增強免疫力功能評價方法及修訂說明

1、附件1:增強免疫力功能評價方法征求意見稿保健食品評價試驗工程、試驗原那么及結果判定Items, Principles and Result Assessment1試驗工程動物實驗1.1.1 體重1.1.2 臟器/體重比值測定：胸腺/體重比值,脾臟/體重比值1.1.3 細胞免疫功能測定：小鼠脾淋巴細胞轉(zhuǎn)化實驗,遲發(fā)型變態(tài)反響實驗1.1.4 體液免疫功能測定：抗體生成細胞檢測,血清溶血素測定1.1.5 單核一巨噬細胞功能測定：小鼠碳廓清實驗,小鼠腹腔巨噬細胞吞噬熒光微球?qū)嶒?.1.6 NK細胞活性測定2試驗原那么所列的指標均為必做工程分為正常動物實驗方案和免疫功能低下模型動物實驗兩種方案,可任選其

2、一進行實驗.采用免疫功能低下動物模型實驗方案時需做外周血白細胞總數(shù)測定3結果判定采用正常動物實驗,受試樣品具有增強免疫力作用.在細胞免疫功能、體液免疫功能、單核-巨噬細胞功能及NK細胞活性四個方面測定中,任兩個方面試驗結果為陽性,可以判定該受試樣品具有增強免疫力 作用.其中細胞免疫功能測定工程中兩個實驗的結果均為陽性, 判定細胞免疫功能 試驗結果陽性.體液免疫功能測定工程中兩個實驗的結果均為陽性, 判定體液免 疫功能試驗結果陽性.單核一巨噬細胞功能測定工程中兩個實驗的結果均為陽性,判定單核一巨噬細胞功能試驗結果陽性.NK細胞活性測定實驗的一個以上劑量結果陽性,判定NK細胞活性結果陽性.正常動物

3、實驗需進行四個方面的測定.采用免疫功能低下動物實驗,受試樣品對免疫功能低下者具有增強免疫力作用.在免疫功能低下模型成立條件下,血液白細胞總數(shù)、細胞免疫功能、體液免 疫功能、單核-巨噬細胞功能及 NK細胞活性五個方面測定中,任兩個方面試驗 結果為陽性,判定該受試樣品對免疫功能低下者具有增強免疫力作用.其中細胞免疫功能測定工程中兩個實驗的結果均為陽性,或任一個實驗的兩個劑量組結果陽性,可判定細胞免疫功能試驗結果陽性. 體液免疫功能測定工程 中兩個實驗的結果均為陽性,或任一個實驗的兩個劑量組結果陽性,可判定體液 免疫功能試驗結果陽性.單核一巨噬細胞功能測定工程中兩個實驗的結果均為陽 性,或任一個實驗

4、的兩個劑量組結果陽性,可判定單核一巨噬細胞功能試驗結果 陽性.NK細胞活性測定實驗的一個以上劑量結果陽性,可以判定 NK細胞活性結 果陽性.血液白細胞總數(shù)測定的二個以上劑量結果陽性, 可以判定血液白細胞總 數(shù)結果陽性.免疫功能低下模型動物實驗至少需進行三個方面的測定.同時在各項實驗 中,任何一項測試都不出現(xiàn)加重免疫抑制劑作用的結果.增強免疫力功能檢驗方法Method for the Assessment of Enhancing Immune Function1 .原理：免疫系統(tǒng)主要包括中央和外周淋巴器官、淋巴組織和全身各處的淋巴細 胞、抗原呈遞細胞等,還包括血液中的白細胞.淋巴細胞經(jīng)血液和淋

5、巴使各 處的淋巴器官和淋巴組織連成一個功能整體.胸腺屬中央淋巴器官,主要功能 是保證T淋巴細胞的產(chǎn)生和成熟.外周淋巴器官包括血液、淋巴管和免疫活性細 胞；脾臟對抗原發(fā)生免疫應答作用,脾竇的巨噬細胞具有去除功能,脾白髓含有 記憶B細胞,產(chǎn)生對T依賴抗原的體液免疫應答.淋巴細胞是特異性免疫應答的 主要細胞群,按其外表標志物,分為 T細胞、B細胞和天然殺傷細胞NK三大 類,T細胞又分為CD4 Th細胞和CD8T淋巴細胞.B淋巴細胞轉(zhuǎn)化為漿細胞后 能合成和釋放抗原特異抗體,所有抗體都是免疫球蛋白,但并非所有的免疫球蛋 白分子都具有抗體功能.免疫系統(tǒng)可產(chǎn)生特異性免疫和非特異性免疫功能,檢測 上述免疫系統(tǒng)

6、的各種代表性指標的改變可對增強免疫力作用的功能做出相應判 定.2 .實驗動物選擇推薦用近交系小鼠,如 C57BL/6J、BALB/C等,68周齡,1822g BALB/C 種可16-18g,單一性別,雌雄均可,每組 1015只.3 .劑量分組及受試樣品給予時間實驗設三個劑量組和1個陰性對照組.以人體推薦量的10倍為其中一個劑 量,另設二個劑量組.必要時設陽性對照組.選做免疫低下模型法時,應設模型 對照組.受試樣品給予時間四周或 30天.4 .免疫功能低下動物模型可選用環(huán)磷酰胺、氫化可的松或其他適宜的免疫抑制劑進行藥物造模.造模原理：4.1.1 環(huán)磷酰胺主要通過DNA烷基化破壞DNA的合成而非特

7、異性地殺傷淋巴細 胞,并可抑制淋巴細胞轉(zhuǎn)化；環(huán)磷酰胺對B細胞的抑制比T細胞強,一般對體液 免疫有很強的抑制作用,對NK細胞的抑制作用較弱.4.1.2 氫化可的松主要通過與相應受體結合成復合物后進入細胞核,阻礙NF-kB進入細胞核,抑制細胞因子與炎癥介質(zhì)的合成和釋放, 到達免疫抑制目的.氫化 可的松還可損傷漿細胞,抑制巨噬細胞對抗原的吞噬、處理、和呈遞作用,所以 氫化可的松對細胞免疫、體液免疫和巨噬細胞的吞噬、NK作用都有一定的抑制作用.免疫抑制劑劑量選擇環(huán)磷酰胺可選擇40mkg,腹腔注射,連續(xù)兩天,末次注射給藥后第 5天 測定各項指標；氫化可的松可選擇 40mkg,肌內(nèi)注射,隔天一次,共 5次

