華中農(nóng)業(yè)大學(xué)作物遺傳育種展業(yè)博士資格考試題庫整理-2018

1、博士資格考試試題 1試述高通量基因型分析的含義及其在遺傳研究中的作用 。高通量基因型分析就是使用基因芯片及新一代測序技術(shù)發(fā)掘序列多態(tài)性 （主要是 SNP 標(biāo)記）， 目前 SNP 主要以三種形式存在，轉(zhuǎn)換、顛換、及插入缺失。在遺傳研究中的作用： （ 1）利用高通量基因型分析來迅速構(gòu)建高密度的遺傳連鎖圖譜，較常 規(guī)的基于 PCR 的標(biāo)記分析通量更高，更省時省力。在遺傳圖譜構(gòu)建中高通量的基因分型方法可 以更精準(zhǔn)地檢測出群體中的重組事件并確定重組斷點，最終提高遺傳圖譜的分辨率，有利于更加 精準(zhǔn)的定位 QTLs。（2）在基于自然群體的全基因組關(guān)聯(lián)分析中，高通量的SNP 技術(shù)更加能顯示其通量高，省時省力的

2、優(yōu)勢，也只有高通量的基因型分析產(chǎn)生的大批量分子標(biāo)記才能適合全基因 組關(guān)聯(lián)分析。 （3）更方便構(gòu)建材料的 DNA 指紋圖譜分析，用于品種的系譜來源研究及純度分析2. 請您簡述（ 1）農(nóng)作物群體改良的原理 （ 2）自花授粉作物群體改良的方法（3）如何利用現(xiàn)代生物技術(shù)手段提高群體改良的效率農(nóng)作物群體改良的原理：在一個完全隨機交配的群體內(nèi)，如果沒有其他因素（如選擇、突變 等）干擾時，基因與基因型頻率保存恒定，各世代不變，這是基因平衡定律。群體改良即不斷的 通過人為選擇，打破群體基因和基因型的平衡，不斷提高改良群體內(nèi)人類所需基因及基因型的頻 率。選擇和重組是群體進化的主要動力。自花授粉作物群體改良的關(guān)鍵

3、在于使其異交化，在合成基礎(chǔ)群體時導(dǎo)入雄性不育基因，建立 異交群體的方法是首先用雜交、回交法把隱形雄性核不育基因?qū)肴后w中的每個品系，然后再把 回交獲得的品系的種子等量混合在隔離區(qū)種植。由于只收獲雄性不育株的種子，因此高水平的隱 性雄性不育特性將繼續(xù)保留在群體中。每一代選擇優(yōu)良的雄性不育株，以該改良群體作為第二輪 改良的基礎(chǔ)群體，重復(fù)這個過程?，F(xiàn)在生物技術(shù)可以采用分子標(biāo)記輔助選擇來提高群體改良的效率，前提是我們通過 QTL 定 位等獲取某些性狀緊密連鎖的分子標(biāo)記， 然后可以用分子標(biāo)記對基礎(chǔ)群體中的每一個株系進行選 擇，通過分子標(biāo)記選擇具有我們需要的優(yōu)良等位基因的株系混合作為基礎(chǔ)群體進行群體改良。

4、其 次在每一代的選擇中我們都可以通過分子標(biāo)記在苗期進行選擇， 選擇具有優(yōu)良等位基因的單株進 行群體改良，縮小群體及減少工作量。最理想的狀態(tài)是通過對所有性狀的分子機制的理解，進行 全基因組輔助的分子設(shè)計育種，做到定向、高效、精準(zhǔn)育種。3. 如何利用生物技術(shù)和基因組學(xué)研究的成果克服傳統(tǒng)育種方法的缺陷傳統(tǒng)育種存在的缺陷： （ 1）種間農(nóng)藝性狀的轉(zhuǎn)移容易受到種間生殖隔離的限制；（ 2）通過雜交進行轉(zhuǎn)移優(yōu)良基因的時候， 容易受到連鎖累贅的影響；（3）優(yōu)良基因轉(zhuǎn)移成功與否依賴于表型的鑒定，受到環(huán)境的影響大轉(zhuǎn)基因育種：轉(zhuǎn)基因技術(shù)可針對目標(biāo)性狀精確改良，不僅省時而且可打破物種的界限，充分 利用遺傳資源分子標(biāo)記

