非無(wú)菌產(chǎn)品微生物限度檢查：微生物計(jì)數(shù)法

1、 質(zhì)量管理 ZLJGF-046-00 共12頁(yè) 第12頁(yè)湖南湘大獸藥有限公司工作標(biāo)準(zhǔn)文件題 目非無(wú)菌產(chǎn)品微生物限度檢查：微生物計(jì)數(shù)法標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程編 號(hào)ZLJGF-046-00修 定質(zhì)檢部審 核批 準(zhǔn)修定日期2016.12審核日期批準(zhǔn)日期頒發(fā)部門(mén)GMP辦公室頒發(fā)數(shù)量2 份生效日期分發(fā)部門(mén)質(zhì)檢部、檔案室文件頁(yè)數(shù)共11頁(yè)一、目的：為規(guī)定非無(wú)菌產(chǎn)品微生物限度檢查：微生物計(jì)數(shù)法的檢測(cè)方法和操作要求，特制定本操作規(guī)程。二、引用標(biāo)準(zhǔn)：中華人民共和國(guó)獸藥典（2015年版 一部 附錄P179）。三、適用范圍：適用于本公司檢品采用非無(wú)菌產(chǎn)品微生物限度檢查：微生物計(jì)數(shù)法的質(zhì)量檢測(cè)。四、責(zé)任者：理化分析員對(duì)本標(biāo)準(zhǔn)的實(shí)

2、施負(fù)責(zé)。五、正文：1簡(jiǎn)述：微生物計(jì)數(shù)法系用于能在有氧條件下生長(zhǎng)的嗜溫細(xì)菌和真菌的計(jì)數(shù)。當(dāng)本法用于檢查非無(wú)菌制劑及其原、輔料等是否符合規(guī)定的微生物限度標(biāo)準(zhǔn)時(shí)，應(yīng)按下述規(guī)定進(jìn)行檢驗(yàn)，包括樣品的取樣量和結(jié)果的判斷等。除另有規(guī)定外，本法不適用于活菌制劑的檢查。微生物計(jì)數(shù)試驗(yàn)環(huán)境應(yīng)符合微生物限度檢查的要求。檢驗(yàn)全過(guò)程必須嚴(yán)格遵守?zé)o菌操作，防止再污染，防止污染的措施不得影響供試品中微生物的檢出。單向流空氣區(qū)域、工作臺(tái)面及環(huán)境應(yīng)定期進(jìn)行監(jiān)測(cè)。如供試品有抗菌活性，應(yīng)盡可能去除或中和。供試品檢查時(shí), 若使用了中和劑或滅活劑，應(yīng)確認(rèn)其有效性及對(duì)微生物無(wú)毒性。供試液制備時(shí)如果使用了表面活性劑，應(yīng)確認(rèn)其對(duì)微生物無(wú)毒性

3、以及與所使用中和劑或滅活劑的相容性。2.計(jì)數(shù)方法計(jì)數(shù)方法包括平皿法、薄膜過(guò)濾法和最可能數(shù)法（Most-Probable-Number Method，簡(jiǎn)稱(chēng)MPN 法）。MPN 法用于微生物計(jì)數(shù)時(shí)精確度較差，但對(duì)于某些微生物污染量很小的供試品，MPN 法可能是更適合的方法。供試品檢查時(shí),應(yīng)根據(jù)供試品理化特性和微生物限度標(biāo)準(zhǔn)等因素選擇計(jì)數(shù)方法，檢測(cè)的樣品量應(yīng)能保證所獲得的試驗(yàn)結(jié)果能夠判斷供試品是否符合規(guī)定。所選方法的適用性須經(jīng)確認(rèn)。3.計(jì)數(shù)培養(yǎng)基適用性檢查和供試品計(jì)數(shù)方法適用性試驗(yàn)供試品微生物計(jì)數(shù)中所使用的培養(yǎng)基應(yīng)進(jìn)行適用性檢查。供試品的微生物計(jì)數(shù)方法應(yīng)進(jìn)行方法適用性試驗(yàn)，以確認(rèn)所采用的方法適合于該