8、, 末次注射給藥后次日測定各項指標.各指標對兩種模型敏感性不同,環(huán)磷酰胺模型比擬適合抗體生成細胞檢測、 血清溶血素測定、白細胞總數(shù)測定；氫化可的松模型比擬適合遲發(fā)型變態(tài)反響、 碳廓清實驗、腹腔巨噬細胞吞噬熒光微球?qū)嶒?、NK細胞活性測定,建議根據(jù)不同的免疫功能指標選擇適宜的模型.受試物給予連續(xù)給予受試物4周或30天,在第3周后開始給予免疫抑制劑,進行模型 與預防性給藥相結合的實驗.5.實驗方法血液白細胞數(shù)測定 小鼠外周血白細胞總數(shù)和淋巴細胞數(shù)檢測方法 儀器法 全血用EDTA a抗凝后經(jīng)血細胞分析儀檢測,可測定白細胞數(shù)量,并可對 白細胞進行分分類計數(shù).5.1.1 儀器和材料乙二胺四乙酸二鉀(EDT

9、A & 2HQ),離心管,全血細胞分析儀上樣管, 眼科銀子,振蕩器,加樣槍,冷凍離心機,全血細胞分析儀.5.1.2 實驗步驟5.1.2.1 試劑配制血液抗凝：EDTA &能與血液中的鈣離子結合成為螯合物,從而阻止血液凝 固,的EDTA &可阻止1ml血液凝固.抗凝劑配制：稱量8mgEDTA K2加純潔水至100ml制成抗凝劑,50屋抗凝 劑可抗凝1ml小鼠全血.5.1.2.2 采血以摘除小鼠眼球的方法采集全血,采用干凈無菌的眼科銀子摘取小鼠一側(cè)或 雙側(cè)眼球,讓血液自由滴入裝有抗凝劑的離心管(或商品化的抗凝管)中,采血 過程中不斷混勻血液與抗凝劑預防血液凝固,每只動物采集

10、抗凝全血約1ml.5.1.2.3 檢測分析上機前血液顛倒混勻,注意檢查是否存在凝塊.在24h內(nèi)以全血細胞分析儀 檢測白細胞總數(shù)和淋巴細胞數(shù).上機操作參照儀器說明書.5.1.3 數(shù)據(jù)分析一般采用方差分析,按方差分析的程序先進行方差齊性檢驗, 方差齊,計算 F值,p>,結論：各組均數(shù)間差異無顯著性意義；F值>,P<,用多個實驗組和一個對照組間均數(shù)的兩兩比擬方法進行統(tǒng)計；對非正態(tài)或方差不齊的數(shù)據(jù)進行 適當?shù)淖兞哭D(zhuǎn)換,待滿足正態(tài)或方差齊性要求后,用轉(zhuǎn)換后的數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計；假設 變量轉(zhuǎn)換后仍未到達正態(tài)或方差齊的目的,改用秩和檢驗進行統(tǒng)計.受試樣品組的白細胞總數(shù)顯著高于陰性對照組,可判定該

11、項實驗結果陽性.ConA誘導的小鼠脾淋巴細胞轉(zhuǎn)化實驗可任選以下方法之一5.2.1 MTT 法5.2.1.1 原理當T淋巴細胞受ConA®激后發(fā)生母細胞增殖反響,活細胞特別是增殖細胞 通過線粒體水解酶將MTT 一種淡黃色的唾氮鹽分解為蘭紫色結晶而顯色,其 光密度值能反映細胞的增殖情況.5.2.1.2 儀器和材料RPMI1640 細胞培養(yǎng)液、小牛血清、2-琉基乙醇2-ME、青霉素、鏈霉素、 刀豆蛋白A ConA、鹽酸、異丙醇、MTT Hank's液、PBSg沖液紗布、200目篩網(wǎng)、24孔培養(yǎng)板,96孔培養(yǎng)板平底,手術器械、大號注 射器內(nèi)芯、二氧化碳培養(yǎng)箱、酶標儀、分光光度計、超凈

12、工作臺、高壓滅菌器、 無菌濾器.5.2.1.3 實驗步驟5.2.1.3.1 試劑配制完全培養(yǎng)液RPMI1640培養(yǎng)液過濾除菌,用前參加10%小牛血清,1 %谷 氨酰胺200mmol/L,青霉素100U/mL,鏈霉素100ug/L及 5X10 5mol/L 的2-琉基乙醇,用無菌的1mol/L的HCl或1mol/L的NaOHS pH至,即完全培 養(yǎng)液.ConA液 用雙蒸水配制成100ug/mL的溶液,過濾除菌,在低溫冰箱-20C 保存.無菌Hank's液 用前以的無菌NaHCOtl.MTTW 將5mgMT落于1mL的PBS中,現(xiàn)配現(xiàn)用.酸性異丙醇溶液96mL異丙醇中參加4mL 1mol/

13、L的HCl,臨用前配制.5.2.1.3.2 脾細胞懸液制備無菌取脾,置于盛有適量3-5ml無菌Hank's液平皿中,并在脾上面放置 一塊紗布,用大號注射器內(nèi)芯輕輕將脾磨碎,制成單個細胞懸液.經(jīng)200目篩網(wǎng) 過濾,用Hank's液洗2次,每次離心10min 1000r/min .然后將細胞懸浮于 2mL的完全培養(yǎng)液中,用全自動細胞計數(shù)儀計數(shù)脾細胞,或用臺酚蘭染色計數(shù)活細胞數(shù)應在95%Z上,調(diào)整細胞濃度為3X 106個/mL.5.2.1.3.3 淋巴細胞增殖反響將細胞懸液分兩孔參加24孔培養(yǎng)板中,每孔1mL一孔加75仙l ConA液相 當于g/mL,另一孔作為對照,置5%CO, 3

14、7c CO孵箱中培養(yǎng)72h.培養(yǎng)結束 前4h,每孔輕輕吸去上清液,參加不含小牛血清的RPMI1640W養(yǎng)液,同時參加MTT5mg/mL 50 l /孔,繼續(xù)培養(yǎng)4h.培養(yǎng)結束后,每孔參加1mL酸性異丙 醇,超聲震蕩2秒或人工吹打混勻,使紫色結晶完全溶解.然后分裝到 96 孔培養(yǎng)板中,每個孔分裝3孔作為平行樣,用酶聯(lián)免疫檢測儀,以570nm波長測 定光密度值.也可將溶解液直接移入 2mL比色杯中,分光光度計上在波長 570nm 測定ODfi.5.2.1.4 數(shù)據(jù)處理及結果判定一般采用方差分析,但需按方差分析的程序先進行方差齊性檢驗,方差齊, 計算F值,F®< ,結論：各組均數(shù)間差

