(fā)酵罐培養(yǎng)發(fā)酵罐培養(yǎng) 將種子液通入300L培養(yǎng)基的發(fā)酵罐中，接種量10%,培養(yǎng)溫度30,pH7.0。級聯(lián)調(diào)節(jié)通氣量和攪拌轉(zhuǎn)速，控制溶解氧30%,培養(yǎng)4小時。然后控制培養(yǎng)溫度20 ，pH6.0,溶解氧60%,繼續(xù)培養(yǎng)5-6.5小吋。同時進行發(fā)酵液雜菌檢查，當0D值達9.01.0后，用5冷卻水快速降溫至15以下，以減緩細胞衰老?；蛘邔l(fā)酵液轉(zhuǎn)入收集罐中，加入冰塊使溫度迅速降至10以下。4.菌體收集菌體收集 將已降溫的發(fā)酵液

15、轉(zhuǎn)入連續(xù)流離心機，16000r/min離心收集。進行干擾素含量、菌體蛋白含量、菌體干燥失重、質(zhì)粒結(jié)構(gòu)一致性、質(zhì)粒穩(wěn)定性等項目的檢測。菌體于一20 冰柜中保存時，不得超過12個月。每保存3個月，檢查一次活性。精選ppt干擾素發(fā)酵過程控制在假單孢桿菌的發(fā)酵生產(chǎn)中，菌體在培養(yǎng)1.5小時分裂速度最快，到3.5小時開始下降。而干擾素的迅速合成出現(xiàn)在3.5小時之后，在4小時達到最大，然后由于降解而迅速下降。可見在發(fā)酵生產(chǎn)工藝中，假單孢桿菌的生長和干擾素的生產(chǎn)基本處于不相關(guān)狀態(tài)，可采用兩段培養(yǎng)的策略進行過程控制。精選ppt(l)溶解氧控制溶解氧控制 分別在生長階段和生產(chǎn)階段采用各自最佳溶解氧濃度，以期提高干

16、擾素的發(fā)酵水平。通過級聯(lián)調(diào)節(jié)通氣量和攪拌轉(zhuǎn)速得以實現(xiàn)。(2).溫度控制溫度控制 假單孢桿菌生長最適溫度與產(chǎn)物形成最適溫度是不同的。產(chǎn)物合成溫度控制在20可以有效防止干擾素- 2b的降解，而其最佳生長溫度則為30。質(zhì)粒的穩(wěn)定性隨溫度的升高而迅速下降，因此在培養(yǎng)后期降溫可以減少目標產(chǎn)物的降解，增加質(zhì)粒的穩(wěn)定性。(3).pH值值 發(fā)酵過程中，pH的變化由工程菌的代謝、培養(yǎng)基的組成和發(fā)酵條件所決定。干擾素- 的等電點在pH6.0附近，在低酸性條件下穩(wěn)定，能耐受pH2.5的酸性環(huán)境。因此可在發(fā)酵后期降低pH,從而造成大量蛋白酶失活減少干擾素-的水解，提高干擾素的積累量。精選ppt半成品檢定(l)效價測定

17、效價測定用細胞病變抑制法，以Wish細胞VSV病毒為基本檢測系統(tǒng)，測定中必須用國家或國際參考品校準為國際單位。(2)蛋白質(zhì)含量測定蛋白質(zhì)含量測定福林-酚法，以中國藥品生物制品檢定所提供的標準蛋白為標準。(3)比活性比活性效價的國際單位與蛋白質(zhì)含量的毫克數(shù)之比。(4)純度純度電泳純度用非還原型SDS-PAGE法，銀染顯色應(yīng)為單一區(qū)帶，經(jīng)掃描儀測定純度應(yīng)在95%以上。(5)相對分子量測定相對分子量測定還原型SDS-PAGE,加樣量不低于微克，同時用已知相對分子量的蛋白標準系列做對照，以遷移率為橫坐標，相對分子量的對數(shù)為縱坐標作圖，計算相對分子量。與理論值比較，誤差不得高于10%。精選ppt(6)殘

18、余外源性殘余外源性DNA含量測定含量測定用放射性核素或生物素探針法測定，每劑量中殘余外源性DNA應(yīng)低于100pg.(7)殘余血清殘余血清lgG含量測定含量測定在應(yīng)用抗體親和層析法作為純化方法吋必須進行此項檢定。(8)殘余抗生素活性測定殘余抗生素活性測定半成品中不應(yīng)有抗生素活性存在。(9)紫外光譜掃描紫外光譜掃描檢查半成品的光譜吸收值，最大吸收值應(yīng)在2802納米。(10)肽圖測定肽圖測定用CNBr裂解法，測定結(jié)果應(yīng)符合干擾素的結(jié)構(gòu)，且批與批之間應(yīng)一致。(11)等電點測定等電點測定 等電聚焦電泳。(12)除菌半成品應(yīng)做干擾素效價測定、無菌試驗和熱源質(zhì)試驗除菌半成品應(yīng)做干擾素效價測定、無菌試驗和熱源

19、質(zhì)試驗.精選ppt成品檢定(1)物理性狀物理性狀 凍干品白色或微黃色疏松體，加入注射水后不得含有肉眼 可見不溶物。(2)鑒別試驗鑒別試驗 應(yīng)用ELISA或中和試驗檢定。(3)水分測定水分測定 用卡氏法，應(yīng)低于3%。(4)無菌試驗無菌試驗 同半成品。(5)熱原質(zhì)試驗熱原質(zhì)試驗 同半成品檢定。(6)干擾素效價測定干擾素效價測定 同半成品檢定，效價不應(yīng)低于標示量。(7)安全試驗安全試驗體重為350-400克豚鼠3只，每只腹側(cè)皮下注射量為成人每千克體重臨床使用最大量的3倍，觀察7天，若豚鼠局部無紅腫、壞死、總體重不下降，說明成品合格。取體重18-20克小鼠5只，每只尾靜脈注劑量按人每千克臨床使用最大量的3倍，觀察7天，若動物全部存活，說明成品合格。精選ppt問題討論1.目的基因的獲取為什么用目的基因的獲取為什么用mRNA而不是而不是DNA?基因組，即某種生物一個細胞內(nèi)全部的DNA信息。將這些DNA打斷,連接到載體上并轉(zhuǎn)入微生物,使這些微生物細胞內(nèi)含有某生物的全部基因組。那么這些微生物就組成了基因組文庫。以上兩者包含的都是遺傳信息，對于某種生物來說，任何一個細胞的遺傳信息都是相同的。