5、輔助選擇育種：我們通過 QTL 定位等獲取某些性狀緊密連鎖的分子標(biāo)記，然后可 以用分子標(biāo)記對基礎(chǔ)群體中的每一個株系進行選擇， 通過分子標(biāo)記選擇具有我們需要的優(yōu)良等位 基因的株系混合作為基礎(chǔ)群體進行群體改良。 其次在每一代的選擇中我們都可以通過分子標(biāo)記在 苗期進行選擇，選擇具有優(yōu)良等位基因的單株進行群體改良，縮小群體及減少工作量。最理想的 狀態(tài)是通過對所有性狀的分子機制的理解， 進行全基因組輔助的分子設(shè)計育種， 做到定向、 高效、 精準(zhǔn)育種。分子設(shè)計育種：在分子標(biāo)記輔助育種的基礎(chǔ)上，隨著近年來大量基因組序列數(shù)據(jù)、高通量基 因型和植物表型鑒定技術(shù)的發(fā)展，眾多重要性狀功能基因的發(fā)掘，以及對分子標(biāo)記與

6、目標(biāo)性狀關(guān) 系的深入了解進一步催生了設(shè)計育種的概念，即育種家可以根據(jù)需要，在電腦上進行模擬，從而 設(shè)計出理想基因型的品種。分子設(shè)計育種在新基因挖掘、定向引入改良目標(biāo)性狀、創(chuàng)制新種質(zhì)材 料、改造親本材料、縮短育種年限、提高選擇準(zhǔn)確度、提高雜種優(yōu)勢利用率等方面具有傳統(tǒng)育種 方法不可比擬的優(yōu)越性。4. 關(guān)聯(lián)分析的原理，常見問題及解決方法，在作物育種中的應(yīng)用。關(guān)聯(lián)分析的原理： 關(guān)聯(lián)分析以連鎖不平衡為基礎(chǔ)鑒定某一群體內(nèi)性狀與遺傳標(biāo)記或候選基因 間的關(guān)系。連鎖不平衡是不同基因座位上等位基因的非隨機組合。當(dāng)位于某一座位的特定等位基 因與同一條染色體另一座位的某一等位基因同時出現(xiàn)的幾率大于群體中因隨機分布而使

7、兩個等 位基因同時出現(xiàn)的幾率時，就稱這兩個座位處于 LD 狀態(tài)。關(guān)聯(lián)分析的基本步驟：群體選擇估算群體結(jié)構(gòu)性狀考察多態(tài)性檢測統(tǒng)計分析 影響關(guān)聯(lián)分析的因素（ 1）標(biāo)記數(shù)量，在全基因組掃描中 ,用標(biāo)記對目標(biāo)性狀表型變異有貢獻(xiàn)的所有座位進行掃描,需要大量分子標(biāo)記。解決辦法： 1 利用 LD 程度高的群體進行全基因組關(guān)聯(lián)分析 , 可減少使用的 標(biāo)記數(shù)量。 2連鎖分析和關(guān)聯(lián)分析相結(jié)合， 根據(jù)連鎖分析的結(jié)果， 選擇效應(yīng)值比較大的 QTL 位點， 利用更多的標(biāo)記對自然群體進行 LD 分析，對目標(biāo)位點進行精細(xì)定位，然后根據(jù)已知基因組的信 息選擇適當(dāng)?shù)暮蜻x基因進行關(guān)聯(lián)分析。（ 2）群體結(jié)構(gòu)，指的是一個群體內(nèi)存在多

8、個亞群。亞群的混合使整個群體的LD 強度增強 ,可能導(dǎo)致不連鎖的多態(tài)性基因位點與性狀的關(guān)聯(lián),從而得出假陽性結(jié)果。 解決辦法： 利用大量的不連鎖、隨機分別的 SSR或RFLP 標(biāo)記對群體進行分析，再用統(tǒng)計方法消除群體結(jié)構(gòu)和假陽性（ 3 ） LD 衰減距離， LD 衰減距離越小，用更多的分子標(biāo)記分析關(guān)聯(lián)分析的應(yīng)用：（1）關(guān)聯(lián)分析進行功能基因的驗證，對那些很難通過遺傳轉(zhuǎn)化驗證基因功能的基因位點，（2）關(guān)聯(lián)分析進行功能標(biāo)記的開發(fā)，從而用于標(biāo)記輔助選擇。開發(fā)過程：在多個材料中對目 標(biāo)性狀進行調(diào)查，對目標(biāo)基因進行序列分析，結(jié)合性狀和基因序列信息進行基于連鎖不平 衡的關(guān)聯(lián)分析，開發(fā)最優(yōu)等位基因的功能標(biāo)記（

