單克隆抗體的制備ppt

1、抗體制備 多克隆抗制備 單克隆抗制備動(dòng)物產(chǎn)生抗體的機(jī)理 抗原（非自己的物質(zhì)）免疫動(dòng)物 激活免疫B細(xì)胞 轉(zhuǎn)化成漿細(xì)胞 分泌特異性的抗體單克隆抗體制備原理 -單克隆抗體雜交瘤技術(shù)基本流程 單克隆抗體的制備步驟 1.免疫原的制備 ： 完全抗原：病毒、細(xì)菌、真菌等微生物和蛋白質(zhì)等分子量大于5000Da生物物質(zhì) 半抗原：多糖、藥物、激素、肽類等分子量小于5000 Da 物質(zhì) 半抗原需與BSA、OA等載體交聯(lián)后成完全抗原才能刺激動(dòng)物產(chǎn)生可應(yīng)用的高效價(jià)的抗體2.免疫動(dòng)物 選擇體重1820g BALB/C 雌性小鼠，用制備抗原免疫。50100ug抗原/只與等體積福氏完全佐劑混合，充分乳化后，經(jīng)背腹部皮下多點(diǎn)注

2、射0.5ml每只，間隔3周，取與一免等量抗原和等體積的福氏不完全佐劑充分乳化后，第二次皮下多點(diǎn)注射0.5ml每只，過3周后用加倍劑量的抗原進(jìn)行腹腔注射，3天后取脾細(xì)胞進(jìn)行融合。 一只兔子每次的免疫劑量：細(xì)胞抗原不低于1x107 ；可溶性抗原100ug1mg；合成抗原為2mg（半抗原約為20200ug），選用皮內(nèi)、皮下、肌肉、靜脈、或淋巴結(jié)內(nèi)途徑進(jìn)行免疫，一般抗原免疫34次，合成抗原免疫6次以上，兩次免疫間隔時(shí)間3周3.細(xì)胞融合 取上述免疫小鼠脾細(xì)胞與小鼠骨髓瘤細(xì)胞（SP2/0）按5-10：1的比例，在無血清的RPMI-1640培養(yǎng)基中混勻，1500rpm離心5min，去除培養(yǎng)基，用50% PE

3、G（Sigma）作為融合劑，在37下水浴下加入0.5-0.7ml，使其融合2min，用無血清的RPMI-1640培養(yǎng)基終止融合后1500rpm離心5min，沉淀用HAT培養(yǎng)基懸浮，分裝到96孔含有飼養(yǎng)細(xì)胞的細(xì)胞板中，37，5%CO2的細(xì)胞培養(yǎng)器皿中培養(yǎng)。4.雜交瘤細(xì)胞及陽(yáng)性孔的篩選 細(xì)胞培養(yǎng)器皿中培養(yǎng)5天后，用HAT培養(yǎng)基換液一次，第10天用HT培養(yǎng)基換液，等到融合細(xì)胞覆蓋孔底10%-50%時(shí)，常規(guī)間接ELISA方法篩選陽(yáng)性孔，共獲50多個(gè)對(duì)上述抗原有反應(yīng)的陽(yáng)性孔。 5.陽(yáng)性孔的特異性檢測(cè)及特異性陽(yáng)性孔的克隆 陽(yáng)性孔的特異性鑒定采用間接ELISA方法，用包被液稀釋成110ug/mL的抗原100

4、ul/孔包被ELISA板，4過夜，使其吸附于聚苯乙烯板孔；PBST洗滌三次后用110的脫脂奶粉或13 BSA或36牛血清封閉30-60min;加入陽(yáng)性孔培養(yǎng)上清100ul/孔，37 12 小時(shí)；PBST洗滌三次后加入按說明書稀釋10000倍的辣根過氧化物酶標(biāo)記兔抗鼠IgG二抗（Sigma公司）100ul/孔，37 12小時(shí)，PBST洗滌四次后，用OPD-H2O2底物顯色，2mol/L H2SO4終止反應(yīng)后，用酶標(biāo)儀讀取OD492的值，以與陰性O(shè)D值比值大于2.1為陽(yáng)性。獲分別對(duì)上述抗原有特異性反應(yīng)的陽(yáng)性孔。篩選出的特異性陽(yáng)性孔用常規(guī)的有限稀釋法克隆，獲對(duì)上述抗原有特異性反應(yīng)的雜交瘤細(xì)胞株。細(xì)胞