4、產(chǎn)品的微生物計(jì)數(shù)。若檢驗(yàn)程序或產(chǎn)品發(fā)生變化可能影響檢驗(yàn)結(jié)果時(shí)，計(jì)數(shù)方法應(yīng)重新進(jìn)行適用性試驗(yàn)。表 1 試驗(yàn)菌液的制備和使用試驗(yàn)菌株試驗(yàn)菌液的制備計(jì)數(shù)培養(yǎng)基適用性檢查計(jì)數(shù)方法適用性試驗(yàn)需氧菌總數(shù)計(jì)數(shù)霉菌和酵母菌總數(shù)計(jì)數(shù)需氧菌總數(shù)計(jì)數(shù)霉菌和酵母菌總數(shù)計(jì)數(shù)金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)CMCC(B)26 003)胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基或胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基，培養(yǎng)溫度30 35，培養(yǎng)時(shí)間1824 小時(shí)胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基和胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基，培養(yǎng)溫度30 35，培養(yǎng)時(shí)間不超過(guò)3 天，接種量不大于100cfu胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基或胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基 （ MPN法），培養(yǎng)溫度

5、30 35，培養(yǎng)時(shí)間不超過(guò)3 天，接種量不大于100cfu銅綠假單胞菌（Pseudomonas aeruginosa） CMCC（B）10 104胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基或胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基，培養(yǎng)溫度30 35，培養(yǎng)時(shí)間1824 小時(shí)胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基和胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基，培養(yǎng)溫度30 35，培養(yǎng)時(shí)間不超過(guò)3 天，接種量不大于100cfu胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基或胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基 （ MPN法），培養(yǎng)溫度30 35，培養(yǎng)時(shí)間不超過(guò)3 天，接種量不大于100cfu枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)CMCC(B) 63 501胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基或胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基，培養(yǎng)溫度3

6、0 35，培養(yǎng)時(shí)間1824 小時(shí)胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基和胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基，培養(yǎng)溫度30 35，培養(yǎng)時(shí)間不超過(guò)3 天，接種量不大于100cfu胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基或胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基 （ MPN法），培養(yǎng)溫度30 35，培養(yǎng)時(shí)間不超過(guò)3 天，接種量不大于100cfu白色念珠菌(Candida albicans)CMCC(F) 98 001沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基或沙氏葡萄糖液體培養(yǎng)基，培養(yǎng)溫度20 25，培養(yǎng)時(shí)間23天胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基，培養(yǎng)溫度30 35，培養(yǎng)時(shí)間不超過(guò)5 天，接種量不大于100cfu沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基，培養(yǎng)溫度 2025，培養(yǎng)時(shí)間不超過(guò)5 天，接種量不大于100cfu胰酪

7、大豆胨瓊脂培養(yǎng)基（ MPN 法不適用），培養(yǎng)溫度3035，培養(yǎng)時(shí)間不超過(guò)5 天，接種量不大于100cfu沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基，培養(yǎng)溫度 2025，培養(yǎng)時(shí)間不超過(guò)5 天，接種量不大于100cfu黑曲霉(Aspergillusniger)CMCC(F) 98 003沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基或馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基，培養(yǎng)溫度2025，培養(yǎng)時(shí)間57天，或直到獲得豐富的孢子胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基，培養(yǎng)溫度30 35，培養(yǎng)時(shí)間不超過(guò)5天，接種量不大于100cfu沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基，培養(yǎng)溫度 2025，培養(yǎng)時(shí)間不超過(guò)5天，接種量不大于100cfu胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基（ MPN 法不適用），培養(yǎng)溫度3035，培養(yǎng)

8、時(shí)間不超過(guò)5天，接種量不大于100cfu沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基，培養(yǎng)溫度 2025，培養(yǎng)時(shí)間不超過(guò)5天，接種量不大于100cfu注：當(dāng)需用玫瑰紅鈉瓊脂培養(yǎng)基測(cè)定霉菌和酵母菌總數(shù)時(shí)，應(yīng)進(jìn)行培養(yǎng)基適用性檢查，檢查方法同沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基。3.1.菌種及菌液制備3.1.1菌種 試驗(yàn)用菌株的傳代次數(shù)不得超過(guò)5代（從菌種保藏中心獲得的干燥菌種為第0 代），并采用適宜的菌種保藏技術(shù)進(jìn)行保存，以保證試驗(yàn)菌株的生物學(xué)特性。計(jì)數(shù)培養(yǎng)基適用性檢查和計(jì)數(shù)方法適用性試驗(yàn)用菌株見(jiàn)表1。3.1.2菌液制備 按表1 規(guī)定程序培養(yǎng)各試驗(yàn)菌株。取金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、枯草芽孢桿菌、白色念珠菌的新鮮培養(yǎng)物，用pH7.0

