視瞻昏渺發(fā)病機理與VEGFbFGFPEDF表達(dá)

1、視瞻昏渺發(fā)病機理與VEGF、bFGF、PEDF表達(dá)【摘要】 目的：觀察脈絡(luò)膜新生血管（CNV）動物模型視網(wǎng)膜色素上皮至脈絡(luò)膜之間細(xì)胞因子VEGF、bFGF、PEDF表達(dá)的變化。方法：用半導(dǎo)體激光光凝建立CNV動物模型，于造模后1 w，2 w，3 w，4 w，8 w分別行免疫熒光檢查（FFA）；于造模后8 w處死動物行HE染色觀察視網(wǎng)膜和脈絡(luò)膜的病理組織學(xué)變化，免疫組化法檢測VEGF、bFGF、PEDF表達(dá)。結(jié)果：HE染色可見脈絡(luò)膜新生血管形成。造模后模型組VEGF、bFGF上調(diào)，VEGF/PEDF值升高，與正常對照組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.01）；PEDF值輕度上調(diào)，與正

2、常對照組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P0.05）。結(jié)論：半導(dǎo)體激光可誘導(dǎo)CNV動物模型，該模型可做為視瞻昏渺的動物模型進行實驗研究。 【關(guān)鍵詞】 視瞻昏渺；脈絡(luò)膜新生血管；新生血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子；堿性成纖維細(xì)胞生長因子；色素上皮衍生因子年齡相關(guān)性黃斑變性（AMD）屬于祖國醫(yī)學(xué)“視瞻昏渺”范疇，本病隨年齡增長，其發(fā)病率亦逐年升高。導(dǎo)致患者視力喪失的主要原因是繼發(fā)于滲出型年齡相關(guān)性黃斑變性（ESMD）的脈絡(luò)膜新生血管（CNV）。本病發(fā)病機理尚不明確, 治療十分困難。研究顯示，CNV的發(fā)生、發(fā)展和血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）、堿性

3、成纖維細(xì)胞生長因子（basic fibroblast growth factor，bFGF）、色素上皮衍生因子（pigment epithelium-derived factor，PEDF）等密切相關(guān)。因此,我們從基礎(chǔ)實驗研究著手，建立相關(guān)動物模型,對VEGF、bFGF、PEDF進行研究,以期探索本病的發(fā)病機理，為尋求有效的治療方案奠定實驗基礎(chǔ)。 1 材料與方法 1.1 實驗材料 成年青紫藍(lán)兔12只（約6月7月齡），普通級，體重（2 500±20）g。 1.2 實驗方法 1.2.1 造模方法 12只青紫藍(lán)兔隨機分為正常對照組和模型組兩組，每組6只。模型組以0.5%美多麗P滴眼液雙眼散

4、瞳，0.4%倍諾喜行眼表麻醉后,在全視網(wǎng)膜鏡下用半導(dǎo)體激光（波長532 nm）于視乳頭下方作視網(wǎng)膜光凝。照射部位位于視乳頭及髓線下方，以光凝后有氣泡產(chǎn)生為擊破Bruch膜的標(biāo)志 1。激光參數(shù)：功率625 mW750 mW，時間0.1 s，光斑直徑50 m，點數(shù)40點。 1.2.2 觀察指標(biāo)與檢查方法 于造模后1 w，2 w，3 w，4 w，8 w行FFA檢查。造模后8 w處死動物，取動物眼球置于10%中性福爾馬林液中，將固定好的眼球去除多余組織，留取激光斑部位眼球壁組織，正常對照組留取相應(yīng)部位組織，常規(guī)石蠟包埋、切片，行HE染色。VEGF、bFGF、PEDF免疫組化染色用SP法，光學(xué)顯微鏡下觀