15、異無顯著性；F值?,P0,用多個實驗組 和一個對照組間均數(shù)的兩兩比擬方法進行統(tǒng)計；對非正態(tài)或方差不齊的數(shù)據(jù)進行 適當?shù)淖兞哭D(zhuǎn)換,待滿足正態(tài)或方差齊要求后,用轉(zhuǎn)換后的數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計；假設變 量轉(zhuǎn)換后仍未到達正態(tài)或方差齊的目的,改用秩和檢驗進行統(tǒng)計.用加ConAfL的光密度值減去不加ConAfL的光密度值代表淋巴細胞的增殖能 力,受試樣品組的光密度差值顯著高于對照組的光密度差值,可判定該項實驗結果陽性.5.2.1.5 考前須知ConA的濃度很重要,濃度過低不能刺激足夠的細胞增殖,濃度過高會抑制 細胞增殖,不同批號的ConA在實驗前要預試,以找到最正確濃度.5.2.2 XTT 法5.2.2.1 原理由

16、于MTT經(jīng)復原所產(chǎn)生的甲產(chǎn)物不溶于水,且溶解甲的有機溶劑有毒 性,可選擇XTT法替代MTT去.其原理是：XTT是二甲氧唾黃,在電子耦合試劑 存在的情況下,活細胞線粒體中的脫氫酶可將黃色的 XTT復原成水溶性的橘黃色的甲月贊,生成的甲月贊能夠溶解在組織培養(yǎng)基中,不形成顆粒,可直接用酶聯(lián)免疫檢測儀檢測定吸光值.5.2.2.2 實驗步驟脾細胞懸7制備同MTTt；淋巴細胞增殖反響：調(diào)整細胞濃度為 5X107,取細月懸液100屋 分別參加96孔培養(yǎng)板中,一孔加510Nl ConA液,另一孔作為對照,設 2個平行孔, 置37c5%CO飽和濕度孵箱中培養(yǎng)72h.培養(yǎng)結束前4h,向各孔中參加2050屋 的XT

17、T工作液按試劑盒說明現(xiàn)用現(xiàn)配,孵育4小時.用酶標儀在450nm波長 處檢測每孔的光密度.5.2.2.3 數(shù)據(jù)處理及結果判定一般采用方差分析,但需按方差分析的程序先進行方差齊性檢驗,方差齊,計算F值,F®< ,結論：各組均數(shù)間差異無顯著性；F值?,P0,用多個實驗組 和一個對照組間均數(shù)的兩兩比擬方法進行統(tǒng)計；對非正態(tài)或方差不齊的數(shù)據(jù)進行 適當?shù)淖兞哭D(zhuǎn)換,待滿足正態(tài)或方差齊要求后,用轉(zhuǎn)換后的數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計；假設變 量轉(zhuǎn)換后仍未到達正態(tài)或方差齊的目的,改用秩和檢驗進行統(tǒng)計.用加ConAfL的光密度值減去不加ConAfL的光密度值代表淋巴細胞的增殖能 力,受試樣品組的光密度差值顯著高于對

18、照組的光密度差值,可判定該項實驗結果陽性.5.2.2.4 考前須知細胞濃度及培養(yǎng)時間在實驗前要預試,以找到最正確效果.5.2.3 澳脫氧尿喀噬核昔標記酶聯(lián)免疫吸附測定法 BrdU-ELISA法5.2.3.1 原理T 淋巴細胞在有絲分裂原ConA等的刺激下產(chǎn)生增殖反響,BrdU可競爭摻入 到增殖細胞中新合成的DNAg內(nèi),將BrdU標記的細胞作為抗原結合到固相載體 外表,參加酶連接的抗-BrdU抗體,使BrdU抗原與酶標抗體充分結合,抗原抗 體復合物與底物作用后產(chǎn)生有色物質(zhì),其光密度可反映細胞增殖的程度.5.2.3.2 儀器和材料低溫離心機,全自動酶標儀、超7工作臺、二氧化碳培養(yǎng)箱、96孔培養(yǎng)板平

19、底、倒置顯微鏡、移液器、手術器械、200目篩網(wǎng)、細胞活性分析儀；RPMI1640 細胞培養(yǎng)液、小牛血清、青霉素、鏈霉素、刀豆蛋白A ConA、Hank's液、PBS緩沖液、BrdU細胞增殖檢測試劑盒ELISA、純潔水、終止液.5.2.3.3 實驗步驟5.2.3.試劑配制完全培養(yǎng)液RPMI1640培養(yǎng)液過濾除菌,用前參加10%小牛血清,1%谷氨 酰胺 200mmol/L,青霉素100U/mD,鏈霉素100N g/L及 5X 10 5mol/L 的2-琉基乙醇,用無菌的1mol/L的HCl或1mol/L的NaOHS pH至,即完全培 養(yǎng)液.ConA液 用雙蒸水配制成100ug/mL的溶液,

20、過濾除菌,在低溫冰箱-20C 保存.無菌Hank's液 用前以的無菌NaHCOI.BrdU標記液 將標記劑試劑盒按1: 100的比例加到培養(yǎng)液中混勻,現(xiàn) 配現(xiàn)用.抗體貯存液母液在Anti-BrdU-POD 試劑盒中加雙蒸水充分混合, 存于-20 C備用.抗體工作液 每100屋 抗體母液加10ml抗體稀釋液試劑盒,現(xiàn)配現(xiàn)用.洗液 每10ml清洗緩沖液試劑盒加100ml雙蒸水.5.2.3.脾細胞懸液制備無菌取脾,置于盛有適量無菌 Hank's液平皿中,并在脾上面放置一塊紗布, 用大號注射器內(nèi)芯輕輕將脾磨碎,制成單個細胞懸液.經(jīng) 200目篩網(wǎng)過濾,用 Hank's液洗2次,每

21、次離心10min 1000r/min .然后將細胞懸浮于2mL的完全 培養(yǎng)液中,用全自動細胞計數(shù)儀計數(shù)脾細胞, 或用臺酚蘭染色計數(shù)活細胞數(shù) 應 在95姒上,調(diào)整細胞濃度為2X107個/mL.5.2.3.淋巴細胞培養(yǎng)將細胞參加96孔培養(yǎng)板中,10仙1/孔,每份細胞加2孔,第1孔再參加90N11640培養(yǎng)液,第2孔參加85仙11640培養(yǎng)液和世1 ConA同時設3個空白 孔,每孔僅加100以1 1640培養(yǎng)液,置5%CO 37c培養(yǎng)箱孵育72h,培養(yǎng)結束 前4 h參加BrdU標記液,101/孔,培養(yǎng)結束后離心1000r/min,10min , 棄上清,吹干細胞,放4c冰箱保存待測.1.1.1.1

22、聯(lián)免疫吸附測定每孔加200屋 固定液,常溫放置30min后,吸棄固定液.參加100仙1 BrdU 抗體工作液,37c孵育60min；吸棄未結合的抗體,力口 250屋 洗液洗3次,輕 拍移去洗液.加底物溶液含 TMB 1001 /孔,常溫孵育15min.用酶標儀測 量吸光值,不加終止液時,測定發(fā)射波長為370nm 記為樂.,參考波長492nm記為A92；加終止液時,測定發(fā)射波長為 450nm 記為性.,參考波長690nm 記為 A590.5.2.3.4 數(shù)據(jù)處理及結果判定計算每孔標記指數(shù)LI , LI= A370- A空白370- A192- A 空白 492或 LI= A50- A空白450