9、無(wú)菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液或0.9%無(wú)菌氯化鈉溶液制成適宜濃度的菌懸液；取黑曲霉的新鮮培養(yǎng)物加入35ml 含0.05聚山梨酯80 的pH7.0 無(wú)菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液或0.9%無(wú)菌氯化鈉溶液，將孢子洗脫。然后，采用適宜的方法吸出孢子懸液至無(wú)菌試管內(nèi)，用含0.05聚山梨酯80 的pH7.0 無(wú)菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液或0.9%無(wú)菌氯化鈉溶液制成適宜濃度的黑曲霉孢子懸液。菌液制備后若在室溫下放置，應(yīng)在2 小時(shí)內(nèi)使用；若保存在28，可在24小時(shí)內(nèi)使用。黑曲霉孢子懸液可保存在28，在驗(yàn)證過(guò)的貯存期內(nèi)使用。3.1.3 陰性對(duì)照為確認(rèn)試驗(yàn)條件是否符合要求，應(yīng)進(jìn)行陰性對(duì)照試驗(yàn)， 陰性對(duì)照試驗(yàn)應(yīng)無(wú)菌生長(zhǎng)。如陰性

10、對(duì)照有菌生長(zhǎng)，應(yīng)進(jìn)行偏差調(diào)查。3.1.4 培養(yǎng)基適用性檢查微生物計(jì)數(shù)用的成品培養(yǎng)基、由脫水培養(yǎng)基或按處方配制的培養(yǎng)基均應(yīng)進(jìn)行培養(yǎng)基適用性檢查。按表1規(guī)定，接種不大于100cfu的菌液至胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基管或胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基平板或沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基平板，置表1 規(guī)定條件下培養(yǎng)。每一試驗(yàn)菌株平行制備2 管或2 個(gè)平皿。同時(shí)，用相應(yīng)的對(duì)照培養(yǎng)基替代被檢培養(yǎng)基進(jìn)行上述試驗(yàn)。被檢固體培養(yǎng)基上的菌落平均數(shù)與對(duì)照培養(yǎng)基上的菌落平均數(shù)的比值應(yīng)在0.5-2 范圍內(nèi)，且菌落形態(tài)大小應(yīng)與對(duì)照培養(yǎng)基上的菌落一致；被檢液體培養(yǎng)基管與對(duì)照培養(yǎng)基管比較，試驗(yàn)菌應(yīng)生長(zhǎng)良好。3.2計(jì)數(shù)方法適用性試驗(yàn)3.2.1試液制備根

11、據(jù)供試品的理化特性與生物學(xué)特性,采取適宜的方法制備供試液。供試液制備若需加溫時(shí),應(yīng)均勻加熱,且溫度不應(yīng)超過(guò)45。供試液從制備至加入檢驗(yàn)用培養(yǎng)基,不得超過(guò)1 小時(shí)。常用的供試液制備方法如下。如果下列供試液制備方法經(jīng)確認(rèn)均不適用，應(yīng)建立其他適宜的方法。3.2.1.1水溶性供試品 取供試品，用pH7.0 無(wú)菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液，或pH7.2 磷酸鹽緩沖液，或胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基溶解或稀釋制成1:10 供試液。若需要，調(diào)節(jié)供試液pH 值至68。必要時(shí)，用同一稀釋液將供試液進(jìn)一步10倍系列稀釋。水溶性液體制劑也可用混合的供試品原液作為供試液。3.2.1.2 水不溶性非油脂類(lèi)供試品 取供試品，用pH7.

