PCR 技術的種類及其應用

1、PCR 技術的種類及其應用 1 PCR 技術的基本原理PCR 技術是在模板DNA、引物和四種dNTP等存在的條件下, 依賴于DNA聚合酶(T aq 酶)的酶促合成反應。其具體反應分三步：變性、退火、聚合。以上三步為一個循環(huán)， 每一循環(huán)的產物DNA又可以作為下一個循環(huán)模板，數小時后，介于兩個引物之間的目的DNA得到了大量的復制，經2530次循環(huán)DNA數量可達2×1067拷貝數。2PCR技術的種類2.1 反向PCR( Inverse PCR, IPCR)技術原理：反向PCR是克隆已知序列旁側序列的一種方法主要原理是用一種在已知序列中無切點的限制性內切酶消化基因組I)NA后酶切片段自身環(huán)化

2、以環(huán)化的DNA作為模板，用一對與已知序列兩端特異性結合的引物，擴增夾在中間的未知序列。該擴增產物是線性的DNA片段，大小取決于上述限制性內切酶在已知基閑側翼DNA序列內部的酶切位點分布情況。用不同的限制性內切酶消化，可以得到大小不同的模板DNA，再通過反向PCR獲得未知片段 。該方法的不足是：需要從許多酶中選擇限制酶，或者說必須選擇一種合適的酶進行酶切才能得到合理大小的DNA片段。這種選擇不能在非酶切位點切斷靶DNA。大多數有核基因組含有大量中度和高度重復序列，而在YAC或Cosmid中的未知功能序列中有時也會有這些序列，這樣，通過反向PCR得到的探針就有可能與多個基因序列雜交。2.2錨定PC

3、R(Anchored PCR, APCR)技術用酶法在一通用引物反轉錄cDNA3-末端加上一段已知序列, 然后以此序列為引物結合位點對該cDNA進行擴增, 稱為APCR。應用：它可用于擴增未知或全知序列, 如未知cDNA的制備及低豐度cDNA文庫的構建。2.3不對稱PCR(asymmetric PCR)技術兩種引物濃度比例相差較大的PCR技術稱不對稱PCR。在擴增循環(huán)中引入不同的引物濃度, 常用50100÷1比例。在最初的1015個循環(huán)中主要產物還是雙鏈DNA, 但當低濃度引物被消耗盡后, 高濃度引物介導的PCR反應就會產生大量單鏈DNA。應用：可制備單鏈DNA片段用于序列分析或核酸

4、雜交的探針。2.4反轉錄PCR(reverse transcription, RT- PCR)技術當擴增模板為RNA時, 需先通過反轉錄酶將其反轉錄為cDNA才能進行擴增。RT - PCR應用非常廣泛, 無論是分子生物學還是臨床檢驗等都經常采用。2.5修飾引物PCR技術為達到某些特殊應用目的, 如定向克隆、定點突變、體外轉錄及序列分析等, 可在引物的5-端加上酶切位點、突變序列、轉錄啟動子及序列分析結合位點等 。2.6巢式PCR(NEST PCR)技術先用一對靶序列的外引物擴增以提高模板量, 然后再用一對內引物擴增以得到特異的PCR帶, 此為巢式PCR。若用一條外引物作內引物則稱之為半巢式PC

5、R。為減少巢式PCR的操作步驟可將外引物設計得比內引物長些, 且用量較少, 同時在第一次PCR時采用較高的退火溫度而第二次采用較低的退火溫度, 這樣在第一次PCR時, 由于較高退火溫度下內引物不能與模板結合, 故只有外引物擴增產物, 經過若干次循環(huán), 待外引物基本消耗盡, 無需取出第一次PCR產物, 只需降低退火即可直接進行PCR擴增。這不僅減少操作步驟, 同時也降低了交叉污染的機會。這種PCR稱中途進退式PCR( drop-in, drop-out PCR)。上述三種方法主要用于極少量DNA模板的擴增。2.7等位基因特異性PCR(Allele- specificPCR, ASPCR)技術AS

6、PCR依賴于引物3- 端的一個堿基錯配,不僅減少多聚酶的延伸效率,而且降低引物-模板復合物的熱穩(wěn)定性。這樣有點突變的模板進行PCR擴增后檢測不到擴增產物,可用于檢測基因點突變。2.8單鏈構型多態(tài)性PCR(single- strandconformational polymorphism PCR, SSCPPCR)技術SSCP- PCR是根據形成不同構象的等長DNA單鏈在中性聚丙烯酰胺凝膠中的電泳遷移率變化來檢測基因變異。在不含變性劑的中性聚丙烯酰胺凝膠中,單鏈DNA遷移率除與DNA長度有關外,更主要取決于DNA單鏈所形成的空間構象, 相同長度的單鏈DNA因其順序不同或單個堿基差異所形成的構象就

