聚乳酸-羥基乙酸共聚物 硅酸鈣三維多孔骨組織工程支架的構(gòu)建與性能

1、www.CRTER.org胡露，等. 聚乳酸-羥基乙酸共聚物/硅酸鈣三維多孔骨組織工程支架的構(gòu)建與性能聚乳酸-羥基乙酸共聚物/硅酸鈣三維多孔骨組織工程支架的構(gòu)建與性能胡 露1，2，3，魏 坤1，鄒 芬1，2，3 (1華南理工大學(xué)材料科學(xué)與工程學(xué)院，廣東省廣州市 510640；2國(guó)家人體組織功能重建工程技術(shù)研究中心，廣東省廣州市 510006；3廣東省生物醫(yī)學(xué)工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東省廣州市 510006)引用本文：胡露，魏坤，鄒芬. 聚乳酸-羥基乙酸共聚物/硅酸鈣三維多孔骨組織工程支架的構(gòu)建與性能J.中國(guó)組織工程研究，2016，20(47):6997-7005.DOI: 10.3969/j.iss

2、n.2095-4344.2016.47.001 ORCID: 0000-0002-2694-4478(魏坤)文章快速閱讀：聚乳酸-羥基乙酸共聚物/硅酸鈣三維多孔骨組織工程支架的構(gòu)建胡露，女，1991年生，湖北省咸寧市人，漢族，2016年華南理工大學(xué)材料科學(xué)與工程學(xué)院畢業(yè)，碩士，主要從事生物醫(yī)用材料研究。通訊作者：魏坤，教授，華南理工大學(xué)生物科學(xué)與工程學(xué)院，廣東省廣州市 510640中圖分類號(hào):R318文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼:A文章編號(hào):2095-4344(2016)47-06997-09稿件接受：2016-09-01采用3D- Bioplotter制備聚乳酸-羥基乙酸共聚物三維多孔支架結(jié)果表明：聚乳酸-羥

3、基乙酸共聚物/硅酸鈣復(fù)合多孔支架具有良好的體外降解性能、力學(xué)性能及生物相容性檢測(cè)支架的組成成分、形貌、降解性能、力學(xué)性能及細(xì)胞相容性采用低溫融合技術(shù)將微球與支架結(jié)合，制備聚乳酸-羥基乙酸共聚物/硅酸鈣復(fù)合多孔支架通過(guò)乳液溶劑揮發(fā)法制備聚乳酸-羥基乙酸共聚物/硅酸鈣多孔復(fù)合微球文題釋義：聚乳酸-羥基乙酸共聚物：被廣泛用于骨組織工程支架材料，具有良好的生物相容性和降解性，但作為一種人工合成的高分子材料，其也有一定的缺陷，如本身的骨傳導(dǎo)性較弱、降解產(chǎn)物偏酸性容易引起炎癥反應(yīng)及機(jī)械強(qiáng)度不夠等。聚乳酸-羥基乙酸共聚物/硅酸鈣三維多孔骨組織工程支架：實(shí)驗(yàn)首先在聚乳酸-羥基乙酸共聚物微球中加入硅酸鈣，制得了

4、具有良好生物相容性和降解性的多孔聚乳酸-羥基乙酸共聚物/硅酸鈣復(fù)合微球，然后采用生物3D打印設(shè)備3D-Bioplotter，利用熔融沉積制造的原理制備了具有三維連通多孔結(jié)構(gòu)的聚乳酸-羥基乙酸共聚物支架；最后利用低溫融合技術(shù)將聚乳酸-羥基乙酸共聚物/硅酸鈣復(fù)合微球與聚乳酸-羥基乙酸共聚物支架結(jié)合起來(lái)，預(yù)期構(gòu)建出一種具有良好生物相容性、降解性、機(jī)械強(qiáng)度和三維連通多孔結(jié)構(gòu)的新型骨組織工程支架。摘要背景：目前的聚乳酸-羥基乙酸共聚物(poly(lactic-co-glycolic acid)，PLGA)支架材料存在降解產(chǎn)物呈酸性、力學(xué)性能低、孔隙率低、孔徑小、孔隙之間的連通率不佳、支架的幾何形狀不易控

5、制等缺陷。目的：構(gòu)建具有三維連通多孔結(jié)構(gòu)的PLGA/硅酸鈣骨組織工程支架材料，測(cè)試其體外降解性能、力學(xué)性能及生物相容性。方法：先通過(guò)乳液溶劑揮發(fā)法制備PLGA/硅酸鈣多孔復(fù)合微球，3D-Bioplotter制備PLGA三維多孔支架，然后采用低溫融合技術(shù)將微球與支架結(jié)合，制備PLGA/硅酸鈣復(fù)合多孔支架。檢測(cè)PLGA/硅酸鈣多孔復(fù)合微球與PLGA微球的組成成分、形貌及降解性能，檢測(cè)PLGA三維多孔支架與PLGA/硅酸鈣復(fù)合多孔支架的形貌、孔隙及壓縮強(qiáng)度。分別采用PLGA/硅酸鈣多孔復(fù)合微球與PLGA微球浸提液，含PLGA三維多孔支架與PLGA/硅酸鈣復(fù)合多孔支架的培養(yǎng)液培養(yǎng)小鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞，