23、- A590- A空白690.用加ConA孔的LI值減去不加ConA孔的LI值所得 的差值代表淋巴細胞的增殖程度.采用方差分析對標記指數(shù)差值進行統(tǒng)計學分析,按方差分析的程序先進行方 差齊性檢驗,方差齊,計算F值,F®< ,那么各組均數(shù)間差異無顯著性；F值?,P < ,用多個實驗組和一個對照組間均數(shù)的兩兩比擬方法進行統(tǒng)計；對非正態(tài)或方 差不齊的數(shù)據(jù)進行適當?shù)淖兞哭D(zhuǎn)換,待滿足正態(tài)或方差齊要求后,用轉(zhuǎn)換后的數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計；假設變量轉(zhuǎn)換后仍未到達正態(tài)或方差齊的目的,改用秩和檢驗進行統(tǒng)計.受試樣品組的LI值差值顯著高于對照組的LI值差值,可判定該項實驗結果 陽性.5.2.3.5 考前

24、須知選擇有絲分裂原時ConA的濃度很重要,ConA的濃度過高會產(chǎn)生抑制作用, 不同批號的ConA在實驗前要預試,以找到最正確刺激分裂濃度遲發(fā)型變態(tài)反響DTH遲發(fā)型變態(tài)反響是細胞免疫的體內(nèi)檢測法,當致敏 T細胞再次與抗原接觸, 引起T細胞活化,釋放出多種細胞因子,致局部組織發(fā)生以單核細胞為主的炎癥 反響,一般在2448h達頂峰.可任選以下方法之一試驗.5.3.1 二硝基氟苯誘導小鼠DTH 耳月中脹法5.3.1.1 原理二硝基氟苯DNFB稀釋液可與腹壁皮膚蛋白結合成完全抗原,由此刺激T淋巴細胞增殖成致敏淋巴細胞.47d后再將其涂抹于耳部進行抗原攻擊, 使局 部月中脹,一般在抗原攻擊后2448h達頂

25、峰,其月中脹程度可以反映遲發(fā)型變態(tài)反 應程度.5.3.1.2 材料DNFB、丙酮、麻油、硫化鋼、打孔器.5.3.1.3 實驗步驟5.3.1.3.1 試劑配制DNFB§液DNFB溶液應新鮮配制,稱取DNFB50mg置清潔枯燥小瓶中,將 預先配好的5mL丙酮麻油溶液丙酮：麻油=1: 1,倒入小瓶,蓋好瓶塞并用膠 布密封.混勻后,用250屋 注射器通過瓶蓋取用.5.3.1.3.2 致敏每鼠腹部皮膚用硫化鋼脫毛,范圍約 3cmx 3cm用DNFB溶 液50屋 均勻涂抹致敏.5.3.1.3.3 DTH的產(chǎn)生與測定5天后,用DNFB溶液10仙1均勻涂抹于小鼠右 耳兩面進行攻擊.攻擊后 24h頸椎

26、脫臼處死小鼠,剪下左右耳殼.用打孔 器取下直徑8mml勺耳片,稱重.5.3.1.4 數(shù)據(jù)處理與結果判定一般采用方差分析,但需按方差分析的程序先進行方差齊性檢驗,方差齊,計算F值,F®< ,結論：各組均數(shù)間差異無顯著性；F值?,P0,用多個實驗組 和一個對照組間均數(shù)的兩兩比擬方法進行統(tǒng)計；對非正態(tài)或方差不齊的數(shù)據(jù)進行 適當?shù)淖兞哭D(zhuǎn)換,待滿足正態(tài)或方差齊要求后,用轉(zhuǎn)換后的數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計；假設變 量轉(zhuǎn)換后仍未到達正態(tài)或方差齊的目的,改用秩和檢驗進行統(tǒng)計用左右耳重量之差表示DTH的程度.受試樣品組的重量差值顯著高于與對照組的重量差值,可判定該項實驗結果陽性.5.3.1.5 考前須知：操作

27、時應預防DNFBW皮膚接觸.5.3.2 綿羊紅細胞SRBC誘導小鼠DTH足跖增厚法5.3.2.1 原理SRBC可刺激T淋巴細胞增殖成致敏淋巴細胞,4天后,當再以SRBOJ擊時, 攻擊部位出現(xiàn)月中脹,其月中脹程度可反映遲發(fā)型變態(tài)反響程度.5.3.2.2 儀器與材料游標卡尺精密度0.02mn、SRBC微量注射器50膜、足趾容積測量儀.5.3.2.3 實驗步驟5.3.2.3.1 致敏 小鼠用2%v/vSRBC腹腔或靜脈免疫,每只鼠注射約1X 108個 SRBC.5.3.2.3.2 DTH 的產(chǎn)生與測定 免疫后4天,測量左后足跖部厚度或月中脹度, 然后在測量部位皮下注射20% v/vSRBC,每只鼠2

28、0屋 約1X108個SRBC, 注射后于24h測量左后足跖部厚度或月中脹度,同一部位測量三次,取平均值.測量方法：用游標卡尺測量肉眼讀數(shù).或用足趾容積測量儀進行測量足跖部月中脹度,操作方法按儀器操作指引進行.5.3.2.4 數(shù)據(jù)處理和結果判定一般采用方差分析,但需按方差分析的程序先進行方差齊性檢驗,方差齊,計算F值,F®< ,結論：各組均數(shù)間差異無顯著性；F值?,P0,用多個實驗組 和一個對照組間均數(shù)的兩兩比擬方法進行統(tǒng)計；對非正態(tài)或方差不齊的數(shù)據(jù)進行 適當?shù)淖兞哭D(zhuǎn)換,待滿足正態(tài)或方差齊要求后,用轉(zhuǎn)換后的數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計；假設變 量轉(zhuǎn)換后仍未到達正態(tài)或方差齊的目的,改用秩和檢驗進行

29、統(tǒng)計.以攻擊前后足跖厚度或月中脹度的差值來表示DTH的程度.受試樣品組的差值顯著高于對照組的差值,可判定該項實驗結果陽性.5.3.2.5 考前須知前后兩次測量足跖厚度時,最好由專人來進行.卡尺緊貼足跖部,但不要加 壓,否那么會影響測量結果.攻擊時所用的SRBCM新鮮(保存期不超過1周).抗體生成細胞檢測(改進法)5.4.1 原理溶血空斑試驗是檢測產(chǎn)生IgM、IgG等抗體分泌細胞數(shù)體外試驗法.用綿羊 紅細胞(SRBC免疫的小鼠脾細胞懸液與一定量的 SRBC昆合,在補體參與下, 使抗體分泌細胞周圍的SRBO解,形成肉眼可見的空斑.5.4.2 儀器和材料溶血空斑自動圖象分析儀、二氧化碳培養(yǎng)箱、恒溫水

