RT-PCR在基因表達(dá)geneexpression檢測中的應(yīng)用

1、RT-PCRfc基因表達(dá)gene expression 檢測中的應(yīng)用基因表達(dá)的檢測有幾種方法.經(jīng)典的方法仍然重要是根據(jù)在細(xì)胞或生物體中所觀察到的生物化學(xué)或表型的變化來決定某一特定基因是否表達(dá).隨著大分子別離技 術(shù)的進(jìn)步使得特異的基因產(chǎn)物或蛋白分子的識別和別離成為可能.隨著重組DNA技術(shù) 的運用,現(xiàn)在有可能檢測.分析任何基因的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物.目前有好幾種方法廣泛應(yīng)用于 于研究特定RN酚子.這些方法包括原位雜交.NORTHERN交分析.打點或印跡打點.S- 1核酸酶分析和RNA!保護(hù)研究.這里描述RT-PCIMRNA平上檢 查基因表達(dá)的應(yīng)用.RT-PC檢測基因表達(dá)的問題討論關(guān)于RT-PC秋術(shù)方法的描述參

2、見PC殷術(shù)應(yīng)用進(jìn)展, 在此主要討論它在應(yīng)用中 的問題.理論上1L細(xì)胞質(zhì)總RNA寸稀有mRNA增是足夠了每個細(xì)胞有1個或幾個 拷貝.1L差不多相當(dāng)于50100, 000個典型哺乳動物細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中所含 RNA 的數(shù) 量,靶分子的數(shù)量通常大于50, 000,因此擴增是很容易的.該方法所能檢測 的最低 靶分子的數(shù)量可能與通常的DNAPCR同；例如它能檢測出單個RN股子.當(dāng) 量的 轉(zhuǎn)錄RNA用T7RNAI合酶體外合成經(jīng)一系列稀釋,實驗結(jié)果說明通過 P CR勺方法可 檢測出10個分子或低于10個分子,這是反映其靈敏度的一個實例.用 此技術(shù)現(xiàn)已從不至M個Philadelphia染色體陽性細(xì)胞株K562檢測

3、到了白血病特異 的MRNA轉(zhuǎn)錄子.因此沒必要別離polyA+RNA RNA/PCR有足夠的靈敏度來滿足 絕大多數(shù)實驗條件的需要.將PCR8沖液同時用于反轉(zhuǎn)錄酶反響和 PC©應(yīng),可簡化實驗步驟.我們發(fā)現(xiàn)整 個反響過程皆用PCR8沖液的結(jié)果相當(dāng)于或優(yōu)于先用反轉(zhuǎn)錄緩沖液合成 CDNA然后 PCR8沖液進(jìn)行PC曾增循環(huán).當(dāng)然,值得注意的是PCR8沖液并不最適合第一條DN A鏈的合成.我們對不同的緩沖液用于大片段DN的成是否成功還沒有進(jìn)行過嚴(yán)格 的研究.反轉(zhuǎn)錄酶的選擇似乎對實驗方法成功與否并不十分重要.BRU 口 BOEHRINGERMANN HEIMMULV轉(zhuǎn)錄酶進(jìn)行全面的研究,但沒有理由認(rèn)

4、為來源可靠的反轉(zhuǎn)錄酶不能 適用于該方法.在研究中,我們僅使用了 PERKINELMER/CETUS生產(chǎn)的TAo合 酶.cDNA1一條鏈的合成可用不規(guī)那么六聚體、寡聚dT或PCFF游引物來啟動反響如果用寡聚dT, 一般每次反響加0.1 nL就夠了.如果用下游寡核甘酸作為第一條 鏈的起始引物,10-50pmol最為理想.反轉(zhuǎn)錄反響以后,參加適量的上游和下游引 物進(jìn) 行PC©應(yīng)與用不規(guī)那么六聚體方法一樣.三種啟動方法中無論用那一種最后得 到的擴增產(chǎn)物都同樣理想.而參加不規(guī)那么六聚體似乎更容易得到前后一致的結(jié)果,且靶序列的合成量通常最多E.S,K.參加不規(guī)那么六聚體方法一樣.三種啟動方法 中