6、1，3，5 d后檢測(cè)細(xì)胞增殖活性。結(jié)果與結(jié)論：微球形貌及降解性能：硅酸鈣組分的加入，有助于PLGA微球形成表面規(guī)則孔結(jié)構(gòu)和內(nèi)部空腔結(jié)構(gòu)，以及提高PLGA微球降解的pH值；支架結(jié)構(gòu)：PLGA/硅酸鈣復(fù)合多孔支架的纖維直徑與支架孔徑均小于PLGA三維多孔支架；支架孔隙：PLGA/硅酸鈣復(fù)合多孔支架的孔隙率與平均孔徑均小于PLGA三維多孔支架；支架力學(xué)性能：PLGA/硅酸鈣復(fù)合多孔支架的壓縮強(qiáng)度與壓縮模量高于PLGA三維多孔支架(P < 0.05)；細(xì)胞相容性：骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞在兩種微球浸提液和兩種支架上的生長(zhǎng)狀況良好；結(jié)果表明：PLGA/硅酸鈣復(fù)合多孔支架具有良好的體外降解性能、力學(xué)性能及生

7、物相容性。關(guān)鍵詞：生物材料；骨生物材料；硅酸鈣；PLGA；復(fù)合微球；生物3D打印；組織工程；多孔支架；骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞；生物相容性；降解性能；力學(xué)性能3 P.O.Box 1200,Shenyang 110004 kf23385083Hu Lu, Master, School of Material Science and Engineering, South China University of Technology, Guangzhou 510640, Guangdong Province, China; National Engineering Research Center for T

8、issue Restoration and Reconstruction, Guangzhou 510006, Guangdong Province, China; Guangdong Provincial Key Laboratory of Biomedical Engineering, Guangzhou 510006, Guangdong Province, ChinaCorresponding author: Wei Kun, Professor, School of Material Science and Engineering, South China University of

9、 Technology, Guangzhou 510640, Guangdong Province, China主題詞：支架(骨科)；微球體；組織工程基金資助：廣東省級(jí)科技計(jì)劃項(xiàng)目(2015A020214005)資助縮略語(yǔ)：聚乳酸-羥基乙酸共聚物：poly(lactic-co-glycolic acid)，PLGAConstruction and characteristics of poly(lactic-co-glycolic acid)/calcium silicate scaffolds with three-dimensional pores for bone tissue engi

10、neeringHu Lu1, 2, 3, Wei Kun1, Zou Fen1, 2, 3 (1School of Material Science and Engineering, South China University of Technology, Guangzhou 510640, Guangdong Province, China; 2National Engineering Research Center for Tissue Restoration and Reconstruction, Guangzhou 510006, Guangdong Province, China;

11、 3Guangdong Provincial Key Laboratory of Biomedical Engineering, Guangzhou 510006, Guangdong Province, China)AbstractBACKGROUND: Some disadvantages exsist in commonly used poly(lactic-co-glycolic acid) (PLGA) scaffolds, including acidic degradation products, suboptimal mechanical properties, low por

12、e size, poor porosity and pore connectivity rate and uncontrollable shape.OBJECTIVE: To construct a scaffold with three-dimensional (3D) pores by adding calcium silicate to improve the properties of PLGA, and then detect its degradability, mechanical properties and biocompatibility.METHODS: PLGA/cal

13、cium silicate porous composite microspheres were prepared by the emulsion-solvent evaporation method, and PLGA 3D porous scaffold was established by 3D-Bioplotter, and then PLGA/calcium silicate composite porous scaffolds were constructed by combining the microspheres with the scaffold using low tem

14、perature fusion technology. The compositions, morphology and degradability of the PLGA/calcium silicate porous composite microspheres and PLGA microspheres, as well as the morphology, pore properties and compression strength of the PLGA 3D scaffolds and PLGA/calcium silicate composite porous scaffol

15、ds were measured, respectively. Mouse bone marrow mesenchymal stem cells were respectively cultivated in the extracts of PLGA/calcium silicate porous composite microspheres and PLGA microspheres, and then were respectively seeded onto the PLGA 3D scaffolds and PLGA/calcium silicate composite porous

16、scaffolds. Thereafter, the cell proliferation activity was detected at 1, 3 and 5 days.RESULTS AND CONCLUSION: Regular pores on the PLGA microspheres and internal cavities were formed, and the PH values of the degradation products were improved after adding calcium silicate. The fiber diameter, pore

17、, porosity and average pore size of the composite porous scaffolds were all smaller than those of the PLGA scaffolds. The compression strength and elasticity modulus of the composite porous scaffolds were both higher than those of the PLGA scaffolds (P < 0.05). Bone marrow mesenchymal stem cells

18、grew well in above microsphere extracts and scaffolds. These results indicate that PLGA/calcium silicate composite porous scaffolds exhibit good degradability in vitro, mechanical properties and biocompatibility.Subject headings: Braces; Microspheres; Tissue EngineeringFunding: the Guangdong Provinc

19、ial Science and Technology Program, No. 2015A020214005Cite this article: Hu L, Wei K, Zou F. Construction and characteristics of poly(lactic-co-glycolic acid)/calcium silicate scaffolds with three-dimensional pores for bone tissue engineering. Zhongguo Zuzhi Gongcheng Yanjiu. 2016;20(47):6997-7005.7

20、001ISSN 2095-4344 CN 21-1581/R CODEN: ZLKHAH0 引言 Introduction隨著組織工程學(xué)的提出和發(fā)展，組織工程材料在臨床上的優(yōu)勢(shì)日益顯著，骨組織工程支架是目前臨床應(yīng)用最有前景的組織工程成果之一。理想的骨組織工程支架材料應(yīng)當(dāng)具備良好的生物相容性、合適的生物降解吸收性、合適的孔隙率和三維立體多孔結(jié)構(gòu)、可控的三維外形、與置入部位組織的力學(xué)性能相匹配的機(jī)械強(qiáng)度及良好的加工性能等特點(diǎn)1。聚乳酸-羥基乙酸共聚物(poly(lactic-co-glycolic acid)，PLGA)被廣泛用于骨組織工程支架材料，具有良好的生物相容性和降解性2-3，但作為一種人