9、3）關(guān)聯(lián)分析進行數(shù)量性狀的研究，全基因組關(guān)聯(lián)分析可定位到更多的QTLs，候選基因關(guān)聯(lián)分析可用于尋找最優(yōu)的等位基因型關(guān)聯(lián)分析優(yōu)點： （與連鎖分析相比）（ 1）花費的時間少 , 一般以現(xiàn)有的自然群體為材料，無需構(gòu)建專門的作圖群體。（ 2）廣度大，可以同時檢測同一座位的多個等位基因。（ 3）精度高，可達(dá)到單基因的水平5. 列舉一種生物技術(shù)在抗病和抗逆育種中的應(yīng)用。轉(zhuǎn)基因技術(shù)在植物抗病及抗逆育種中的應(yīng)用非常有效且很廣泛。 以下主要以抗病和抗蟲育種 為例。轉(zhuǎn)基因可以有效利用該物種中克隆得到的抗病和抗蟲基因，也可以是該物種不存在的而在 其他物種中存在的抗病基因。我們通過圖位克隆或者反向遺傳學(xué)得到了某物種的

10、抗病基因， 可以直接將其通過轉(zhuǎn)基因轉(zhuǎn)移 到主栽的感病品種中，特定的轉(zhuǎn)移某一個基因，不存在回交育種過程中的連鎖累贅，不改變該主 栽品種的其他優(yōu)良性狀。比如目前利用做多的來自蘇云金芽孢桿菌中的 Bt 蛋白，目前在棉花水 稻抗蟲育種中都得到了較好的利用， 在我國轉(zhuǎn) Bt 基因抗蟲棉成功的防治了棉鈴蟲等鱗翅目害蟲， 水稻中也得到了轉(zhuǎn) Bt 基因水稻，具有較好的抗蟲性，在 2009 年獲得安全證書。 6簡述一種基于轉(zhuǎn)錄本分析植物基因表達(dá)的技術(shù)及其原理和應(yīng)用目前較常用的為 RNA-seq 技術(shù)即轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)，就是把 mRNA ，smallRNA 和 NONcoding RNA 用高通量測序技術(shù)把它們的序

11、列測出來，以反映出它們的表達(dá)水平。原理：提取總 RNA ，將所需的 RNA 純化出來并進行片段化，隨后反轉(zhuǎn)錄成 cDNA ，并 在 cDNA 片段兩端加上測序接頭和引物， 獲得 cDNA 文庫， 用第二代測序技術(shù)進行高通量測 序。如果有參考基因組，將測序后得到的reads 直接與參考基因組比對，最終計算得每個基因的 RPKM 值；如果沒有參考基因組， 先組裝轉(zhuǎn)錄組， 然后再與組裝的轉(zhuǎn)錄組比對得到每個 轉(zhuǎn)錄子的 RPKM 值（ RPKM 即每百萬 reads中比對到平均 1Kb 的基因（轉(zhuǎn)錄子）上的 read 個數(shù)）此值的大小即為基因（轉(zhuǎn)錄子）的表達(dá)豐度。應(yīng)用：（1）轉(zhuǎn)錄本結(jié)構(gòu)研究：可極大地豐富

12、基因注釋的很多方面，包括5/3邊界鑒定、UTRs 區(qū)域鑒定以及新的轉(zhuǎn)錄區(qū)域鑒定，可變剪切的鑒定（2）發(fā)現(xiàn)序列差異：如融合基因鑒定、編碼序列多態(tài)性研究（3）基因表達(dá)水平研究： 相比傳統(tǒng)的基因芯片技術(shù)， RNA-seq 技術(shù)能更準(zhǔn)確的確定 細(xì)胞中 RNA 的表達(dá)水平。7 簡述一種基于蛋白質(zhì)水平分析植物基因表達(dá)的方法技術(shù)原理及應(yīng)用。 常用的方法有雙向凝膠電泳聯(lián)合質(zhì)譜方法、鳥槍法 LC-MS 質(zhì)譜鑒定、抗體芯片方法等。 雙向凝膠電泳聯(lián)合質(zhì)譜的原理是：第一向根據(jù)蛋白質(zhì)的等電點不同用等電聚焦分離，第二向 則按分子量的不同用 SDS- PAGE 分離，把復(fù)雜蛋白質(zhì)混合物中的蛋白質(zhì)在二維平面上分開。凝 膠染色