5、無論用那一種最后得到的擴增產(chǎn)物都同樣理想.而參加不規(guī)那么六聚體似站更容 易得到事一致的結(jié) 果,且靶序列的合成量通常最多E.S.K.未發(fā)表.第一條鏈合 成完畢,不必加堿或RN服以除去RN覦板.95c熱處理使反轉(zhuǎn)錄酶失活,同時也 使RNA-DNA合子變性. 不必加堿或RN題以除去RN梗板.95c熱處理使反轉(zhuǎn)錄酶 失活,同時也使RNA-DNA合子變性.殘留的RNA©板似乎對PC©應(yīng)無干擾.尋找使PCFR應(yīng)產(chǎn)生良好擴增結(jié)果的最低濃度的寡核甘酸引物是十分重要的. 我 們發(fā)現(xiàn)過量的引物通常會產(chǎn)生許多阻礙隨后分析的額外擴增產(chǎn)物.濃度為 5pmol 的引物可得到非常清楚及有效的擴增產(chǎn)物.當(dāng)

6、然,最好是找到你要擴增的每個序 列的最正確 引物量.沒有必要用全部的cDN版應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行PCIT增.可取等分量cDNA 樣品用幾組 不同的引物作PC用析；例如：一份cDNAe應(yīng)物可用于研究幾種不同類型 的RNA cDN版應(yīng)物通常用PCRg沖液衡釋5音.將cDNA勺濃度隆低至0.2mM此濃 度更適于Ta鄲合 酶.dNT豚度不應(yīng)超過0.2mM由于較高濃度的dDTl®Ta鄲合酶 的錯誤摻入或突變率 增高.對于擴增來說,即使dNTP勺濃度低到0.05mMl不會出 現(xiàn)問題.鎂離子濃度對反響十分重要,因此應(yīng)注意將鎂的摩爾濃度保持恒定.有時核酸 溶 于含ImMEDTA緩沖液中,EDTAT殲螯合大多數(shù)

7、鎂離子.通常,PC©應(yīng)中游離 鎂離子濃度應(yīng)保持在2mM將PCRA1環(huán)次數(shù)減少,不可防止地產(chǎn)生許多非特異性的擴增產(chǎn)物.很容易將長 度 不同的DNA勺擴增.即使基因組序列得到擴增,當(dāng)引物與大小不同的外顯子結(jié)合 時,很容易將長度不同的MRNA基因組的產(chǎn)物區(qū)別一來.如果不了解基因組的結(jié) 構(gòu),選用 與5'編碼基因間隔300-400bp的引物,脊椎動物的外顯子很少大于 300-40 0bp,因此很 容易從不同的外顯子中導(dǎo)出引物.如果所研究的基因無內(nèi)含子、或者 研究完整原病毒RNA專錄,為了獲得有關(guān)PCR勺結(jié)果有必要用DNA!徹底處理RNA 只要有很少量的基因 組DN荷染,用此方法分析就會

8、出現(xiàn)假陽性結(jié)果.實際應(yīng)用舉例基因表達(dá)檢測用該方法先后擴增,檢測了許多不同類型的細(xì)胞、組織和器官的mRNA當(dāng)然,僅 僅檢測mRNA沒有新奇之處,它的新奇在于能對 10-1000個細(xì)胞的RNAJ行分析. 所需起始物質(zhì)比通常的低很多,這使得研究者能設(shè)計并進(jìn)行以前看是不可能進(jìn)行 的實驗.例如研究血細(xì)胞生成的研究人員經(jīng)常用群體分析確定生長因子或環(huán)境對 特殊細(xì)胞系發(fā) 育的影響.經(jīng)常部到的一個問題是：群體細(xì)胞產(chǎn)生的何種生長/分化 因子會影響其本身 的發(fā)育.現(xiàn)在可以確信,利用RNA/PC技術(shù)能夠?qū)?shù)百個群體的 mRNA任何與生長或分化有關(guān)的因子進(jìn)行分析.而用常規(guī)的雜交或抗體檢測方法 來分析它們是極其困難、甚至