21、工合成的高分子材料，其也有一定的缺陷，如本身的骨傳導(dǎo)性較弱、降解產(chǎn)物偏酸性容易引起炎癥反應(yīng)及機(jī)械強(qiáng)度不夠等4-5。為了彌補(bǔ)PLGA的不足，將其與具有骨誘導(dǎo)性的無(wú)機(jī)生物陶瓷，如羥基磷灰石、生物玻璃、磷酸三鈣、碳酸鈣等復(fù)合，使其與人體骨結(jié)構(gòu)和功能更為接近，是目前的研究熱點(diǎn)6-8。有研究表明，硅元素是促進(jìn)新骨生成的媒介之一9，能促進(jìn)骨組織細(xì)胞的增殖和分化，硅酸鈣粉體或陶瓷能夠釋放硅離子，在體外具有良好生物活性和誘導(dǎo)類骨羥基磷灰石沉積的能力10-11，目前硅酸鈣陶瓷已被作為新的骨修復(fù)生物陶瓷加以研究12-14。傳統(tǒng)的組織工程支架制備方法主要有相分離法、氣體發(fā)泡法、模板法、粒子瀝濾法、顆粒燒結(jié)法、靜電紡

22、絲技術(shù)等，但上述方法一般只能制備孔徑小于200 m的支架，且有的支架幾何形狀不易精確控制、孔隙率小、孔隙之間的連通率不佳15-16。隨著制造業(yè)的不斷發(fā)展，近幾年出現(xiàn)的3D打印技術(shù)在很大程度上解決了傳統(tǒng)支架制備技術(shù)的不足，它能夠根據(jù)不同患者的需求制備個(gè)性化的支架材料，并能同時(shí)精確控制支架的幾何外形和微觀結(jié)構(gòu)，在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域特別是組織工程應(yīng)用具有獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)，因此受到廣大研究學(xué)者們的青睞17-21。綜上考慮，實(shí)驗(yàn)首先在PLGA微球中加入硅酸鈣，制得了具有良好生物相容性和降解性的多孔PLGA/硅酸鈣復(fù)合微球，然后采用生物3D打印設(shè)備3D-Bioplotter，利用熔融沉積制造的原理制備了具有三維連通多

23、孔結(jié)構(gòu)的PLGA支架；最后利用低溫融合技術(shù)將PLGA/硅酸鈣復(fù)合微球與PLGA支架結(jié)合起來(lái)，預(yù)期構(gòu)建出一種具有良好生物相容性、降解性、機(jī)械強(qiáng)度和三維連通多孔結(jié)構(gòu)的新型骨組織工程支架。1 材料和方法 Materials and methods 1.1 設(shè)計(jì) 支架制備及觀察實(shí)驗(yàn)。1.2 時(shí)間及地點(diǎn) 實(shí)驗(yàn)于2014年9月至2015年12月在華南理工大學(xué)國(guó)家人體組織功能重建工程技術(shù)研究中心完成。1.3 材料 PLGA(共聚組分比例5050，相對(duì)分子質(zhì)量31 000，濟(jì)南岱罡生物工程有限公司)；聚乙烯醇1788型(醇解度87%-89%，上海阿拉丁試劑有限公司)；二氯甲烷(分析純，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司

24、)；硅酸鈉、硝酸鈣(均為分析純，天津市大茂化學(xué)試劑廠)；CWF通用型馬弗爐(英國(guó)CARBOLITE公司)；S312-90數(shù)顯恒速攪拌器(上海梅穎浦儀器儀表制造有限公司)；3D-Bioplotter生物打印機(jī)(德國(guó)Envision TEC公司)；101-A型數(shù)顯電熱鼓風(fēng)干燥箱(上海錦屏儀器儀表有限公司)；小鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(ATCC)；胎牛血清(Gibco澳洲)；DEME培養(yǎng)基、0.25%胰酶(Gibco)；CCK-8試劑盒(日本同仁化學(xué)研究所)；細(xì)胞培養(yǎng)箱、Thermo3001酶標(biāo)儀(美國(guó)Thermo公司)。1.4 實(shí)驗(yàn)方法1.4.1 PLGA/硅酸鈣復(fù)合多孔支架的制備 PLGA/硅酸鈣復(fù)合

25、微球的制備：硅酸鈣粉末采用化學(xué)沉淀法制備而成，具體方法參考文獻(xiàn)22。將1 g PLGA溶解于5 mL二氯甲烷中，加入硅酸鈣粉末(0，0.1，0.2，0.3 g)持續(xù)攪拌6 h，超聲處理30 min，得到分散均勻的s/o乳液；將該s/o乳液注射至10 g/L聚乙烯醇溶液中，在280 r/min下持續(xù)攪拌12 h，使二氯甲烷揮發(fā)，乳化過(guò)程在室溫進(jìn)行；乳化結(jié)束后，收集粒徑范圍為100-300 m的固化微球，并用去離子水反復(fù)沖洗5遍以上，除去微球表面殘留的聚乙烯醇；然后冷凍干燥 48 h，得到多孔結(jié)構(gòu)的PLGA/硅酸鈣復(fù)合微球，放入干燥箱中儲(chǔ)存?zhèn)溆谩榱藴p少實(shí)驗(yàn)誤差，除特別說(shuō)明外，以下所用的PLGA/