30、浴、離心機、手術器械、 200目篩網(wǎng)、SRBC補體(豚鼠血清)、Hank's液、RPMI1640W養(yǎng)液、SA緩沖液(CHNQ 0.46g, MgC2 0.1g, 0.2g, NaCl 8.38g, NaHCO0.252g and GHNNaO 0.3g,加蒸儲水至1000mL、滅菌生理鹽水、瓊脂糖.5.4.3 實驗步驟：5.4.3.1 SRBC 綿羊頸靜脈取血,將羊血放入有玻璃珠的滅菌錐形瓶中, 朝一 個方向搖動,以脫纖維,生理鹽水 2500rpm/min , 15min,洗滌3次,制備壓積 SRBC放入4 c冰箱保存?zhèn)溆?5.4.3.2 完全培養(yǎng)基的制備：新生小牛血清經(jīng)綿羊紅細胞(v

31、/v, 5: 1)吸收, 4C, 30-60min后,參加不完全培養(yǎng)基 RPMI 1640中,制備成含20%、牛血清的 完全培養(yǎng)基.5.4.3.3 補體制備 股動脈取血,靜置 30-60min, 2500rpm/min, 15min別離 血清,將5-10只豚鼠血清混合后,與壓積 SRBCZ 5: 1 (v/v)比例混合,4c 冰箱放置30-60min,問或震蕩,2500rpm/min, 15min別離血清,分裝,-80 C冰 箱保存.用時以完全培養(yǎng)基1: 10 (v/v)比例稀釋.5.4.3.4免疫動物壓積SRBC以生理鹽水制成2% (v/v)的細胞懸液(約1 X 108個SRBC,每只鼠腹腔

32、注射.5.4.3.5 脾細胞懸液制備 將SRBC&疫4-5天后的小鼠頸椎脫臼處死,無菌取脾臟,并在脾上面放置一塊紗布,用大號注射器內(nèi)芯輕輕將脾磨碎,制成單個 細胞懸液,200目篩網(wǎng)過濾,1000rpm/min, 10min,去上清,Hank'液洗2遍, 以完全培養(yǎng)基RPMI 1640制備成5X 1061 X 107個細胞/mL的脾細胞懸液.5.4.3.6 空斑的測定5.4.3.6.1 底層培養(yǎng)基制備0.5g瓊脂糖參加100mL滅菌生理鹽水中,加熱溶解,待溫度于50c左右時,以1mL仇的量加至六孔培養(yǎng)板中,瓊脂凝固后備用.5.4.3.6.2 頂層培養(yǎng)基制備0.5g瓊脂糖參加100

33、mLHank' s液中,加熱溶 解,以試管的量加至46-50.叵溫的試管中.5.4.3.6.3 鋪板：50屋20%SRBC生理鹽水配制,v/v、200屋 脾細胞懸液 先后參加含有頂層的試管中,迅速混勻,倒入六孔板中并鋪平頂層混合液, 每個 樣本做兩個平行孔.5.4.3.6.4 空斑測定：已制備好培養(yǎng)板放入 37C、5%CO加養(yǎng)箱中孵育1h,然 后每孔參加500屋以完全培養(yǎng)基稀釋的補體v/v, 1: 10,繼續(xù)孵育2h,自 動圖象分析儀讀取溶血空斑圖象分析軟件計數(shù)溶血空斑數(shù). 取平行孔空斑數(shù)的平 均值為樣本的溶血空斑數(shù)值,以空斑數(shù)/106脾細胞表示.5.4.4數(shù)據(jù)處理及結果判定一般采用方

34、差分析,但需按方差分析的程序先進行方差齊性檢驗,方差齊,計算F值,F®< ,結論：各組均數(shù)間差異無顯著性；F值?,P0,用多個實驗組 和一個對照組間均數(shù)的兩兩比擬方法進行統(tǒng)計；對非正態(tài)或方差不齊的數(shù)據(jù)進行 適當?shù)淖兞哭D(zhuǎn)換,待滿足正態(tài)或方差齊要求后,用轉(zhuǎn)換后的數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計；假設變 量轉(zhuǎn)換后仍未到達正態(tài)或方差齊的目的,改用秩和檢驗進行統(tǒng)計.用空斑數(shù)/106脾細胞或空斑數(shù)/全脾細胞來表示,受試樣品組的空斑數(shù)顯著 高于對照組的空斑數(shù),可判定該項實驗結果陽性.血清溶血素的測定可任選以下方法之一.5.5.1 血凝法5.5.1.1 原理用SRBQfe疫動物后,產(chǎn)生抗SRB仇體(溶血素),利用

35、其凝集SRBC勺程度 來檢測溶血素的水平.5.5.1.2 儀器和材料SRBC、生理鹽水、微量血凝實驗板、離心機5.5.1.3 實驗步驟5.5.1.3.1 SRBC綿羊頸靜脈取血,將羊血放入有玻璃珠的滅菌錐形瓶中,朝一個方向搖動,以脫纖維,放入 4c冰箱保存?zhèn)溆?可保存2周.5.5.1.3.2 免疫動物及血清別離 取羊血,用生理鹽水洗滌 3次,每次離心 (2000r/min)10min.將壓積SRBCffl生理鹽水配成2% (v/v )的細胞懸液,每只 鼠腹腔注射進行免疫.45d后,摘除眼球取血于離心管內(nèi),放置約1h,將凝固 血與管壁剝離,使血清充分析出,2000r/min離心10min,收集血

36、清.5.5.1.3.3 凝集反響 用生理鹽水將血清倍比稀釋,將不同稀釋度的血清分別置 于微量血凝實驗板內(nèi),每孔100仙1,再參加100仙l % (v/v)的SRBCt液,混 勻,裝入濕潤的平盤內(nèi)加蓋,于 37c溫箱孵育3h,觀察血球凝集程度.5.5.1.4 數(shù)據(jù)處理及結果判定一般采用方差分析,但需按方差分析的程序先進行方差齊性檢驗,方差齊,計算F值,F®< ,結論：各組均數(shù)間差異無顯著性；F值?,P0,用多個實驗組 和一個對照組間均數(shù)的兩兩比擬方法進行統(tǒng)計；對非正態(tài)或方差不齊的數(shù)據(jù)進行 適當?shù)淖兞哭D(zhuǎn)換,待滿足正態(tài)或方差齊要求后,用轉(zhuǎn)換后的數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計；假設變 量轉(zhuǎn)換后仍未到達正