12、0 無(wú)菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液，或pH7.2 磷酸鹽緩沖液，或胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基制備成1:10 供試液。分散力較差的供試品，可在稀釋液中加入表面活性劑如0.1%的聚山梨酯80，使供試品分散均勻。若需要，調(diào)節(jié)供試液pH 值至68。必要時(shí)，用同一稀釋液將供試液進(jìn)一步10 倍系列稀釋。3.1.2.3 油脂類(lèi)供試品 取供試品，加入無(wú)菌十四烷酸異丙酯使溶解，或與最少量并能使供試品乳化的無(wú)菌聚山梨酯80 或其他無(wú)抑菌性的無(wú)菌表面活性劑充分混勻。表面活性劑的溫度一般不超過(guò)40（特殊情況下，最多不超過(guò)45），小心混合，若需要可在水浴中進(jìn)行，然后加入預(yù)熱的稀釋液使成110 供試液，保溫，混合，并在最短時(shí)間內(nèi)形成

13、乳狀液。必要時(shí)，用稀釋液或含上述表面活性劑的稀釋液進(jìn)一步10 倍系列稀釋。3.1.2.4 需用特殊方法制備供試液的供試品腸溶及結(jié)腸溶制劑供試品 取供試品，加入pH6.8 無(wú)菌磷酸鹽緩沖液（用于腸溶制劑）或pH7.6 無(wú)菌磷酸鹽緩沖液（用于結(jié)腸溶制劑），置45水浴中,振搖,使溶解,制成110 的供試液。必要時(shí)，用同一稀釋液將供試液進(jìn)一步10 倍系列稀釋。氣霧劑、噴霧劑供試品 取供試品,置-20或其它適宜溫度冷凍約1 小時(shí)，取出，迅速消毒供試品開(kāi)啟部位，用無(wú)菌鋼錐在該部位鉆一小孔，放至室溫，并輕輕轉(zhuǎn)動(dòng)容器，使拋射劑緩緩全部釋出。供試品亦可采用其它適宜的方法取出。用無(wú)菌注射器從每一容器中吸出全部藥液

14、于無(wú)菌容器中混合，然后取樣檢查。3.2 接種和稀釋按下列要求進(jìn)行供試液的接種和稀釋,制備微生物回收試驗(yàn)用供試液。所加菌液的體積應(yīng)不超過(guò)供試液體積的1%。為確認(rèn)供試品中的微生物能被充分檢出，首先應(yīng)選擇最低稀釋級(jí)的供試液進(jìn)行計(jì)數(shù)方法適用性試驗(yàn)。3.2.1 試驗(yàn)組 取上述制備好的供試液，加入試驗(yàn)菌液，混勻，使每1ml供試液或每張濾膜所濾過(guò)的供試液中含菌量不大于100cfu。3.2.2 供試品對(duì)照組 取制備好的供試液, 以稀釋液代替菌液同試驗(yàn)組操作。3.2.3 菌液對(duì)照組 取不含中和劑及滅活劑的相應(yīng)稀釋液替代供試液,按試驗(yàn)組操作加入試驗(yàn)菌液并進(jìn)行微生物回收試驗(yàn)。若因供試品抗菌活性或溶解性較差的原因?qū)е?/p>

15、無(wú)法選擇最低稀釋級(jí)的供試液進(jìn)行方法適用性試驗(yàn)時(shí)，應(yīng)采用適宜的方法對(duì)供試液進(jìn)行進(jìn)一步的處理。如果供試品對(duì)微生物生長(zhǎng)的抑制作用無(wú)法以其他方法消除，供試液可經(jīng)過(guò)中和、稀釋或薄膜過(guò)濾處理后再加入試驗(yàn)菌懸液進(jìn)行方法適用性試驗(yàn)。3.3 菌活性的去除或滅活供試液接種后，按下列“微生物回收”規(guī)定的方法進(jìn)行微生物計(jì)數(shù)。若試驗(yàn)組菌落數(shù)減去供試品對(duì)照組菌落數(shù)的值小于菌液對(duì)照組菌落數(shù)值的 50%，可采用下述方法消除供試品的抑菌活性。3.3.1 增加稀釋液或培養(yǎng)基體積。3.3.2 加入適宜的中和劑或滅活劑。中和劑或滅活劑（表2）可用于消除干擾物的抑菌活性，最好在稀釋液或培養(yǎng)基滅菌前加入。若使用中和劑或滅活劑，試驗(yàn)中應(yīng)設(shè)