26、硅酸鈣復(fù)合微球中的硅酸鈣含量均為20%。PLGA三維多孔支架的制備：利用計(jì)算機(jī)輔助設(shè)計(jì)(CAD)軟件設(shè)計(jì)出長(zhǎng)、寬、高分別為10 mm、10 mm、6 mm的三維支架模型，導(dǎo)入Bioplotter RP中進(jìn)行分層處理；將1 g PLGA加入3D-Bioplotter生物打印機(jī)的高溫不銹鋼料筒中，升溫至150 至PLGA熔融，設(shè)置平臺(tái)溫度為室溫，擠出壓力為0.1 MPa，擠出速度6 mm/s，內(nèi)部結(jié)構(gòu)為0°和90°交錯(cuò)排列，選用直徑為0.4 mm的針頭，然后啟動(dòng)3D-Bioplotter將三維多孔結(jié)構(gòu)的PLGA支架模型逐層打印成型。PLGA/硅酸鈣復(fù)合多孔支架的制備：將2.5

27、g PLGA/硅酸鈣復(fù)合微球加入5 mL去離子水中，并輕輕振蕩使復(fù)合微球完全浸濕并分散均勻，得到50%(w/v)的微球分散液；將PLGA三維多孔支架浸沒(méi)于微球分散液中，并置于37 、90 r/min的搖床中搖晃20 min，使微球均勻分散于支架三維多孔結(jié)構(gòu)的空隙中；然后將支架放入 50 烘箱，24 h后取出，即得PLGA/硅酸鈣復(fù)合多孔支架。1.4.2 PLGA/硅酸鈣復(fù)合微球的性能測(cè)試組成成分分析：用X射線衍射分析復(fù)合微球中的無(wú)機(jī)組分：將樣品置于玻璃載物臺(tái)上后轉(zhuǎn)移至荷蘭帕納科公司的Empyrean銳影X射線衍射儀中，利用Cu靶 K 射線以1 (°)/min速率掃描，掃描范圍10&#

28、176;-70°。用傅里葉變換紅外光譜儀進(jìn)一步分析復(fù)合微球的化學(xué)組成：首先將樣品與KBr一同研磨壓成薄片，然后將薄片轉(zhuǎn)移至德國(guó)Bruker公司VERCTOR-22型傅里葉變換紅外光譜儀中掃描，掃描范圍4 000-400 cm-1，分辨率2 cm-1。形貌觀察：用掃描電鏡觀察復(fù)合微球的表面形貌和內(nèi)部結(jié)構(gòu)。將微球浸沒(méi)在OTC包埋劑中，用德國(guó)Leica公司的CM1900 Cryostat冷凍切片機(jī)于-20 將微球切片，厚度為20 m，去離子水洗去殘留的包埋劑并收集微球，冷凍干燥48 h，然后將切片后的微球和未切片的微球分別用導(dǎo)電膠固定于載物臺(tái)，噴金90 s后轉(zhuǎn)移至德國(guó)蔡司公司的Merlin

29、場(chǎng)發(fā)射掃描電鏡中觀察。體外降解產(chǎn)物pH值測(cè)試：分別稱取PLGA微球和PLGA/硅酸鈣復(fù)合微球50 mg，浸沒(méi)在裝有10 mL PBS(pH=7.2)的離心管中，將離心管轉(zhuǎn)移至90 r/min的37 恒溫恒濕搖床中，在設(shè)定時(shí)間點(diǎn)取出離心管，用上海雷磁新涇儀器公司的PHS-3C型精密pH計(jì)測(cè)量釋放介質(zhì)的pH值，樣品重復(fù)數(shù)為3。1.4.3 PLGA/硅酸鈣復(fù)合多孔支架的性能測(cè)試形貌觀察：采用日本HiroX公司的7700型三維顯微鏡觀察支架的宏觀結(jié)構(gòu)、纖維尺寸和孔徑大小，掃描電鏡觀察支架表面的微觀形貌。孔隙特征分析：采用英國(guó)Metris公司的HARRIER HP23.4JX型Micro-CT對(duì)支架結(jié)構(gòu)

30、進(jìn)行掃描重建，比較PLGA三維多孔支架與PLGA/硅酸鈣復(fù)合多孔支架的孔徑大小、孔徑分布情況、孔隙率和孔隙連通率。將樣品置于樣品架上，掃描獲取連續(xù)Micro-CT圖像，獲取二維片層灰度圖后通過(guò)軟件建立出三維支架模型圖，利用灰度閾值確定支架的孔隙邊界，計(jì)算支架的孔徑大小、孔隙率和孔隙連通率，輸出支架模型圖和孔徑分布圖。壓縮強(qiáng)度測(cè)試：采用美國(guó)Instron公司的 5967型萬(wàn)能材料試驗(yàn)機(jī)測(cè)試支架的壓縮性能，比較PLGA三維多孔支架與PLGA/硅酸鈣復(fù)合多孔支架的壓縮強(qiáng)度。將長(zhǎng)、寬、高分別為10 mm、10 mm、6 mm的支架置于萬(wàn)能試驗(yàn)機(jī)平板的中心，以1 mm/min的恒定速率緩慢加壓，記錄力與

31、位移的數(shù)據(jù)并轉(zhuǎn)換成應(yīng)力與應(yīng)變，樣品重復(fù)數(shù)為5。1.4.5 體外細(xì)胞相容性測(cè)試 分別測(cè)試小鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞在PLGA/硅酸鈣復(fù)合微球浸提液、PLGA三維多孔支架和PLGA/硅酸鈣復(fù)合多孔支架上的增殖情況。材料準(zhǔn)備和消毒：參照國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)GB/T 16886.12- 2005進(jìn)行。將1.4 g PLGA微球和PLGA與硅酸鈣質(zhì)量比為10.1、10.2、10.3的PLGA/硅酸鈣復(fù)合微球分別用體積分?jǐn)?shù)75%乙醇溶液浸泡2 h，紫外光照射30 min消毒滅菌，然后用PBS洗滌5遍，浸泡于7 mL無(wú)血清培養(yǎng)基中，置于37 、60 r/min搖床48 h，取上清液并按比例添加體積分?jǐn)?shù)10%胎牛血清，即得微球