37、態(tài)或方差齊的目的,改用秩和檢驗進行統(tǒng)計.血清凝集程度一般分為5級(0-IV)記錄,按下式計算抗體積數(shù),受試樣 品組的抗體積數(shù)顯著高于對照組的抗體水平,可判定該項實驗結果陽性.抗體水平=(S+2S+3s3nS)式中1、2、3n代表對倍稀釋的指數(shù),S代表凝集程度的級別,抗體積數(shù) 越大,表示血清抗體越高.0級 紅細胞全部下沉,集中在孔底部形成致密的圓點狀,四周液體清皙.I級紅細胞大局部沉集在孔底成園點狀,四周有少量凝集的紅細胞.R級 凝集的紅細胞在孔底形成薄層,中央可以明顯見到一個疏松的紅點.田級 凝集的紅細胞均勻地鋪散在孔底成一薄層,中央隱約可見一個小紅點.IV級 凝集的紅細胞均勻地鋪散在孔底成一

38、薄層,凝塊有時成卷折狀.5.5.1.5 考前須知血清稀釋時要充分混勻.最后一個稀釋度應不出現(xiàn)凝集現(xiàn)象.5.5.2 半數(shù)溶血值HG的測定5.5.2.1 原理用SRBCl疫動物后,產(chǎn)生抗SRBCM體溶血素,在補體參與下,與SRBC 一起孵育,可發(fā)生溶血反響,釋放血紅蛋白,通過測定血紅蛋白含量反映動物血 清中溶血素的含量.5.5.2.2 儀器和材料分光光度計、全自動酶標儀、恒溫培養(yǎng)箱、96孔培養(yǎng)板、離心機、恒溫水浴、SRBC補體豚鼠血清、SA緩沖液CHMQ0.46g, MgC2 0.1g, 0.2g, NaCl8.38g, NaHCO0.252g and GHiN2NaO0.3g,加蒸儲水至 100

39、0m!、都氏試劑碳 酸氫鈉1.0g、高鐵氟化鉀0.2g、氟化鉀0.05g,加蒸儲水至1000mL5.5.2.3 實驗步驟5.5.2.3.1 SRBC綿羊頸靜脈取血,將羊血放入有玻璃珠的滅菌錐形瓶中朝一個方向搖動,以脫纖維,放入 4c冰箱保存?zhèn)溆?可保存2周.5.5.2.3.2 制備補體采集豚鼠血,別離出血清至少 5只豚鼠的混合血清, 將1mL壓積SRBO入到5mL豚鼠血清中,放4c冰箱30min,經(jīng)常振蕩,離心取 上清,分裝,70c保存.用時以SA緩沖液按1 : 8稀釋.5.5.2.3.3 免疫動物及血清別離 取羊血,用生理鹽水洗滌 3次,每次離心 2000r/min10min.將壓積SRBC

40、ffl生理鹽水配成2% v/v 的細胞懸液,每只 鼠腹腔注射進行免疫.45d后,摘除眼球取血于離心管內(nèi),放置約1h,使血清 充分析出,2000r/min離心10min,或6000r/min,4min,收集血清.5.5.2.3.4 溶血反響測定5.5.2.3 ,檢測方法1 分光光度計測定：取血清用SA緩沖液稀釋一般為200500倍.將稀釋后的血清1mL置試 管內(nèi),依次參加10%v/vSRBC ,補體1mL用SA液按1:8稀釋.另設不加 血清的對照管以SA液代替.置37恒溫水浴中保溫1530min后,冰浴終 止反響.2000r/min離心10min.取上清液1mL加都氏試劑3mL同時取10% v/

41、vSRBC加都氏試劑至4mL充分混勻,放置10min后,于540nm處以對照管 作空白,分別測定各管光密度值.5.5.2.4 .檢測方法2全自動酶標儀測定：設樣品孔和空白對照孔,樣品孔：取血清 10仙1,用1mL1:5稀釋的SA緩沖 液稀釋；每孔參加稀釋后的血清100履；空白對照孔：每孔參加100屋1:5稀 釋的SA緩沖液,再依次參加10% v/vSRBC 50屋,補體100膜用SA溶液或 PBS容液按1:8稀釋,置37c恒溫水浴中保溫30min, 1500r/min離心10min. 然后樣品孔和空白對照孔各取上清液 50參加另一個96孔培養(yǎng)板內(nèi),加都氏 試劑150仙l o同時設半數(shù)溶血孔,參

42、加10%v/vSRBC 屋,再加都氏試劑至 200屋.用震蕩器充分混勻,放置10min后,于540nm處用全自動酶標儀測定各 孔光密度值.5.5.2.5 數(shù)據(jù)處理及結果判定一般采用方差分析,但需按方差分析的程序先進行方差齊性檢驗,方差齊, 計算F值,F®< ,結論：各組均數(shù)間差異無顯著性；F值?,P0,用多個實驗組 和一個對照組間均數(shù)的兩兩比擬方法進行統(tǒng)計；對非正態(tài)或方差不齊的數(shù)據(jù)進行 適當?shù)淖兞哭D(zhuǎn)換,待滿足正態(tài)或方差齊要求后,用轉(zhuǎn)換后的數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計；假設變 量轉(zhuǎn)換后仍未到達正態(tài)或方差齊的目的,改用秩和檢驗進行統(tǒng)計.溶血素的量以半數(shù)溶血值HQ表示,按以下公式計算：樣品光密度值X

43、稀釋倍數(shù)樣品HGo=SRBC半數(shù)溶血時的光密度值樣品光密度值-空白光密度值或樣品HG0=X稀釋倍數(shù)SRBC 半數(shù)溶血時的光密度值-空白光密度值受試樣品組的HQ顯著高于對照組的HQ,可判定該項實驗結果陽性.小鼠碳廓清實驗5.6.1 原理在一定范圍內(nèi),碳顆粒的消除速率與其劑量呈指函數(shù)關系.以血碳濃度對數(shù)值為縱座標,時間為橫座標,兩者呈直線關系.此直線斜率 K 可表示吞噬速率.動物肝、脾重量影響吞噬速率,一般以校正吞噬指數(shù) a表示. 5.6.2儀器和試劑分光光度計、全自動酶標儀、計時器、血色素吸管、印度墨汁、NaCO5.6.3 實驗步驟5.6.3.1 溶液配制注射用墨汁 將印度墨汁原液用生理鹽水稀釋