16、中和劑或滅活劑對(duì)照組，即取相應(yīng)量稀釋液替代供試品同試驗(yàn)組操作，以確認(rèn)其有效性和對(duì)微生物無(wú)毒性。中和劑或滅活劑對(duì)照組的菌落數(shù)與菌液對(duì)照組的菌落數(shù)的比值應(yīng)在0.52范圍內(nèi)。表2 常見(jiàn)干擾物的中和劑或滅活方法干擾物可選用的中和劑或滅活方法戊二醛、汞制劑 亞硫酸氫鈉酚類(lèi)、乙醇、醛類(lèi)、吸附物稀釋法醛類(lèi)甘氨酸季銨化合物、對(duì)羥基苯甲酸、雙胍類(lèi)化合物卵磷脂季銨化合物、碘、對(duì)羥基苯甲酸聚山梨醇酯水銀巰基醋酸鹽水銀、汞化物、醛類(lèi)硫代硫酸鹽EDTA、喹喏酮類(lèi)抗生素鎂或鈣離子磺胺類(lèi)對(duì)氨基苯甲酸-內(nèi)酰胺類(lèi)抗生素-內(nèi)酰胺酶3.3.3 用薄膜過(guò)濾法。3.3.4上述幾種方法的聯(lián)合使用。若沒(méi)有適宜消除供試品抑菌活性的方法，對(duì)特

17、定試驗(yàn)菌回收的失敗，表明供試品對(duì)該試驗(yàn)菌具有較強(qiáng)抗菌活性，同時(shí)也表明供試品不易被該類(lèi)微生物污染。但是，供試品也可能僅對(duì)特定試驗(yàn)菌株具有抑制作用，而對(duì)其他菌株沒(méi)有抑制作用。因此，根據(jù)供試品須符合的微生物限度標(biāo)準(zhǔn)和菌數(shù)報(bào)告規(guī)則，在不影響檢驗(yàn)結(jié)果判斷的前提下，應(yīng)采用能使微生物生長(zhǎng)的更高稀釋級(jí)的供試液進(jìn)行計(jì)數(shù)方法適用性試驗(yàn)。若方法適用性試驗(yàn)符合要求，應(yīng)以該稀釋級(jí)供試液作為最低稀釋級(jí)的供試液進(jìn)行供試品檢查。3.4 試品中微生物的回收表1所列的計(jì)數(shù)方法適用性試驗(yàn)用的各試驗(yàn)菌應(yīng)逐一進(jìn)行微生物回收試驗(yàn)。微生物的回收可采用平皿法、薄膜過(guò)濾法或MPN 法。3.4.1 平皿法 平皿法包括傾注法和涂布法。表1 中每株

18、試驗(yàn)菌每種培養(yǎng)基至少制備2 個(gè)平皿，以算術(shù)均值作為計(jì)數(shù)結(jié)果。3.4.1.1 傾注法 取照上述“供試液的制備”“接種和稀釋”和“抗菌活性的去除或滅活”制備的供試液1ml，置直徑90mm 的無(wú)菌平皿中, 注入1520ml 溫度不超過(guò)45熔化的胰酪大豆胨瓊脂或沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基，混勻，凝固，倒置培養(yǎng)。若使用直徑較大的平皿，培養(yǎng)基的用量應(yīng)相應(yīng)增加。按表1規(guī)定條件培養(yǎng)、計(jì)數(shù)。同法測(cè)定供試品對(duì)照組及菌液對(duì)照組菌數(shù)。計(jì)算各試驗(yàn)組的平均菌落數(shù)。3.4.1.2 涂布法 取1520ml 溫度不超過(guò)45的胰酪大豆胨瓊脂或沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基，注入直徑90mm 的無(wú)菌平皿，凝固，制成平板，采用適宜的方法使培養(yǎng)基表面

19、干燥。若使用直徑較大的平皿，培養(yǎng)基用量也應(yīng)相應(yīng)增加。每一平板表面接種上述照“供試液的制備”“接種和稀釋”和“抗菌活性的去除或滅活”制備的供試液不少于0.1ml。按表1規(guī)定條件培養(yǎng)、計(jì)數(shù)。同法測(cè)定供試品對(duì)照組及菌液對(duì)照組菌數(shù)。計(jì)算各試驗(yàn)組的平均菌落數(shù)。3.4.2 薄膜過(guò)濾法 薄膜過(guò)濾法所采用的濾膜孔徑應(yīng)不大于0.45m,直徑一般為50mm,若采用其他直徑的濾膜,沖洗量應(yīng)進(jìn)行相應(yīng)的調(diào)整。供試品及其溶劑應(yīng)不影響濾膜材質(zhì)對(duì)微生物的截留。濾器及濾膜使用前應(yīng)采用適宜的方法滅菌。使用時(shí),應(yīng)保證濾膜在過(guò)濾前后的完整性。水溶性供試液過(guò)濾前先將少量的沖洗液過(guò)濾以潤(rùn)濕濾膜。油類(lèi)供試品,其濾膜和濾器在使用前應(yīng)充分干燥