7、會不同,PCR產物經變性后進行單鏈DNA凝膠電泳時, 每條單鏈處于一定的位置,靶DNA中若發(fā)生堿基缺失、插入或單個堿基置換時,就會出現泳動變位,從而提示該片段有基因變異存在。2. 9低嚴格單鏈特異性引物PCR (Lowstringencysingle specific primer PCR, LSSP- PCR)技術LSSP - PCR 是建立在PCR 基礎上的又一種新型基因突變檢測技術。要求是“二高一低”, 高濃度的單鏈引物( 5- 端/ 3- 端引物均可),約4. 8Lmol,高濃度的Taq 酶( 16Lmol/ 100ml) , 低退火溫度( 30),所用的模板必須是純化的DNA片段。在

8、這種低嚴格條件下, 引物與模板間發(fā)生不同程度的錯配, 形成多種大小不同的擴增產物, 經電泳分離后形成不同的帶型。對同一目的基因而言, 所形成的帶型是固定的, 因而稱之為“基因標簽”。這是一種檢測基因突變或進行遺傳鑒定的快速敏感方法。2.10復合PCR(multiplex PCR)技術在同一反應中用多組引物同時擴增幾種基因片段,如果基因的某一區(qū)段有缺失,則相應的電泳譜上這一區(qū)帶就會消失。復合PCR主要用于同一病原體的分型及同時檢測多種病原體、多個點突變的分子病的診斷。2.11重組PCR技術重組PCR技術是在兩個PCR擴增體系中, 兩對引物分別由其中之一在其5-端和3-端引物上帶上一段互補的序列,

9、混合兩種PCR擴增產物,經變性和復性,兩組PCR產物互補序列發(fā)生粘連,其中一條重組雜合鏈能在PCR 條件下發(fā)生聚合延伸反應,產生一個包含兩個不同基因的雜合基因。2.12隨機引物擴增技術(arbitrary primedPCR, AP- PCR)AP-PCR技術通過隨意設計或選擇一個非特異性引物,在PCR反應體系中,首先在不嚴格條件下使引物與模板中許多序列通過錯配而復性。如果在兩條單鏈上相距一定距離有反向復性引物存在,則可經Taq酶的作用使引物延伸而發(fā)生DNA片段的擴增, 經一至數輪不嚴格條件下的PCR循環(huán)后,再于嚴格條件下進行擴增。擴增的產物經DNA測序凝膠電泳分離后,經放射性自顯影或熒光顯示

10、即可得到DNA指紋圖。AP-PCR用于腫瘤的抑制基因、癌基因的分離；菌種、菌株及不同物種的鑒定；遺傳作圖；不同分化程度或某些不同狀態(tài)下的組織的基因表達差異等方面的研究。2.13 差示PCR (differential PCR, d -PCR)技術d-PCR可以定量檢測標本靶基因的拷貝數。它是將目的基因和一個單拷貝的參照基因置于一個試管中進行PCR擴增。電泳分離后呈兩條區(qū)帶,比較兩條區(qū)帶的豐度,或在引物5- 端標記上放射性核素后,通過檢測兩條區(qū)帶放射性強度即可測出目的基因的拷貝數。2.14定量PCR(quantitative PCR, qPCR)技術qPCR技術是用合成的RNA作為內標來檢測PC

11、R擴增目的mRNA的量,涉及目的mRNA和內標用相同的引物共同擴增,但擴增出不同大小片段的產物,可容易地電泳分離。一種內標可用于定量多種不同目的mRNA。qPCR可用于研究基因表達,能提供特定DNA基因表達水平的變化,在癌癥、代謝紊亂及自身免疫性疾病的診斷和分析中很有價值。2.15 競爭性PCR(competitive PCR, c-PCR)技術c-PCR技術是競爭cDNA模板與目的cDNA 同時擴增,使用同樣的引物,但一經擴增后, 能從這些目的cDNA區(qū)別開來。通常使用突變性競爭cDNA模板,其序列與目的cDNA序列相同,不過模板中僅有一個新內切位點或缺少內切位點,突變性的cDNA 模板可用

12、適當的內切酶水解,并用分光計測定其濃度。cDNA目的序列和競爭模板相對應的含量,可用溴化乙錠染色,電泳膠直接掃描進行測定,或摻入放射性同位素標記的方法測定。競爭模板開始時的濃度是已知的,則cDNA目的序列的最初濃度就能測定。這種方法能精確測定mRNA中cDNA靶序列,可用于幾個到10個細胞中mRNA 的定量。2.16半定量PCR(semiquantitative PCR,sq- PCR)技術sq-PCR不同于c-PCR的是參照物ERCC-2的PCR產物與目的DNA的PCR產物相似,并分別在試管中擴增。sq- PCR的流程為樣品和內參照RNA分別經反轉錄為cDNA,然后樣品cDNA和一系列不同量