32、浸提液。分別將長(zhǎng)、寬、高為10 mm、10 mm、6 mm的傳統(tǒng)熱燒結(jié)法制備的PLGA微球支架，具體方法參考文獻(xiàn)23。將3D-Bioplotter制備的PLGA三維多孔支架和PLGA/硅酸鈣復(fù)合多孔支架用離心管裝好密封，在15 kGy輻照劑量下用射線消毒處理。細(xì)胞培養(yǎng)和種植：用上述微球浸提液對(duì)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞進(jìn)行擴(kuò)增。在96孔板中每孔加入100 L (1×108 L-1)細(xì)胞懸液，放入培養(yǎng)箱12 h，待細(xì)胞完全貼壁后將孔板中的培養(yǎng)基吸出，加入100 L/孔上述微球浸提液，放入37 、體積分?jǐn)?shù)5%CO2、95%濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；用含有體積分?jǐn)?shù)10%胎牛血清的高糖DEME培養(yǎng)基對(duì)骨髓間

33、充質(zhì)干細(xì)胞進(jìn)行擴(kuò)增。將支架放入24孔板中，加入無(wú)血清培養(yǎng)基浸泡24 h后，將孔板中的培養(yǎng)基吸出，每孔加入200 L(5×108 L-1)細(xì)胞懸液，放入培養(yǎng)箱2 h，待大部分細(xì)胞黏附于支架上以后，每孔補(bǔ)充培養(yǎng)基至1 mL，將孔板放入37 、體積分?jǐn)?shù)5%CO2、95%濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞的增殖活性：微球浸提液培養(yǎng)細(xì)胞：在預(yù)定時(shí)間點(diǎn)，將CCK-8原液用培養(yǎng)基按體積比1/10稀釋得到工作液，吸去孔板中的培養(yǎng)基，每孔加入100 L工作液，在培養(yǎng)箱中培養(yǎng)1 h后，輕微混勻，用酶標(biāo)儀在450 nm波長(zhǎng)處測(cè)定各孔的吸收值。支架接種細(xì)胞：在預(yù)定時(shí)間點(diǎn)，將CCK-8原液用培養(yǎng)基按體積

34、比1/10稀釋得到工作液，吸去孔板中的培養(yǎng)基，每孔加入1 mL工作液浸沒(méi)支架，在培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2 h后，吸取 200 L上清工作液至96孔板中，輕微混勻，用酶標(biāo)儀在450 nm波長(zhǎng)處測(cè)定各孔的吸收值。1.5 主要觀察指標(biāo) PLGA/CS復(fù)合微球的形貌特征、體外降解性能和細(xì)胞相容性；PLGA/CS復(fù)合多孔支架的形貌特征、孔隙結(jié)構(gòu)、抗壓強(qiáng)度和細(xì)胞相容性。1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS 22.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，計(jì)量數(shù)據(jù)用±s表示，組間比較采用完全隨機(jī)化設(shè)計(jì)兩獨(dú)立樣本的t 檢驗(yàn)，以P < 0.05為差異有顯著性意義。2 結(jié)果 Results 2.1 PLGA/硅酸鈣復(fù)合微球的組

35、成成分分析 圖1中圓點(diǎn)標(biāo)注的位置依次為(400)、(002)、(-202)、(202)、(320)，對(duì)照X射線衍射標(biāo)準(zhǔn)JCPDS卡片數(shù)據(jù)可知，它們是硅酸鈣的特征峰，在PLGA/硅酸鈣譜圖中，硅酸鈣的特征峰均存在，說(shuō)明微球中存在硅酸鈣；由圖2可以看出，在PLGA/硅酸鈣復(fù)合微球的譜圖中，1 762， 1 170 cm-1附近出現(xiàn)的2個(gè)峰分別為酯鍵和C-O鍵的特征吸收峰，而3 000，2 956 cm-1附近出現(xiàn)的2個(gè)較大的吸收峰，分別為-CH3和-CH2-的伸縮振動(dòng)吸收，且PLGA的其他特征峰均存在，說(shuō)明復(fù)合微球中含有PLGA；而在1 077，477 cm-1附近出現(xiàn)的2個(gè)吸收峰，分別為Si-O

36、-Si鍵的伸縮振動(dòng)吸收和彎曲振動(dòng)吸收24，1 006，945，891，682，643，567，477 cm-1附近出現(xiàn)的特征吸收峰與-CaSiO3的譜圖基本一致25-26，說(shuō)明復(fù)合微球中也存在硅酸鈣。由于PLGA有機(jī)組分的存在，硅酸鈣在復(fù)合微球中的特征峰沒(méi)有單一組分的尖銳。2.2 PLGA微球和PLGA/硅酸鈣復(fù)合微球的形貌和結(jié)構(gòu) 由圖3可知，微球保持著良好的球形結(jié)構(gòu)，大部分微球的粒徑在200 m左右，PLGA微球表面平整光滑(圖3A)，內(nèi)部為實(shí)心結(jié)構(gòu)(圖3B)；而PLGA/硅酸鈣復(fù)合微球表面則分布著大量開放孔結(jié)構(gòu)(圖3C)，形狀規(guī)則，分布均勻，絕大部分尺寸在1-10 m之間，且內(nèi)部存在較大空