20、。為發(fā)揮濾膜的最大過(guò)濾效率,應(yīng)注意保持供試品溶液及沖洗液覆蓋整個(gè)濾膜表面。供試液經(jīng)薄膜過(guò)濾后,若需要用沖洗液沖洗濾膜,每張濾膜每次沖洗量一般為100ml?？倹_洗量不得超過(guò)1000ml,以避免濾膜上的微生物受損傷。取照上述 “供試液的制備”“接種和稀釋”和“抗菌活性的去除或滅活”制備的供試液適量（一般取相當(dāng)于1g、1ml 或10cm2 的供試品, 若供試品中所含的菌數(shù)較多時(shí)，供試液可酌情減量），加至適量的稀釋液中,混勻,過(guò)濾。用適量的沖洗液沖洗濾膜。若測(cè)定需氧菌總數(shù)，轉(zhuǎn)移濾膜菌面朝上貼于胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基平板上；若測(cè)定霉菌和酵母總數(shù)，轉(zhuǎn)移濾膜菌面朝上貼于沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基平板上。按表1 規(guī)定

21、條件培養(yǎng)、計(jì)數(shù)。每株試驗(yàn)菌每種培養(yǎng)基至少制備一張濾膜。同法測(cè)定供試品對(duì)照組及菌液對(duì)照組菌數(shù)。3.4.3 MPN 法 MPN 法的精密度和準(zhǔn)確度不及薄膜過(guò)濾法和平皿計(jì)數(shù)法，僅在供試品需氧菌總數(shù)沒(méi)有適宜計(jì)數(shù)方法的情況下使用，本法不適用于霉菌計(jì)數(shù)。若使用MPN 法，按下列步驟進(jìn)行。取照上述“供試液的制備”“接種和稀釋”和“抗菌活性的去除或滅活”制備的供試液至少3 個(gè)連續(xù)稀釋級(jí)，每一稀釋級(jí)取3 份1ml 分別接種至3 管裝有910ml胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基中，同法測(cè)定菌液對(duì)照組菌數(shù)。必要時(shí)可在培養(yǎng)基中加入表面活性劑、中和劑或滅活劑。接種管置3035培養(yǎng)3 天，逐日觀察各管微生物生長(zhǎng)情況。如果由于供試品的

22、原因使得結(jié)果難以判斷，可將該管培養(yǎng)物轉(zhuǎn)種至胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基或胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基，在相同條件下培養(yǎng)12 天，觀察是否有微生物生長(zhǎng)。根據(jù)微生物生長(zhǎng)的管數(shù)從表3 查被測(cè)供試品每1g 或每1ml 中需氧菌總數(shù)的最可能數(shù)。表3 微生物最可能數(shù)檢索表生長(zhǎng)管數(shù)需氧菌總數(shù)最可能數(shù)95%置信限每管含樣品的g或ml數(shù)MPN/g或ml下限上限0.10.010.001000 309.400130.19.501030.1100116.11.2170206.21.2170309.43.5351003.60.2171017.21.217102114351107.41.3201111143512011435121155

23、38130165382009.21.5352011443520220538210154382112053821227994220215402212899422235994230299942313699430023594301389104302641618131043918131175171993121203036031316030380320931836032115030380322210304003232909099033024040990331460901980332110020040003331100注：表內(nèi)所列檢驗(yàn)量如改用1g（或ml）、0.1g（或ml）和0.01g（或ml）時(shí)，表內(nèi)