13、后可以利用圖像分析系統(tǒng)成像，然后通過分析軟件對蛋白質(zhì)點進行 定量分析 ，并且對感興 趣的蛋白質(zhì)點進行定位。通過專門的蛋白質(zhì)點切割系統(tǒng)，可以將蛋白質(zhì)點所在的膠區(qū)域進行精確 切割。 接著對膠中蛋白質(zhì)進行 酶切消化 ，酶切后的消化物經(jīng)脫鹽 /濃縮處理后就可以通過點樣系統(tǒng) 將蛋白質(zhì)點樣到特定的材料的表面（ MALDI-TOF ）。最后這些蛋白質(zhì)就可以在質(zhì)譜系統(tǒng)中進行分 析，從而得到蛋白質(zhì)的 定性數(shù)據(jù) ，通過與已有的數(shù)據(jù)庫進行比對確定候選蛋白。鳥槍法 LC-MS 質(zhì)譜鑒定的基本原理是：蛋白質(zhì)混合物經(jīng)過簡單或不經(jīng)過 SDS-PAGE 分離就 被酶切消化成肽段混合物，肽段混合物經(jīng)過高效液相色譜分離形成較簡單

14、的組分，然后將其導(dǎo)入 高分辨率質(zhì)譜儀中進行質(zhì)量分析。肽段在質(zhì)譜儀中經(jīng)離子化后，帶上一定量的電荷，通過質(zhì)量分 析器的分析，可檢測個肽段的質(zhì)量與電荷的比值。通過與數(shù)據(jù)庫匹配進行肽段鑒定，最后再從鑒 定的肽段推導(dǎo)可能的蛋白?？贵w芯片方法：抗體芯片是蛋白芯片的一種，它的基因原理是首先制備目標(biāo)蛋白的特異性的 抗體，將不同的蛋白樣品用熒光分子標(biāo)記，再與抗體芯片雜交，雜交信號強弱反應(yīng)了蛋白的表達(dá) 水品高低。這三種技術(shù)可用于分析作物的不同品種，或不同生理、病理條件下蛋白組的表達(dá)差異，有助 于鑒定出影響作物品質(zhì)、抗逆性、產(chǎn)量等性狀的重要蛋白質(zhì)。8 列舉三種常用的第二代測序技術(shù)平臺，簡述其基本原理及其在作物遺傳育

15、種技術(shù)中的應(yīng)用。進入 21 世紀(jì)后，以 Roche 公司的 454 技術(shù)、Illumina 公司的 Solexa 技術(shù)和 ABI 公司的 SOLiD 技術(shù)為標(biāo)志的第二代測序技術(shù)誕生了。（1）454 技術(shù)原理 待測 DNA 文庫的構(gòu)建。把待測序列用噴霧法 （nebulization） 打斷成 300-800 bp 的小片段并 在小片段兩端加上不同的接頭，構(gòu)建單鏈DNA（ssDNA） 文庫。 Emulsion PCR 。將這些 ssDNA與磁珠在一起孵育、退火，由于磁珠表面含有與接頭互補的寡聚核苷酸序列，因此 ssDNA 會特 異地連接到磁珠上。同時孵育體系中含有 PCR 反應(yīng)試劑，因此可以保證每

16、一個與磁珠結(jié)合的小 片段都會在各自的孵育體系內(nèi)獨立擴增，擴增產(chǎn)物仍可以結(jié)合到磁珠上。反應(yīng)完成后，破壞孵育 體系并富集帶有 DNA 的磁珠。經(jīng)過擴增反應(yīng)，每一個小片段都將被擴增大約 100 萬倍，從而達(dá) 到下一步測序反應(yīng)所需的模板量。測序。預(yù)先用Bacillus stearothermophilus 聚合酶和單鏈結(jié)合蛋白處理帶有 DNA 的磁珠，然后將磁珠放置在 PTP 平板上， PTP 板上含有很多直徑約為 44m 的小孔。 測序反應(yīng)采用焦磷酸測序法， 將一種含有比 PTP 板上小孔直徑更小的磁珠放入小孔， 啟 動測序反應(yīng)。 測序反應(yīng)以磁珠上大量擴增的 ssDNA 為模板， 每次反應(yīng)加入一種