37、腔(圖3D)，說(shuō)明硅酸鈣組分的加入有助于PLGA微球形成表面規(guī)則孔結(jié)構(gòu)和內(nèi)部空腔結(jié)構(gòu)。2.3 硅酸鈣組分對(duì)PLGA降解pH值的影響 圖4比較了PLGA微球和PLGA/硅酸鈣復(fù)合微球的體外降解介質(zhì)pH值變化情況，降解實(shí)驗(yàn)的前15 d，兩組微球的pH值基本維持在7.4左右，且相差不大；15 d后，PLGA微球介質(zhì)的pH值迅速下降，而PLGA/硅酸鈣復(fù)合微球的下降較為緩慢；在第40天時(shí)，PLGA微球介質(zhì)的pH值下降至2.6左右，而PLGA/硅酸鈣復(fù)合微球的仍可維持在6左右，結(jié)果表明，硅酸鈣組分的加入對(duì)PLGA的酸性降解產(chǎn)物有一定的中和作用。圖5進(jìn)一步比較了不同含量硅酸鈣對(duì)PLGA微球體外降解介質(zhì)pH

38、值的影響，在降解的前15 d內(nèi)，20%組和30%組的降解介質(zhì)pH值都有一個(gè)明顯的升高然后再降低的過(guò)程，而10%組基本維持在7.4左右；15 d后，3組pH值都開始緩慢降低，其中10%組下降最為緩慢；到降解的第60天，10%組的pH值降低至3左右，而20%和30%組的pH值比10%略高0.5。說(shuō)明硅酸鈣對(duì)PLGA微球體外降解介質(zhì)pH值的中和作用主要發(fā)生在前15 d內(nèi)。2.4 PLGA三維多孔支架和PLGA/硅酸鈣復(fù)合多孔支架的結(jié)構(gòu)特征 如圖6所示，PLGA/硅酸鈣支架的尺寸比PLGA支架略小(圖6A)；PLGA支架的纖維直徑和孔徑約為600 m和800 m(圖6B)，而PLGA/硅酸鈣支架的纖維

39、直徑和支架孔徑約為500 m和750 m(圖6C)，均小于PLGA支架，且兩種支架的纖維直徑均大于所用針頭直徑0.4 mm，說(shuō)明在打印過(guò)程中出現(xiàn)了纖維擠出脹大現(xiàn)象，低溫融合技術(shù)制備PLGA/硅酸鈣復(fù)合多孔支架的過(guò)程中，支架尺寸又出現(xiàn)了一定程度的回縮；從支架的掃描電鏡圖片可以看出，PLGA支架保持良好的三維連通多孔結(jié)構(gòu)(圖6D)，在PLGA/硅酸鈣支架中，微球均勻地分散在支架的孔道之間，同時(shí)與支架保持較好的孔隙結(jié)構(gòu)(圖6E)；在PLGA/硅酸鈣支架200倍掃描電鏡圖中，微球已與支架融合，同時(shí)單一微球表面仍良好地保留著多孔形貌(圖6F)。2.5 Micro-CT構(gòu)建三維多孔支架模型和孔隙特征 利用

40、Micro-CT對(duì)支架掃描重建，得到支架的結(jié)構(gòu)模型和孔徑分布圖(圖7)，PLGA支架的平均孔隙率、孔隙連通率及平均孔徑分別為31.35%、100%、0.32 mm，PLGA/CS支架的平均孔隙率、孔隙連通率及平均孔徑分別為24.09%、99.88%、0.17 mm。由圖7可知，兩支架的孔隙均完全連通，孔隙在支架中分布較均勻；PLGA支架的孔徑主要分布在0.4-0.5 mm，同時(shí)還出現(xiàn)較多的小于0.1 mm的孔洞(圖7C)，這部分小孔可能是由于邊緣效應(yīng)造成的；而在PLGA/CS支架中，由于多孔微球的加入，除了0.4-0.5 mm孔洞外，更多的出現(xiàn)了小于0.2 mm的孔洞(圖7D)；對(duì)兩支架的孔隙

41、率、孔隙連通率和平均孔徑加以比較發(fā)現(xiàn)，PLGA/硅酸鈣支架的孔隙率和平均孔徑均比PLGA支架小，而兩支架的孔隙連通率幾乎都為100%。以上結(jié)果說(shuō)明，利用低溫融合技術(shù)將PLGA/硅酸鈣復(fù)合多孔微球與PLGA三維多孔支架成功組裝成具有完全連通的梯度多級(jí)孔結(jié)構(gòu)的復(fù)合支架。2.6 支架的力學(xué)性能測(cè)試結(jié)果 圖8比較了PLGA支架和PLGA/CS支架的壓縮力學(xué)性能，在形變?yōu)?%、10%、15%時(shí)，PLGA支架的壓縮強(qiáng)度分別為0.11，1.66， 4.08 MPa，而PLGA/硅酸鈣支架對(duì)應(yīng)的壓縮強(qiáng)度為0.66，3.34，7.89 MPa(圖8A)；PLGA支架的壓縮強(qiáng)度和壓縮模量分別為4.17，22.74

42、 MPa，而PLGA/硅酸鈣支架的壓縮強(qiáng)度和壓縮模量分別為11.57，88.71 MPa(圖8B)。結(jié)果表明，與PLGA支架相比，PLGA/硅酸鈣支架的力學(xué)性能顯著提高。2.7 材料的體外細(xì)胞相容性 圖9A比較了骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞在不同硅酸鈣含量PLGA/硅酸鈣微球浸提液中的增殖情況，第1-5天，所有組別吸光度一直升高，隨著微球中硅酸鈣含量的增加，浸提液對(duì)細(xì)胞增殖率的作用總體呈略微增加趨勢(shì)，但與不含硅酸鈣的PLGA微球衍射強(qiáng)度(a.u)強(qiáng)度10 20 30 40 50 60 70 Position(2 Theta)圖1 硅酸鈣和聚乳酸-羥基乙酸共聚物/硅酸鈣復(fù)合微球的X射線衍射圖譜Figure