24、數(shù)字應(yīng)相應(yīng)降低10 倍；如改用0.01 g（或ml）、0.001 g（或ml）和0.0001 g（或ml）時(shí)，表內(nèi)數(shù)字應(yīng)相應(yīng)增加10 倍，其余類(lèi)推。3.5 結(jié)果判斷計(jì)數(shù)方法適用性試驗(yàn)中，采用平皿法或薄膜過(guò)濾法時(shí)，試驗(yàn)組菌落數(shù)減去供試品對(duì)照組菌落數(shù)的值與菌液對(duì)照組菌落數(shù)的比值應(yīng)在0.52 范圍內(nèi)；采用MPN法時(shí)，試驗(yàn)組菌數(shù)應(yīng)在菌液對(duì)照組菌數(shù)的95%置信限內(nèi)。若各試驗(yàn)菌的回收試驗(yàn)均符合要求，照所用的供試液制備方法及計(jì)數(shù)方法進(jìn)行該供試品的需氧菌總數(shù)、霉菌和酵母菌總數(shù)計(jì)數(shù)。方法適用性確認(rèn)時(shí),若采用上述方法還存在一株或多株試驗(yàn)菌的回收達(dá)不到要求,那么選擇回收最接近要求的方法和試驗(yàn)條件進(jìn)行供試品的檢查。4

25、 供試品檢查4.1 檢驗(yàn)量檢驗(yàn)量即一次試驗(yàn)所用的供試品量（g、ml 或cm2）。一般應(yīng)隨機(jī)抽取不少于 2 個(gè)最小包裝的供試品，混合，取規(guī)定量供試品進(jìn)行檢驗(yàn)。除另有規(guī)定外,一般供試品的檢驗(yàn)量為10g 或10ml；膜劑為100cm2；貴重藥品、微量包裝藥品的檢驗(yàn)量可以酌減。檢驗(yàn)時(shí),應(yīng)從2 個(gè)以上最小包裝單位中抽取供試品,大蜜丸還不得少于4 丸,膜劑還不得少于4 片。4.2 供試品的檢查按計(jì)數(shù)方法適用性試驗(yàn)確認(rèn)的計(jì)數(shù)方法進(jìn)行供試品中需氧菌總數(shù)、霉菌和酵母菌總數(shù)的測(cè)定。胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基或胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基用于測(cè)定需氧菌總數(shù)；沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基用于測(cè)定霉菌和酵母菌總數(shù)。4.3 陰性對(duì)照試驗(yàn) 以稀

26、釋液代替供試液進(jìn)行陰性對(duì)照試驗(yàn)，陰性對(duì)照試驗(yàn)應(yīng)無(wú)菌生長(zhǎng)。如果陰性對(duì)照有菌生長(zhǎng)，應(yīng)進(jìn)行偏差調(diào)查。4.3.1 平皿法平皿法包括傾注法和涂布法。除另有規(guī)定外，取規(guī)定量供試品，按方法適用性試驗(yàn)確認(rèn)的方法進(jìn)行供試液制備和菌數(shù)測(cè)定，每稀釋級(jí)每種培養(yǎng)基至少制備2個(gè)平板。4.3.1.2培養(yǎng)和計(jì)數(shù) 除另有規(guī)定外，胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基平板在3035培養(yǎng)35 天，沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基平板在2025培養(yǎng)57 天，觀察菌落生長(zhǎng)情況,點(diǎn)計(jì)平板上生長(zhǎng)的所有菌落數(shù)，計(jì)數(shù)并報(bào)告。菌落蔓延生長(zhǎng)成片的平板不宜計(jì)數(shù)。點(diǎn)計(jì)菌落數(shù)后，計(jì)算各稀釋級(jí)供試液的平均菌落數(shù)，按菌數(shù)報(bào)告規(guī)則報(bào)告菌數(shù)。若同稀釋級(jí)兩個(gè)平板的菌落數(shù)平均值不小于15，則兩個(gè)平板的菌落數(shù)不能相差1 倍或以上。4.3.1.3菌數(shù)報(bào)告規(guī)則 需氧菌總數(shù)測(cè)定宜選取平均菌落數(shù)小于300cfu 的稀釋級(jí)、霉菌和酵母菌總數(shù)測(cè)定宜選取平均菌落數(shù)小于100cfu 的稀釋級(jí)，作為菌數(shù)報(bào)告的依據(jù)。取最高的平均菌落數(shù)，計(jì)算1g、1ml 或10cm2供試品中所含的微生物數(shù)，取兩位有效數(shù)字報(bào)告。如各稀釋級(jí)的平板