17、dNTP 進行合成反 應(yīng)。如果這種 dNTP 能與待測序列配對，則會在合成后釋放焦磷酸基團。釋放的焦磷酸基團會與 反應(yīng)體系中的 ATP 硫酸化酶反應(yīng)形成 ATP。生成的 ATP 和熒光素酶共同氧化反應(yīng)體系中的熒光 素分子并發(fā)出熒光。測序反應(yīng)產(chǎn)生的熒光信號由放置在PTP 板另一側(cè)的 CCD 照相機記錄，再經(jīng)過計算機分析轉(zhuǎn)換為測序結(jié)果。由于每種 dNTP 在反應(yīng)中產(chǎn)生的熒光顏色不同，因此可以根據(jù)熒 光的顏色來確定被測分子的序列。（ 2） Illumina 公司的 Solexa 技術(shù)待測 DNA 文庫的構(gòu)建把待測序列打斷成 200-500 bp 的小片段，并在小片段兩端加上不同 的接頭，建 ssDN

18、A 文庫。這些 ssDNA 隨機地附著在流動槽表面的 channel 上向反應(yīng)體系中添加未標(biāo)記的核苷酸和酶， 進行 Bridge PCR 擴增反應(yīng)。經(jīng)擴增將橋型 ssDNA 擴增成橋型 dsDNA 。 將橋型 dsDNA 變性成 ssDNA ，繼續(xù)擴增。經(jīng)過不斷的擴增變性循環(huán)，每一種ssDNA 都在各自的位置達(dá)到能支持下一步測序反應(yīng)所需信號強度的模板量。 測序方法采用邊合成邊測序的方法 （ SBS）。向反應(yīng)體系中同時添加 DNA 聚合酶、接頭引物和帶有堿基特異熒光標(biāo)記的 4 種 dNTP。 由于這些 dNTP 的 3羥基被化學(xué)方法保護，因而每輪合成反應(yīng)都只能添加一個dNTP 。在 dNTP被添

19、加到合成鏈上后，所有未使用的游離 dNTP 和 DNA 聚合酶會被洗脫。加入激發(fā)熒光所需的 緩沖液，用激光激發(fā)熒光信號，用光學(xué)設(shè)備完成熒光信號的記錄，再通過計算機分析轉(zhuǎn)化為測序 結(jié)果。（ 3） ABI 公司的 SOLiD 技術(shù)待測 DNA 文庫的構(gòu)建 把待測序列打斷成很小的片段，并在小片段兩端加上不同的接 頭，構(gòu)建 ssDNA 文庫。 Emulsion PCR。與 454 技術(shù)的 Emulsion PCR 類似，將帶接頭的 ssDNA 固定在磁珠表面， 進行 PCR 擴增，并對擴增產(chǎn)物進行 3端修飾。 連接酶測序。 體系中加入 DNA 連接酶、通用測序引物和具有 3-XXnnnzzz- 5結(jié)構(gòu)

20、的八聚核苷酸。在這個八聚核苷酸中，第1和第 2 位上的堿基是確定的，并根據(jù)種類的不同在第 6-8 位上加了不同的熒光標(biāo)記。當(dāng)八聚核苷酸 由于第 1 和第 2位配對而被連接酶連接上時，會發(fā)出熒光。在記錄下熒光信息后，通過化學(xué)方法 在第 5和第 6 位之間進行切割，淬滅熒光信號，以進行下個位置的測序。通過這種方法，每次測 序的位置都相差五位，即第一次測第1和第2位，第二次測第 6和第 7位在測到末尾后，將新合成的鏈變性、洗脫。而后用通用測序引物進行第二輪測序。第三代測序技術(shù)：基于邊合成邊測序的思想，將待測序列隨機打斷成小片段并在3末端加上Poly（A） ，用末端轉(zhuǎn)移酶在接頭末端加上 Cy3 熒光標(biāo)