43、1 X-ray graphs of calcium silicate and poly(lactic-co-glycolic acid)/calcium silicate composite microspheres圖注：聚乳酸-羥基乙酸共聚物/硅酸鈣復(fù)合微球中存在硅酸鈣的特征峰。圖2 硅酸鈣、聚乳酸-羥基乙酸共聚物微球和聚乳酸-羥基乙酸共聚物硅酸鈣復(fù)合微球的紅外圖譜Figure 2 Infrared spectrum of calcium silicate, poly(lactic-co-glycolic acid) microspheres, poly(lactic-co-glycolic

44、 acid)/calcium silicate composite microspheres圖注：聚乳酸-羥基乙酸共聚物/硅酸鈣復(fù)合微球中存在硅酸鈣的特征峰。4 000 3 500 3 000 2 500 2 000 1 500 1 000 500波長(zhǎng)(cm-1)DCB A圖3 聚乳酸-羥基乙酸共聚物微球和聚乳酸-羥基乙酸共聚物/硅酸鈣復(fù)合微球的掃描電鏡圖Figure 3 Morphology of poly(lactic-co-glycolic acid) microspheres and poly(lactic-co-glycolic acid)/calcium silicate comp

45、osite microspheres under scanning electron microscpe圖注：圖中A、B分別為聚乳酸-羥基乙酸共聚物微球的表面與橫截面形貌；C、D為聚乳酸-羥基乙酸共聚物/硅酸鈣復(fù)合微球的表面與橫截面形貌。87654320 10 20 30 40 50 60 聚乳酸-羥基乙酸共聚物微球聚乳酸-羥基乙酸共聚物/硅酸鈣pH值876543時(shí)間(d)0 5 10 15 20 25 30 35 40時(shí)間(d)圖4 聚乳酸-羥基乙酸共聚物微球和聚乳酸-羥基乙酸共聚物/硅酸鈣復(fù)合微球體外降解介質(zhì)的pH值變化Figure 4 Changes of pH values of in

46、 vitro degradation media of poly(lactic-co-glycolic acid) microspheres and poly(lactic-co-glycolic acid)/calcium silicate composite microspheres圖注：兩組20 d后的pH值比較差異有顯著性意義(P < 0.05)。圖5 含不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)硅酸鈣聚乳酸-羥基乙酸共聚物/硅酸鈣復(fù)合微球體外降解介質(zhì)的pH值變化Figure 5 Changes of pH values of in vitro degradation media of poly(lactic

47、-co-glycolic acid)/calcium silicate composite microspheres with different contents of calcium silicate10%20%30%pH值比較差異均無(wú)顯著性意義，說(shuō)明細(xì)胞可以在不同硅酸鈣含量的PLGA微球浸提液中正常生長(zhǎng)，硅酸鈣組分的加入對(duì)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的增殖有一定的促進(jìn)作用，但效果不顯著；圖9B為骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞在PLGA支架和PLGA/硅酸鈣支架上的增殖情況，以傳統(tǒng)熱燒結(jié)法制備的PLGA微球支架作為對(duì)照組，由圖可知，細(xì)胞在3組支架上均可穩(wěn)定生長(zhǎng)，說(shuō)明3組支架均具有良好的生物相容性；從單個(gè)時(shí)間點(diǎn)來(lái)看，

48、3D-Bioplotter制備PLGA組7005ISSN 2095-4344 CN 21-1581/R CODEN: ZLKHAHB APLGA MSPLGA 3DPLGA 3D+PC20時(shí)間(d)1 3 5 0.20abababaaaP0PC10PC20PC30時(shí)間(d)1 3 5 3.02.52.01.51.00.50圖9 聚乳酸-羥基乙酸共聚物/硅酸鈣微球和支架的體外細(xì)胞相容性Figure 9 The cytocompatibility of the poly(lactic-co-glycolic acid)/calcium silicate comp

49、osite microspheres and the scaffolds in vitro圖注：圖中A為骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞在不同硅酸鈣含量的聚乳酸-羥基乙酸共聚物/硅酸鈣復(fù)合微球浸提液中的增殖情況；B為骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞在聚乳酸-羥基乙酸共聚物支架和聚乳酸-羥基乙酸共聚物/硅酸鈣復(fù)合支架上的增殖情況。P0為純聚乳酸-羥基乙酸共聚物微球；PC10為硅酸鈣含量為10%的聚乳酸-羥基乙酸共聚物/硅酸鈣復(fù)合微球；PC20為硅酸鈣含量為20%的聚乳酸-羥基乙酸共聚物/硅酸鈣復(fù)合微球；PC30為硅酸鈣含量為30%的聚乳酸-羥基乙酸共聚物/硅酸鈣復(fù)合微球；PLGA MS為傳統(tǒng)熱燒結(jié)法制備的PLGA微球支架；PL

50、GA 3D為3D-Bioplotter制備的三維多孔PLGA支架；PLGA 3D+PC20為3D-Bioplotter制備的硅酸鈣含量為20%的聚乳酸-羥基乙酸共聚物/硅酸鈣復(fù)合支架。與PLGA MS比較，aP < 0.05；與PLGA 3D+PC20比較，bP < 0.05。圖7 聚乳酸-羥基乙酸共聚物支架和聚乳酸-羥基乙酸共聚物/硅酸鈣支架的孔隙特征圖Figure 7 The pore property of the poly(lactic-co-glycolic acid) scaffold and poly(lactic-co-glycolic acid)/calcium

51、silicate composite scaffold圖注：圖中A為聚乳酸-羥基乙酸共聚物支架的micro-CT模型；B為聚乳酸-羥基乙酸共聚物/硅酸鈣復(fù)合支架的micro-CT模型；C為聚乳酸-羥基乙酸共聚物支架的孔徑分布；D為聚乳酸-羥基乙酸共聚物/硅酸鈣復(fù)合支架的孔徑分布。DCB AFEDC A圖6 聚乳酸-羥基乙酸共聚物支架和聚乳酸-羥基乙酸共聚物/硅酸鈣復(fù)合支架的結(jié)構(gòu)特征Figure 6 The structure of the poly(lactic-co-glycolic acid) scaffolds and poly(lactic-co-glycolic acid)/calc