44、 34倍.Na 2CO溶液 取,加蒸儲水至100mL5.6.3.2 注射墨汁 稱體重,從小鼠尾靜脈注入稀釋的印度墨汁, 按每10g體重 計算.待墨汁注入,立即計時.5.6.3.3 測定注入墨汁后2、10min,分別從內(nèi)眥靜脈叢取血 20小,并立即將其加到2mL %N2CO溶液中.用分光光度計或全自動酶標儀在600nm波長處測光密度值OD,以NaCO溶液作空白對照.將小鼠處死,取肝臟和脾臟,用濾紙吸干臟器外表血污,稱重.以吞噬指數(shù)表示小鼠碳廓清的水平.按下式計算吞噬指數(shù)a:K=lgOD1-lgOD2體重3吞噬指數(shù) a=*% K肝重十脾重5.6.4 數(shù)據(jù)處理及結果判定一般采用方差分析,但需按方差分

45、析的程序先進行方差齊性檢驗,方差齊,計算F值,F值 ,結論：各組均數(shù)間差異無顯著性；F值?,P0,用多個實驗組 和一個對照組間均數(shù)的兩兩比擬方法進行統(tǒng)計；對非正態(tài)或方差不齊的數(shù)據(jù)進行 適當?shù)淖兞哭D(zhuǎn)換,待滿足正態(tài)或方差齊要求后,用轉(zhuǎn)換后的數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計；假設變 量轉(zhuǎn)換后仍未到達正態(tài)或方差齊的目的,改用秩和檢驗進行統(tǒng)計.受試樣品組的吞噬指數(shù)顯著高于對照組的吞噬指數(shù),可判定該項實驗結果陽 性.5.6.5 考前須知靜脈注入碳粒的量、取血時間、取血量一定要準確.墨汁放置中,碳?？沙劣谄康?臨用前應搖勻.使用新的墨汁時,應在實驗前摸索一個最適墨汁注入量,即正常小鼠在20 30min內(nèi)不易廓清.小鼠腹腔巨噬細

46、胞吞噬熒光微球試驗方法5.7.1 原理：激活的巨噬細胞具有吞噬外表帶有陽性可調(diào)理基團的熒光微球,將 含有巨噬細胞的腹腔液與調(diào)理過的熒光微球孵育一定時間后,去除多余未被吞噬 的微球,收集以巨噬細胞為主的標本,用流式細胞儀檢測巨噬細胞,計數(shù)吞噬熒 光微球的巨噬細胞,計算吞噬百分率和吞噬指數(shù),據(jù)此判定巨噬細胞的吞噬水平.5.7.2 儀器和材料Hank's液,小牛血清,PB或沖液,生理鹽水,熒光微球2 m, 1 %小 牛血清白蛋白BSA.流式細胞儀,超聲清洗儀,二氧化碳細胞培養(yǎng)箱,離心機,6孔培養(yǎng)板,細胞刮,過濾器75項,流式上樣管,流式細胞儀專用鞘液,移液槍及吸頭,白 細胞計數(shù)板,手術器械一

47、套,注射器,滴管,膠頭吸管.5.7.3 實驗步驟5.7.3.1 試劑配制5.7.3.1.1 含5%小牛血清的 Hank's液：取10ml小牛血清參加200ml Hank's液中,混勻,臨用前配.5.7.3.1.2 PBS緩沖液的配制方法：KHPO 6.66g, NaHPO 12HO 6.38g ,將上述試劑溶于1000ml蒸儲水中調(diào)PH值至即成.5.7.3.1.3 2%綿羊紅細胞懸液的配制方法：實驗前取綿羊頸靜脈血,置于盛有玻璃珠20個左右的三角瓶內(nèi),連續(xù)順一個方向充分搖動510分鐘,除去纖維蛋白,用生理鹽水洗滌3次,每次1500rpm離心10分鐘,4c冰箱保存. 實驗前棄去上

48、清,按血球壓積用生理鹽水配制成2%的紅細胞懸液.5.7.3.1.4 1%BSA勺配制：溶于50mlPBSg沖液中,臨用前配較好.5.7.3.1.5 熒光微球預調(diào)理：100屋 熒光微球與10ml 1 %BSA 37c避光孵育30min,超聲處理5min,臨用前配.5.7.3.2 腹腔巨噬細胞吞噬熒光微球過程實驗前4天給每只小鼠腹腔注射2%綿羊血紅細胞激活小鼠巨噬細胞,實驗 當天用頸椎脫臼法處死小鼠,腹腔注射加小牛血清的Hank's液3ml/只,輕輕按 揉腹部20次,以充分洗出腹腔巨噬細胞,然后將腹壁剪開一個小口,吸取腹腔 洗液2ml用75 m過濾器過濾至試管內(nèi),調(diào)整巨噬細胞數(shù)為46X 1

49、05/ml.用移 液槍吸取1ml腹腔洗液于6孔培養(yǎng)板中,參加已經(jīng)預調(diào)理過的熒光微球1X107/ 板,37c二氧化碳細胞培養(yǎng)箱或室溫避光孵育90120分鐘,孵育結束后棄上清含未貼壁細胞和多余熒光微球,每次使用緩沖液輕輕洗滌2次,去上 清后再參加4CPBS緩沖液,用細胞刮刮下貼壁細胞,輕輕吹打均勻后經(jīng)75 m過濾器過濾后上機分析.5.7.3.3 流式細胞儀檢測分析5.7.3.3.1 設門：首先設立FSC-SS5維散點圖,通過調(diào)節(jié)FSC?口 SSC電壓值,以巨噬細胞設門界定分析的巨噬細胞群, 最大限度地排除其它有核細胞、細胞碎 片等的干擾;5.7.3.3.2 獲取：在熒光微球發(fā)射光的熒光通路檢測巨噬

50、細胞的熒光強度,每 份樣本獲取5000個巨噬細胞,數(shù)據(jù)可顯示于二維散點圖和直方圖中.在二維散 點圖中可通過設門圈定未吞噬熒光微球的巨噬細胞群和吞噬熒光微球的巨噬細 胞群；在直方圖中可通過標尺標定未吞噬熒光微球的巨噬細胞群和吞噬熒光微球 的巨噬細胞群,全部數(shù)據(jù)經(jīng)相關軟件分析未吞噬熒光微球的巨噬細胞和吞噬不同 數(shù)量熒光微球的巨噬細胞的比例.吞噬一個熒光微球吞噬二個熒光微球圖1吞噬熒光微球后的小鼠腹腔巨噬細胞圖熒光顯示400 圖2吞噬熒光微球后的小鼠腹腔巨噬細胞FSC-SS.口 FL2-SSC二維散點圖R1:總巨噬細胞群R2:未吞噬熒光微球的巨噬細胞群R3:吞噬一個熒光微球的巨噬細胞群R4:吞噬兩個