13、參照cDNA分別在不同管進行擴增, PCR產物在瓊脂糖凝膠上電泳拍照,光密度計掃描,作出標準曲線,通過回歸公式便可定量表達的基因量。雖然管與管之間的擴增效率難以控制,但由PCR擴增的所有樣本和參照物在不同的實驗中差異很小。這種敏感的技術可用于其他低表達的基因定量2.17原位PCR( in situ PCR)技術原位PCR綜合了PCR 和原位雜交( Insitu hybridization, ISH) 的優(yōu)點,是一種在組織切片或細胞涂片上原位對特定的DNA或RNA進行擴增,再用特異性的探針原位雜交檢測。原位PCR標本一般需先經化學固定,以保持組織細胞的良好形態(tài)結構。細胞膜和核膜有一定的通透性,P

14、CR擴增所需的各種成分可進入細胞內或核內,在原位對特定的DNA或RNA進行擴增。擴增產物由于分子量較大或互相交織, 不易透過細胞膜向外彌散, 故保留在原位。這樣就很容易應用ISH將其檢出,同時還可對目的DNA序列的組織細胞進行形態(tài)學分析。2.18免疫PCR(immuno PCR)技術抗原-抗體反應與PCR技術的結合產生了免疫PCR，是目前為止最為敏感的檢測方法,理論上可測到一個抗原分子的存在。通過用一個具有對DNA和抗體雙重結合活性的連接分子,使作為標記物的DNA分子特異地結合到Ag- Ab復合物上，從而形成Ag- Ab- DNA復合物，附著的DNA標記物可用適宜的引物進行PCR擴增。特異性P

15、CR產物的存在證明DNA標記物分子特異地附著于Ag - Ab復合物上，進而證明有Ag存在。吳自榮等將Ab通過化學交聯(lián)劑直接連接到分子上構建成Ab-DNA探針,組成免疫PCR檢測新模式，具有高度靈敏和特異性。免疫PCR可對流行性傳染病( 如肝炎、愛滋病等)進行檢測，檢測體液中致癌基因和癌基因表達的微量蛋白等。2.19長片段PCR(long-PCR)技術長片段PCR是用高質量模板DNA保證其完整性,引物應較長( 2134bp)，使用高的退火溫度及錯配率更低的酶，將無3-5外切酶活性的DNA聚合酶和低濃度有3- 5外切酶活性的DNA聚合酶組合使用，緩沖體系通過提高Tris的濃度或改用Tricine緩

16、沖液以增強緩沖能力，并調高體系的pH。熱循環(huán)參數總的來說需增加延伸時間，一般1kb/ min，同時采用熱啟動。長片段PCR在限制性片段多態(tài)性及單體型分析、染色體基因步移、DNA序列分析及基因突變的鑒定等方面得到應用。3 PCR技術的應用3.1 PCR技術在農業(yè)中的應用3.1.1 PCR在轉基因產品檢測中的應用目前，相關研究人員已經利用PCR技術成功建立了檢測轉基因馬鈴薯、大豆和玉米的技術路線，對轉基因大豆和玉米的檢測低限分別到達了1和0.1。3.1.2 PCR在研究植作物生長發(fā)育方面的作用植物的生長、發(fā)育、分化和衰老都涉及許多基因的時空順序表達，因此研究這個過程中基因表達的變化是揭示生長發(fā)育機

17、理的重要手段。定量RT-PCR是研究植物基因表達水平變化的一項重要技術。通過研究不同植物或同意植物不同發(fā)育時期的基因表達水平來揭示植物生長發(fā)育的機理。3.1.3 PCR在作物抗病性基因分析、定位中的應用在作物病害研究中，作物抗病性及其機制研究一直是當今作物病理學和作物抗病育種中的熱點和焦點問題。而我們現在已經知道作物對病原物的抗性是由相對的基因所控制的，即被廣泛認可的基因對基因理論。因此，尋找與作物抗病性緊密連鎖的基因標記，即將抗病性基因進行定位的研究中具有十分重要的理論意義和實踐意義。利用PCR和RAPD技術能夠找到與抗性緊密連鎖的分子標記，并將其進行定位。3.2 PCR技術在食品科學中的應

18、用PCR技術在食品科學中主要用于對食品中微生物含量的檢測。應用PCR技術，只需數小時，就可以用電泳法檢測出來0.1mgDNA中僅含數個拷貝的模板序列；用PCR擴增細菌中保守的DNA片段，還可對那些人工無法培養(yǎng)的微生物進行檢測。3.3 PCR技術在醫(yī)學中的應用目前，全世界利用PCR技術診斷感染性疾病每年達幾千萬人次，可見其巨大的市場潛力。PCR技術主要用于腫瘤、遺傳病和感染性疾病的診斷。3.3.1 PCR在腫瘤診斷上的應用遺傳學改變主要是引起癌基因激活和抑癌基因的失活，使基因發(fā)生突變、缺失、增加和易位等而導致了細胞癌變。PCR不但能有效地檢測基因的突變、重排、易位等，而且能準確檢測癌基因表達量，可據此進行腫瘤早期診斷、鑒別、分型、分期、治療及預后評估等。