9、是不可能的.RNA/PC技術(shù)在研究轉(zhuǎn)基因動物方面將 非常有用.我們常常不僅要 知道在動物體內(nèi)轉(zhuǎn)移的基因是否表達(dá),而且要知道是在哪些細(xì)胞.組織或器官中表 達(dá).隨著RNA/PC檢測靈敏度的提升,能夠檢測轉(zhuǎn)基 因動物的多個部位而不必為取樣而將它處死.我們還可以列舉許多這樣的例子, 但我們留給讀者一些有關(guān)檢測方面的設(shè)想.用于診斷的RN符列的擴增在許多情況下,一個特異性的RN給子可作為感染或遺傳/癌疾病的診斷.在反 轉(zhuǎn)錄病毒疾病領(lǐng)域中,檢測與具有侵染活性密切相關(guān)的反轉(zhuǎn)錄病毒RNAS因組或特異轉(zhuǎn)錄子是否存在是非常重要的.現(xiàn)已對 HIV-1病人,HTLV-1, 2以及Moloney Mul V的細(xì)胞株進(jìn)行了

10、研究.也可以用RNA/PCR較容易地檢測出常見的感冒病毒即人 鼻病毒.對RNAfDDNAI毒的RNA專錄子的分析有利于對病毒的潛伏期,復(fù)制期等生 活周期進(jìn)行研究.在某些類型的癌細(xì)胞中有新的mRN表達(dá).如慢性骨髓性白血病CML.某些急 性 淋巴白血病ALL和急性骨髓白血病AML,只在病人的白細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)有嵌合的 m RNA BCR-ABL此嵌合mRNA診斷此類疾病存在的良好依據(jù).在許多月中瘤的治療 過程中,月中瘤細(xì)胞對化學(xué)治療具有抗性.DNA平的擴增并不一定導(dǎo)致表達(dá)的增加, 但大量相應(yīng)的mRN閭存在那么使表達(dá)增加.DNA平的擴增并不一定導(dǎo)致表達(dá)的增加, 但大量相應(yīng)的cDNA勺存在那么使表達(dá)增加.用

11、RNA/PCR法來分析復(fù)合抗藥性MDR1 0基因和 胸腺核甘酸合成酶TS基因,發(fā)現(xiàn)了這mRAN平的增高.突變的RAS癌基 因的mRNA析見參考文獻(xiàn)25綜術(shù)述在癌癥的診斷或預(yù)測方面具有診斷價值.mRNA分析比常規(guī)的DNA基因組分析有優(yōu)越之處.由于沒有內(nèi)含子序列干擾mRNA擴增,因此可以僅用一 組引物就能夠擴增H-, K-,和N-RASE個mRNA列E.S.K ,未發(fā) 表.這樣便可以比擬 容易地檢測出第12、13和61密碼的突變,這些突變被認(rèn)為是 發(fā)生癌的原因.癌癥誘因的檢測在下面將列舉數(shù)個RNA/PCR增方法的主要應(yīng)用.首先是對鼠鳥氨酸氨甲棧基 轉(zhuǎn)移酶mRNA行亞克隆來確定缺失點突變的位置.同樣

12、,該方法可用于檢測哺乳 動物細(xì) 胞mRN轉(zhuǎn)錄后的剪接,研究與HL賬病相關(guān)性因素,分析人HPRT!變,研究 自身免疫 與T細(xì)胞受體序列之間的關(guān)系,分析人堿性磷酸脂酶的突變,研究土撥鼠 肝炎病毒引 發(fā)的c-myc活性,確定刺桐丁蛋白4.1mRNAj剪接變異,等等.根據(jù)已發(fā)表的序列合成擴增mRN閭引物,我們發(fā)現(xiàn)用RNA/PCR獲取cDNA勺最 簡 便的方法.用在5末端帶有限制性內(nèi)切酶位點的引物來擴增 mRNA一局部或全 部編碼區(qū)域.擴增后,PC*物經(jīng)適宜的酶切并與適于表達(dá)的載體連接或制備成探 針.按此 方法可在一星期內(nèi)完成從RN解品到用于高效表達(dá)的修飾cDNAS隆.這比 常規(guī)的合成/篩選cDNAg,亞克隆靶cDNA為到達(dá)表達(dá)目的而對克隆進(jìn)行誘變等過 程要簡單得多.區(qū)別主要在于用于擴增和別離cDN度隆的引物為簡并引