21、記。用小片段與表面帶有寡聚 Poly（T） 的平板 雜交。然后，加入 DNA 聚合酶和 Cy5 熒光標(biāo)記的 dNTP 進行 DNA 合成反應(yīng)，每一輪反應(yīng)加一 種 dNTP 。將未參與合成的 dNTP 和 DNA 聚合酶洗脫， 檢測上一步記錄的雜交位置上是否有熒光 信號，如果有則說明該位置上結(jié)合了所加入的這種 dNTP 。經(jīng)過不斷地重復(fù)合成、洗脫、成像、 淬滅過程完成測序。9 傳統(tǒng)育種學(xué)是通過提高一般配合力和特殊配合力來提高雜交種品種產(chǎn)量潛力，現(xiàn)代分子育種學(xué) 是通過優(yōu)良基因的聚合和累積優(yōu)良基因的互作來提高雜交種產(chǎn)量潛力， 你認(rèn)為這兩種觀點是否矛 盾？我們應(yīng)該如何應(yīng)用這些觀點來指導(dǎo)雜交品種育種？不

22、矛盾。一般配合力指一個純系（自交系）親本與其他若干個品種（自交系）雜交后，雜種 一代在某個數(shù)量性狀上的平均表現(xiàn)。由基因的加性效應(yīng)決定的。一個自交系所包含的有利基因位 點越多，其一般配合力越高。特殊配合力是指兩個特定親本系所組配的雜交種的產(chǎn)量水平，又稱 為某一特定組合 F1 的實測值與其雙親一般配合力得到的預(yù)測值之差。特殊配合力只能在特定的 組合中由雙親的等位基因間或者非等位基因間的互作而反應(yīng)出來，是不能遺傳的部分。我們在雜交品種選育的過程中首先要選擇配合力高的兩個親本，尤其是一般配合力要高（也 就是說具有的優(yōu)良基因多） ，這樣容易得到強優(yōu)勢的雜種一代。另外盡可能選擇性狀良好并且能 互補的兩個材

23、料，這樣優(yōu)良基因存在互補并更容易在雜種一代中累加。在選擇一般配合力高的同 時，我們也要盡可能選擇特殊配合力高的材料，也就是充分利用雙親間優(yōu)良基因的互作。所以傳統(tǒng)育種學(xué)中的一般配合力本質(zhì)上也就是現(xiàn)代分子育種學(xué)中的優(yōu)良基因的聚合， 而特殊 配合力本質(zhì)上也就是優(yōu)良基因之間的互作。10 全基因組策略2001 年， 全基因組選擇的概念被提出， 即估計全基因組上所有標(biāo)記或單倍型的效應(yīng)， 從而得到基 因組估計育種值。與傳統(tǒng)的標(biāo)記輔助選擇的最大區(qū)別在于，全基因組選擇不僅僅依賴于一組顯著 的分子標(biāo)記，而是聯(lián)合分析群體中的所有標(biāo)記，以進行個體育種值的預(yù)測。與傳統(tǒng)的分子標(biāo)記輔 助選擇相比，全基因組選擇有兩大突破，一

24、是基因組定位的雙親群體可以直接應(yīng)用于育種；二是 更適合于改良由效應(yīng)較小的多基因控制的數(shù)量性狀。農(nóng)作物復(fù)雜性狀的分子育種需要操控許多因素，其中包括植物生長、發(fā)育和對各種生物和非 生物逆境條件的反應(yīng)。通過全基因組策略分子標(biāo)記輔助育種的操作更加容易，并由此產(chǎn)生革命性 影響。 全基因組策略的分子標(biāo)記輔助育種利用全基因組測序和全基因組分子標(biāo)記對代表性的或者 全部遺傳資源和育種材料進行分析，有效地考慮分子育種中面臨的各種基因組和環(huán)境因素。大規(guī) 模高密度的基因型鑒定和全基因組選擇是該策略的兩個重要組成部分。 高通量和精確的表型鑒定 和環(huán)境測試（e-typing ）也是全基因組策略的重要組成部分。 目前全基因