5、株進(jìn)一步擴(kuò)大培養(yǎng)，用于制備單抗腹水和液氮凍存。陽(yáng)性孔的檢測(cè)雜交瘤細(xì)胞的凍存雜交瘤細(xì)胞的凍存 雜交瘤細(xì)胞通常用含有8-10%的二甲亞砜和20小牛血清的培養(yǎng)基凍存于液氮中，在液氮中細(xì)胞可以保存多年，在-80中可以作3-6個(gè)月短期保存。凍存細(xì)胞需要緩慢降溫，復(fù)蘇細(xì)胞時(shí)需快速升溫，這樣可以確保細(xì)胞有較高的存活率。6.單克隆抗體腹水制備及純化 取8周齡左右BALB/C小鼠，腹腔注射0.3-0.5ml降植烷（Sigma），7-10天后腹腔注入5-10105個(gè)雜交瘤細(xì)胞，注射后7-10天可見小鼠腹部明顯膨大，采取腹水，2000rpm離心3min，收集上清液，即為單克隆抗體腹水。取1倍體積腹水加2倍體積0.0

6、6M PH4.8醋酸緩沖液稀釋，加辛酸（30ul/ml腹水），室溫下邊加邊攪拌，4澄清1小時(shí)，12000rpm離心20min，收集上清，再用50%飽和硫酸銨沉淀免疫球蛋白，4放置2小時(shí)，3000rpm離心20min，沉淀用2倍體積的PBS溶液溶解，在4流動(dòng)透析24小時(shí)后即獲純化的腹水抗體，-70保存。7.單克隆抗體的亞類鑒定和腹水效價(jià)測(cè)定 將單抗腹水與Sigma公司的標(biāo)準(zhǔn)抗BALB/C 小鼠IgA, IgG1,IgG2a, IgG2b、IgG3,IgM抗體，作雙向瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)。 ELISA方法 用常規(guī)間接ELISA方法檢測(cè)單抗腹水效價(jià)，腹水效價(jià)在105107之間的可用于實(shí)際應(yīng)用。單克隆抗體和多

7、克隆抗體的比較比較項(xiàng)目多克隆抗體（PcAb）單克隆抗體（MAb）免疫原要求免疫原純度高，抗體純度才能高不純的免疫原可以獲得高純度抗體抗體產(chǎn)生細(xì)胞多克隆性單克隆性均質(zhì)性高度異質(zhì)高度純質(zhì)特異性較高，與抗原上多種決定簇結(jié)合高，與抗原上特定決定簇結(jié)合穩(wěn)定性較好相對(duì)較差，對(duì)理化條件敏感標(biāo)準(zhǔn)化較難，不同批次的抗體質(zhì)量差異大易于標(biāo)準(zhǔn)化，批次間差異小交叉反應(yīng)很常見，難避免非特異性反應(yīng)不常見，可避免非特異反應(yīng)沉淀反應(yīng)有多數(shù)沒有實(shí)用的血清學(xué)試驗(yàn)大多數(shù)血清學(xué)試驗(yàn)一種或多種，需適當(dāng)選擇供應(yīng)量有限無限有效抗體含量0.1-0.2 mg/ml小鼠腹水2.0-30 mg/ml無效Ig含量10.0-15.0 mg/ml體外培養(yǎng)

8、一般沒有，小鼠腹水0.5-5.0 mg/ml其它血清蛋白存在體外培養(yǎng)可能有少量小牛血清蛋白，小鼠腹水有少量雜蛋白免疫技術(shù) 原理：抗體與抗原表位的特異性結(jié)合反原理：抗體與抗原表位的特異性結(jié)合反應(yīng)，并利用酶與底物的顯色反應(yīng)、金顆應(yīng)，并利用酶與底物的顯色反應(yīng)、金顆粒、同位素、熒光素來間接顯示粒、同位素、熒光素來間接顯示常見的幾種免疫技術(shù) 酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定法（酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定法（Enzyme linked immunosorbent assay, ELISA） 1971年Engvall和Perlman 第一次建立了 ELISA檢測(cè)方法，使對(duì)抗原和抗體的檢測(cè)和定量可以通過簡(jiǎn)單的顏色反應(yīng)實(shí)現(xiàn)（Engval

9、l & Perlman，1971），是目前檢測(cè)中應(yīng)用得最多的方法，它把抗原、抗體的免疫反應(yīng)和酶的高效催化反應(yīng)有機(jī)地結(jié)合在一起。與其他血清學(xué)方法相比，該方法具有靈敏度高（1-20 ng）、操作簡(jiǎn)單、特異性好、安全并可同時(shí)檢測(cè)大批量樣品的優(yōu)勢(shì)。 自從ELISA方法建立之后，在應(yīng)用于植物病毒的檢測(cè)過程中又有了很多的改進(jìn)。介紹常用的幾種ELISA方法。 常用的幾種ELISA方法 1）直接ELISA：待測(cè)抗原直接包被塑料微量滴定板，然后加入抗原特異性的酶-特異性抗體偶聯(lián)物。因?yàn)樗玫拿敢呀?jīng)標(biāo)記在特定的抗體上，可檢測(cè)的病毒種類只能局限于某一種。2）間接ELISA：待測(cè)抗原直接包被微量滴定板，然后加