51、光微球的巨噬細胞群R5:吞噬三個熒光微球的巨噬細胞群R6:吞噬四個或四個以上熒光微球的巨噬細胞群圖3吞噬熒光微球后的小鼠腹腔巨噬細胞FL2直方圖5.7.4 數(shù)據(jù)處理及結果判定吞噬熒光微球的巨噬細胞數(shù)吞噬百分率衿= X 100計數(shù)的巨噬細胞數(shù)被吞噬的熒光微球總數(shù)吞噬指數(shù)二計數(shù)的巨噬細胞數(shù)以吞噬百分率或吞噬指數(shù)表示小鼠巨噬細胞的吞噬水平.吞噬百分率需進行 數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)換,X= Sin -1 JP,式中P為吞噬百分率,用小數(shù)表示,然后再進行方差 分析,在進行方差分析時,需按方差分析的程序先進行方差齊性檢驗,方差齊, 計算F值,F值 ,結論：各組均數(shù)間差異無顯著性；F值?,p0,用多個實驗組 和一個對照組間

52、均數(shù)的兩兩比擬方法進行統(tǒng)計；對非正態(tài)或方差不齊的數(shù)據(jù)進行 適當?shù)淖兞哭D(zhuǎn)換,待滿足正態(tài)或方差齊要求后,用轉(zhuǎn)換后的數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計；假設變 量轉(zhuǎn)換后仍未到達正態(tài)或方差齊的目的,改用秩和檢驗進行統(tǒng)計.受試樣品組的吞噬百分率、吞噬指數(shù)與對照組吞噬百分率、吞噬指數(shù)比擬, 差異均有顯著性,可判定該項實驗結果陽性.5.7.5 考前須知5.7.5.1 頸椎脫臼處死小鼠勿用力過大,預防腹腔內(nèi)血管破裂出血,導致腹腔洗液中混雜大量紅細胞,影響流式細胞儀的結果分析.5.7.5.2 孵育、細胞洗滌和上機全程注意避光,以保持微球熒光穩(wěn)定性.5.7.5.3 巨噬細胞、熒光微球濃度要根據(jù)試劑說明書調(diào)整適宜,否那么影響結果準確性.

53、5.7.5.4 細胞處理過程要輕柔,盡量減少碎片和雜質(zhì)對結果分析的影響.5.7.5.5 腹水細胞上機前一定要用足夠標準的濾器過濾,調(diào)理后多余的熒光微球要盡量去除,以預防流式細胞儀堵塞.NK細胞活性測定NKffl胞是沒有T和B細胞外表標志的淋巴細胞,具有非特異性殺傷作用. 可任選以下方法之一測定.5.8.1 乳酸脫氫酶LDH測定法5.8.1.1 原理正常情況下,活細胞的胞漿內(nèi)含有的 LDH不能透過細胞膜,當細胞受到 NK 細胞的殺傷后,LDHS放到細胞外.LDH可使乳酸鋰脫氫,進而使NADS®成NADH 后者再經(jīng)遞氫體吩嗪二甲酯硫酸鹽 PMS復原碘硝基氯化四氮唾INT, INT接 受U

54、被復原成紫紅色甲月贊類化合物.在酶標儀上用490nm比色測定.5.8.1.2 儀器和材料酶標儀、全自動細胞計數(shù)儀、 YAC-1細胞、Hank's液、RPMI164沈全 培養(yǎng)液、乳酸鋰或乳酸鈉、硝基氯化四氮唾INT、吩嗪二甲酯硫酸鹽PMS、 NAD L 的 Tris-HCl 緩沖液、1%NP40或Triton5.8.1.3 實驗步驟5.8.1.3.1 LDH 基質(zhì)液的配制乳酸鋰 5 x 10-2mol/L硝基氯化四氮唾INT x 10-4mol/L吩嗪二甲酯硫酸鹽PMS X10-4mol/L氧化型輔酶I NAD X10-3mol/L將上述試劑溶于L的Tris-HCl緩沖液中5.8.1.3

55、.2 靶細胞的傳代YAC-1細胞實驗前24h將靶細胞進行傳代培養(yǎng).應用前以Hank's液洗3次,用RPMI1640 完全培養(yǎng)液調(diào)整細胞濃度為4X 105個/mL.5.8.1.3.3 脾細胞懸液的制備效應細胞無菌取脾,置于盛有適量無菌 Hank's液的小平皿中,并在脾上面放置一塊 紗布,用大號注射器內(nèi)芯輕輕將脾磨碎,制成單個細胞懸液.經(jīng)200目篩網(wǎng)過濾, 用Hank's液洗2次,每次離心10min 1000r/min .棄上清將細胞漿彈起,力口 入滅菌水20秒,裂解紅細胞后再參加倍 Hank' s液及8mLHank s液,1000rpm, 10min離心,然后將細

56、胞懸浮于2mL的完全培養(yǎng)液中,用全自動細胞計數(shù)儀計數(shù) 脾細胞；或用1mL含10%、牛血清的RPMI164沈全培養(yǎng)液重懸,用1麻醋酸稀 釋后計數(shù)活細胞數(shù)應在95%Z上,用臺酚蘭染色計數(shù)活細胞數(shù)應在95%Z上, 最后用RPMI1640S全培養(yǎng)液調(diào)整細胞濃度為2X107個/mL.5.8.1.3.4 NK 細胞活性檢測取靶細胞和效應細胞各100仙l 效靶比50:1 ,參加U型96孔培養(yǎng)板中； 靶細胞自然釋放孔加靶細胞和培養(yǎng)液各100仙l ,靶細胞最大釋放孔加靶細胞和1%NP40或Triton各100卜l ;上述各項均設三個復孔,于 37C、5% CO培養(yǎng) 箱中培養(yǎng)4h,然后將96孔培養(yǎng)板以1500r/

57、min離心5min,每孔吸取上清100口 置平底96孔培養(yǎng)板中,同時參加LDHS質(zhì)液100仙l ,反響3min,每孔參加1mol/L 的HCl 30小,在酶標儀490nm處測定光密度值OD.按下式計算NK細胞活性：反響孔Ot>自然釋放孔ODNK細胞活性= X 100%最大釋放孔OD-自然釋放孔OD5.8.1.4 數(shù)據(jù)處理及結果判定NK細胞活性需進彳T數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)換,X= Sin-1行,式中P為NKffl胞活性,用小數(shù) 表示,然后再進行方差分析,在進行方差分析時,需按方差分析的程序先進行方 差齊性檢驗,方差齊,計算 F值,F值< ,結論：各組均數(shù)間差異無顯著性；F < >,P<,用多個實驗組和一個對照組間均數(shù)的兩兩比擬方法進行統(tǒng)計；對非正 態(tài)或方差不齊的數(shù)據(jù)進行適當?shù)淖兞哭D(zhuǎn)換, 待滿足正態(tài)或方差齊要求后,用轉(zhuǎn)換 后的數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計；假設變量轉(zhuǎn)換后仍未到達正態(tài)或方差齊的目的, 改用秩和檢驗