25、組策略的基本策略包括 （1） 基于種子 DNA 的基因型鑒定， 簡化分子標(biāo)記輔助選擇， 降低育種成本、 增加規(guī)模和提高效率 （ 2） 選擇性基因型鑒定和表型鑒定， 結(jié)合 DNA 混合池分析， 捕獲和育種相關(guān)的大多數(shù)重要因素， （ 3） 靈活的基因型鑒定系統(tǒng)（ 4）結(jié)合連鎖作圖和 LD 作圖的方法進行標(biāo)記 -性狀關(guān)聯(lián)分析（ 5）基于序 列進行分子標(biāo)記開發(fā)、等位基因發(fā)掘、基因功能研究和分子育種 。11 CRISPR/Cas9CRISPR-Cas 最初被發(fā)現(xiàn)是因為它作為細(xì)菌的適應(yīng)性免疫系統(tǒng)， 利用 RNA 引導(dǎo)的核酸酶來剪 切外來的基因元件。目前為止，在細(xì)菌和古生物中一共發(fā)現(xiàn)了三類 CRISPR 系

26、統(tǒng)，它們都由 Cas 基因、非編碼 RNA 和一個特殊的重復(fù)元件構(gòu)成的 CRISPR RNA （ crRNA ）陣列組成。 在利用 CRISPR/Cas9 系統(tǒng)進行基因編輯時， Cas9 可以被引導(dǎo)至不同目的基因的序列從而編輯不 同的目的基因。 此外，利用 CRISPR/Cas9 系統(tǒng)已經(jīng)在不同的生物體和細(xì)胞系中成功進行了基因編 輯，在這個過程中，為了保證基因編輯的最大成功率，通常要根據(jù)物種的不同，對 Cas9 要進行 優(yōu)化。CRISPR/Cas9 系統(tǒng)通過特異性設(shè)計針對目的基因序列20 個核苷酸大小的引物， 可以將 Cas9特異性地引導(dǎo)至目的基因序列，在操作時間上大大縮短。設(shè)計針對靶基因的引

27、物大約就花費 1-2 周時間，而目的基因敲除的細(xì)胞系在 2-3 周內(nèi)即可獲得； CRISPR/Cas9 系統(tǒng)也存在脫靶效應(yīng)。目 前為止，科研工作者對其主要缺點的解決辦法是，通過生物信息學(xué)預(yù)測出多個容易脫靶的潛在位 點，從而在 sgRNA 設(shè)計過程中避開這些潛在脫靶位點。12 請以抗蟲棉的研制為例，闡述基因工程育種的一般過程。（ 1）目的基因或 DNA 的獲得。獲得途徑：根據(jù)基因表達(dá)產(chǎn)物蛋白質(zhì)進行基因克隆從基因 組 DNA 或 mRNA 序列克隆基因；目前使用的棉花抗蟲基因的來源包括蘇云金芽孢桿菌的 Bt 基 因和胰蛋白酶抑制基因。（ 2）含有目的基因或 DNA 的重組質(zhì)粒的構(gòu)建。構(gòu)建步驟：從原

28、核生物中獲取目的基因的載體并 進行改造，利用限制內(nèi)切酶將載體切開，并用連接酶把目的基因連接到載體上，獲得 DNA 重組 體。（ 3）受體材料的選擇和再生系統(tǒng)的建立。良好的植物基因轉(zhuǎn)化受體系統(tǒng)應(yīng)滿足以下條件：高效 穩(wěn)定的再生能力；受體材料要有較高的遺傳穩(wěn)定性；具有穩(wěn)定的外植株來源；對篩選劑敏感。（ 4）轉(zhuǎn)基因方法的確定和外源基因的轉(zhuǎn)化：轉(zhuǎn)化方法包括基因槍法、農(nóng)桿菌介導(dǎo)法、花粉管通 道法。（ 5）轉(zhuǎn)化體的篩選與鑒定。為了有效選擇出這些真正的轉(zhuǎn)化細(xì)胞，必須使用特異性的選擇標(biāo)記 基因進行標(biāo)記，轉(zhuǎn)化體的鑒定根據(jù)檢測水平的不同分為 DNA 、轉(zhuǎn)錄水平和翻譯水平的鑒定。13 如何全面描述一個育種方法（如系譜、混合或輪回選擇）的流程？（ 1）系譜法，從雜種的第一次分離世代（單交F2 ，復(fù)交 F1 ）開始，進行連續(xù)性的單株選擇，直到選得性狀優(yōu)良而又整齊一致的系統(tǒng)，升入產(chǎn)量比較試驗。系譜法基本程序： a、雜種一代（F1）：以組合為小區(qū)種植， 每小區(qū) 30-50 株