5、察視網(wǎng)膜和脈絡(luò)膜組織學(xué)變化。造模8 w后采用Mias-2000型圖象分析系統(tǒng)測定VEGF、bFGF及PEDF陽性表達(dá)。 1.3 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS12.0統(tǒng)計軟件，組間比較采用t檢驗。 2 結(jié) 果 2.1 HE、VEGF、bFGF與PEDF染色結(jié)果 結(jié)果見圖1。 由圖1可以看出，HE染色正常對照組可見視網(wǎng)膜、脈絡(luò)膜的各層結(jié)構(gòu)整齊，細(xì)胞結(jié)構(gòu)正常。視網(wǎng)膜各層細(xì)胞著染正常，未見壞死、出血等結(jié)構(gòu)改變。視網(wǎng)膜神經(jīng)纖維層排列完整，細(xì)胞排列致密，內(nèi)核層無碎裂及細(xì)胞核減少，椎桿體細(xì)胞排列整齊，色素上皮細(xì)胞排列緊密；脈絡(luò)膜結(jié)構(gòu)完整，各層細(xì)胞著染正常。模型組可見視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞不同程度減少，內(nèi)顆粒層和外顆粒

6、層結(jié)構(gòu)不清，激光斑處色素上皮層基本消失，視網(wǎng)膜、脈絡(luò)膜黏附在一起，激光斑下可見成纖維細(xì)胞，其中可見CNV，其血管管徑較小，血管壁內(nèi)皮細(xì)胞核腫脹，較圓。正常對照組視網(wǎng)膜色素上皮至脈絡(luò)膜之間VEGF、bFGF、PEDF陽性表達(dá)較少，呈顆粒狀；模型組陽性表達(dá)較多，呈密集的顆粒狀及條帶狀，激光斑兩側(cè)視網(wǎng)膜脈絡(luò)膜VEGF、bFGF、PEDF陽性表達(dá)較集中。視網(wǎng)膜色素上皮至脈絡(luò)膜之間有棕黃色的顆粒，為bFGF陽性表達(dá)。正常對照組bFGF陽性表達(dá)較少，呈顆粒狀；模型組陽性表達(dá)較多，呈密集的顆粒狀及條帶狀，激光斑兩側(cè)視網(wǎng)膜脈絡(luò)膜bFGF、bFGF、PEDF陽性表達(dá)較集中。 2.2 VEGF 、bFGF及PED

7、F 陽性表達(dá)與VEGF/PEDF結(jié)果比較 結(jié)果見表1。由表1可見，造模后8 w與正常對照組比較，模型組VEGF、bFGF上調(diào)（P<0.01），PEDF值輕度上調(diào)，VEGF/PEDF值升高（P<0.01）。 3 討 論 早在諸病源候論中已有“目暗不明候”和“目茫茫候”的記載。證治準(zhǔn)繩在論述視瞻昏渺時曰：“若人年五十以外而昏者，雖治不復(fù)光明，其時猶月之過望，天真日衰，自然目光漸謝”；證治準(zhǔn)繩·七竅門中亦有云：“謂目內(nèi)外別無證候，但自視昏渺，蒙昧不清也。”目前本病尚無專門的動物模型，CNV是滲出型年齡相關(guān)性黃斑變性的主要臨床表現(xiàn)和致盲因素，因此可將CNV動物模型

8、作為視瞻昏渺實驗研究的基礎(chǔ)。 有學(xué)者提出CNV的發(fā)生首先是蛋白酶被激活，蛋白酶溶解了血管基底膜和周細(xì)胞外質(zhì)的蛋白，使之水解，微血管內(nèi)皮細(xì)胞通過血管基底膜浸潤、遷移進入臨近細(xì)胞外間質(zhì)形成新生血管芽，這些新生血管芽穿過破裂的Bruch膜向色素上皮下生長，進一步侵犯神經(jīng)上皮層，久之形成網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的新生血管膜。本實驗HE染色結(jié)果顯示，激光斑處的色素上皮層斷裂，為CNV的發(fā)生創(chuàng)造了前提條件，激光斑處可見管徑狹窄、內(nèi)皮細(xì)胞核圓的新生血管。 脈絡(luò)膜新生血管的發(fā)生機制尚未十分明了，一般認(rèn)為是多種因素共同作用的結(jié)果。其病理基礎(chǔ)是視網(wǎng)膜脈絡(luò)膜局部的缺血缺氧，造成脈絡(luò)膜微循環(huán)障礙及視網(wǎng)膜色素上皮功能異常，同時激發(fā)了各