10、入特異性抗體，再加入酶標(biāo)抗體。與直接ELISA相比，間接ELISA適用的范圍更為廣泛，并且特異性也較好。3）夾心ELISA：使用俘獲抗體（包括單抗和多抗）包被微量滴定板，其余步驟同間接ELISA。根據(jù)包被抗體種類的不同，又可以分為同種單抗夾心ELISA，異種單抗夾心ELISA，多種單抗混合夾心ELISA和多抗夾心ELISA等幾種方法。與間接ELISA相比，夾心ELISA多了一步以抗體俘獲富集抗原的過程，因而其靈敏度和特異性也相應(yīng)提高。但是對(duì)有些病毒的株系，夾心ELISA并不是很好的選擇。這可能與單克隆抗體識(shí)別的是蛋白亞基的抗原表位還是病毒粒子表面的抗原表位有關(guān)。 免疫印跡檢測(cè)（免疫印跡檢測(cè)（I

11、mmunoblotting assays） 利用蛋白與硝酸纖維素膜或尼龍膜有很強(qiáng)的結(jié)合能力的特點(diǎn)，將經(jīng)過電泳分離的蛋白從膠上轉(zhuǎn)移到膜上或者直接將蛋白點(diǎn)到膜上，經(jīng)過類似ELISA的反應(yīng)，蛋白會(huì)被特異的抗體檢測(cè)。主要可以分為以下幾種方法： 1）Western印跡（Western blot）：Western blot是基于電泳和血清學(xué)的技術(shù)，將電泳分離蛋白的能力和血清學(xué)反應(yīng)的特異性結(jié)合起來，能夠檢測(cè)含量極少的蛋白。因此檢測(cè)的靈敏度極高。 2）斑點(diǎn)免疫印跡（Dot-blot immunoassay, DBIA）：在DBIA中將樣品懸浮液（1-5 l）點(diǎn)到硝酸纖維素膜或尼龍膜上晾干。其余步驟同Weste

12、rn blot。在檢測(cè)少量樣品時(shí)比ELISA具有優(yōu)勢(shì)：所需試劑少，不需特別的儀器，省時(shí)，具有與ELISA相同的靈敏度。 3）組織免疫印跡（Tissue-blot immunoassay, TBIA）：TBIA是檢測(cè)感病植物的更為簡(jiǎn)單的方法。直接將新鮮樣品的切割面印記到硝酸纖維素膜或尼龍膜上后按照DBIA的程序進(jìn)行，可靠性和靈敏度與DBIA和ELISA相似。特別適合檢測(cè)大量樣品。Western blot 實(shí)驗(yàn)步驟 1. SDS-PAGE 蛋白電泳 2. 轉(zhuǎn)膜 3. 封閉 4. 一抗反應(yīng) 5. 洗膜 6. 二抗反應(yīng) 7. 洗膜 8. 底物現(xiàn)色 9. 中止反應(yīng)免疫膠體金技術(shù)（免疫膠體金技術(shù)（immu

13、no-colloidal gold technology） 膠體金顆粒以靜電、非共價(jià)鍵方式吸附抗體分子，而形成穩(wěn)定的IgG-膠體金復(fù)合物。通過抗原抗體特異性結(jié)合，抗體膠體金復(fù)合物就可以結(jié)合在抗原上。通過光學(xué)顯微鏡、透射電鏡確定病毒的復(fù)制部位或病毒產(chǎn)物的存在部位，亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)的定位。也有將免疫斑點(diǎn)檢測(cè)中的酶標(biāo)抗體換成膠體金標(biāo)記抗體，因不需要酶促反應(yīng)的底物，所以進(jìn)一步縮短了反應(yīng)的時(shí)間。 免疫捕獲反轉(zhuǎn)錄免疫捕獲反轉(zhuǎn)錄PCR （Immunocapture reverse transcript PCR, IC-RT-PCR） 當(dāng)PCR技術(shù)在生物學(xué)領(lǐng)域迅速發(fā)展起來之后，也被用于植物病毒的檢測(cè)，但是大多數(shù)植物病毒為RNA病毒，要進(jìn)行檢測(cè)和鑒定還需要抽提RNA和反轉(zhuǎn)錄合成cDNA的過程，而1990年Jansen等（1990）建立了IC-RT-PCR檢測(cè)方法，它將免疫學(xué)檢測(cè)技術(shù)和分子生物學(xué)檢測(cè)技術(shù)有機(jī)的結(jié)合起來，并且用于多種植物病毒的檢測(cè)（Pasquini et al., 1998; Hema et al., 2003）。與單純的PCR檢測(cè)相比，它能提高檢測(cè)的特異性，減小污染的可能，而且省卻了提取RNA的步驟，降低