52、ium silicate composite scaffolds圖注：圖中A為兩種支架的宏觀形貌圖；B為聚乳酸-羥基乙酸共聚物支架的三維顯微鏡圖；C為聚乳酸-羥基乙酸共聚物/硅酸鈣復(fù)合微球的三維顯微鏡圖；D為聚乳酸-羥基乙酸共聚物支架的掃描電鏡圖(×30)；E、F為聚乳酸-羥基乙酸共聚物/硅酸鈣復(fù)合支架的掃描電鏡圖(×30，×100)。壓縮強(qiáng)度壓縮模量a強(qiáng)度(MPa)100806040200 A(MPa)(%)a聚乳酸-羥基乙酸共聚物聚乳酸-羥基乙酸共聚物/硅酸鈣5 10 15109876543210聚乳酸-羥基乙酸共聚物 圖8 聚乳酸-羥基乙酸共聚物支架和聚乳酸

53、-羥基乙酸共聚物/硅酸鈣支架的力學(xué)性能Figure 8 Mechanical properties of the poly(lactic-co-glycolic acid) scaffold and poly(lactic-co-glycolic acid)/calcium silicate composite scaffold圖注：圖中A為應(yīng)力值，B為壓縮模量與壓縮強(qiáng)度。與聚乳酸-羥基乙酸共聚物支架比較，aP < 0.05。Baa聚乳酸-羥基乙酸共聚物/硅酸鈣 A值A(chǔ)值的細(xì)胞數(shù)明顯高于其他兩組，PLGA/硅酸鈣組的細(xì)胞數(shù)也顯著高于傳統(tǒng)熱燒結(jié)法制備的PLGA微球支架，說(shuō)明PLGA三維多孔

54、支架和PLGA/硅酸鈣復(fù)合多孔支架比傳統(tǒng)熱燒結(jié)法制備的PLGA微球支架更有利于骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的增殖，其原因可能是高的孔隙率、孔隙連通率和較大的孔徑更有利于細(xì)胞的長(zhǎng)入。3 討論 Discussion人體的骨組織是一個(gè)非常復(fù)雜而精密的系統(tǒng)，在化學(xué)成分上，主要由有機(jī)物和無(wú)機(jī)物構(gòu)成27。有機(jī)相在成骨過(guò)程中扮演著重要的作用，其中約95%是型膠原，其余5%主要是蛋白多糖和少量非膠原蛋白；無(wú)機(jī)相的主要成分是納米羥基磷灰石，可提供骨較好的力學(xué)強(qiáng)度。因此，將可降解的生物高分子材料和無(wú)機(jī)生物陶瓷復(fù)合起來(lái)制備的骨修復(fù)材料是骨組織工程研究的熱點(diǎn)。PLGA是一種可降解和易加工的生物高分子材料，在組織工程領(lǐng)域已得到廣泛

55、應(yīng)用，然而由于其降解產(chǎn)物呈酸性、機(jī)械強(qiáng)度不足和表面缺乏有利于細(xì)胞黏附的結(jié)合位點(diǎn)等缺陷，有必要對(duì)PLGA進(jìn)行改性研究。有研究分別將生物活性玻璃、羥基磷灰石和殼聚糖顆粒加入PLGA微球支架中，得到的復(fù)合支架具有更高的生物活性；有研究將介孔硅與PLGA復(fù)合，制備的介孔硅/PLGA復(fù)合微球支架力學(xué)性能較純PLGA微球支架有了很大的提升；有研究利用碳酸鈣原位成孔法制備了表面有均勻開孔結(jié)構(gòu)的PLGA/碳酸鈣復(fù)合微球，證實(shí)了微球表面的微孔形貌有利于細(xì)胞黏附和增殖。硅酸鈣陶瓷能夠釋放硅離子，具有良好的生物活性和降解性能，目前已被作為最具前景的骨修復(fù)生物陶瓷之一廣泛研究。骨支架作為骨組織再生的框架，為種子細(xì)胞提

56、供生長(zhǎng)環(huán)境，其孔徑大小、孔隙率等參數(shù)直接影響細(xì)胞的生存、遷移、增殖和代謝功能，在組織工程中起著關(guān)鍵性的作用。有研究表明，當(dāng)支架孔徑大于300 m時(shí)更有利于細(xì)胞的遷移和增殖；考慮成骨效應(yīng)，小孔可提供低氧的環(huán)境誘導(dǎo)骨形成前的軟骨生成，而大孔更有利于血管的生成和直接成骨。因此實(shí)驗(yàn)旨在構(gòu)建一種梯度多級(jí)孔結(jié)構(gòu)的骨組織工程支架，首先將硅酸鈣陶瓷加入PLGA微球中，利用硅酸鈣原位成孔制備了PLGA/硅酸鈣多孔復(fù)合微球，其表面孔徑為1-10 m；然后采用3D-Bioplotter生物打印技術(shù)制備出三維連通多孔結(jié)構(gòu)的PLGA支架，其平均孔徑約為320 m；最后利用低溫融合技術(shù)將具有微孔表面的PLGA/硅酸鈣復(fù)合微球和連通大孔結(jié)構(gòu)的PLGA三維多孔支架結(jié)合起來(lái)，構(gòu)建出一種梯度多級(jí)孔結(jié)構(gòu)的新型骨組織工程支架。PLGA/硅酸鈣多孔復(fù)合微球利用乳液溶劑揮發(fā)法制備，其X射線衍射和紅外圖譜中都能觀察到硅