9、種因子的活性，打破了多種因子間的平衡。在血管新生的調(diào)控機制上，受到血管新生促進因子和抑制因子的調(diào)控，正常情況下，血管新生的誘導(dǎo)與抑制處于平衡狀態(tài)，兩種因子的平衡使血管處于正常的生長狀態(tài)，一旦此平衡打破，就會激活血管系統(tǒng)發(fā)芽長出新生血管 2。VEGF和bFGF是血管新生的主要誘導(dǎo)因子，二者有協(xié)同作用。目前普遍認(rèn)為視網(wǎng)膜內(nèi)VEGF過度表達(dá)是引起視網(wǎng)膜內(nèi)及視網(wǎng)膜下新生血管形成的重要因素。本實驗用高能量、短曝光時間、小光斑的半導(dǎo)體激光誘發(fā)CNV模型，造成光凝部位局部的炎癥和缺血缺氧，而VEGF、bFGF免疫組化染色亦顯示模型組陽性表達(dá)高于正常對照組。據(jù)此推斷，半導(dǎo)體激光誘發(fā)CNV動物模型是通過VEGF

10、、bFGF的上調(diào)實現(xiàn)的，bFGF的表達(dá)與VEGF的表達(dá)走勢一致，二者起協(xié)同性作用促進血管新生。 PEDF屬于絲氨酸蛋白酶抑制超家族成員。PEDF最初是作為一種神經(jīng)營養(yǎng)因子被發(fā)現(xiàn)和認(rèn)識的，進一步研究發(fā)現(xiàn)PEDF除具有神經(jīng)營養(yǎng)作用外，還具有抑制血管生成的功能。體外培養(yǎng)人正常ARPE-19細(xì)胞和CNV-RPE細(xì)胞，分別檢測PEDF及其他血管生成抑制因子的濃度，發(fā)現(xiàn)PEDF及這些血管生成抑制因子并不如其他文獻所報道的降低下調(diào)，而是明顯上調(diào) 3。這可能與CNV晚期PEDF參與抑制其形成有關(guān)4。PEDF與VEGF之間的失衡在CNV形成中有重要意義。PEDF在晚期CNV的視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞中有高度上調(diào)的表達(dá)

11、，抑制CNV的發(fā)展 5。 兔眼半導(dǎo)體激光光凝后，動物實驗的CNV模型在FFA檢查時可見明顯的熒光滲漏，HE染色可見CNV形成，免疫組化VEGF、bFGF、PEDF檢查均有相應(yīng)的陽性表達(dá)，這種表現(xiàn)與ESMD發(fā)生的CNV在影像學(xué)及病理組織學(xué)方面均有相近之處，因此，可將此模型作為視瞻昏渺進一步實驗研究的基礎(chǔ)?！緟⒖嘉墨I】 1Dobi E T，Puliafito C A，Destro M A new model of experimental choroidal neovascularization in the ratJ. Arch Ophthalmol，1989，107（2）：264-269.2金惠銘，盧建，殷蓮華.細(xì)胞分子病理生理學(xué)M.鄭州：鄭州大學(xué)出版社，2002：267.3鄧鑫，周希璦.色素上皮衍生因子（PEDF）的研究進展J.臨床眼科雜志，2005，13（1）：377-380.4Martin G，Schlunck G，Hansen L L，et al.Differential expression of angioregulator