綜合實(shí)驗(yàn)步驟

1、RNA提取及逆轉(zhuǎn)錄步驟組織RNA提?。?、將標(biāo)本約100mg放入研缽，立即加入液氮，研碎后，立即加入TRIZOL 1mL，研磨10min(清亮)后，轉(zhuǎn)入1.5ml EP管，上下顛倒10次，室溫靜置5min。標(biāo)本為組織時(shí)， 12000轉(zhuǎn)離心10min取上清，轉(zhuǎn)下步。2、每加入1ml TRIZOL 在EP管中加入氯仿0.2mL，震蕩15s后，靜置5min，然后12000轉(zhuǎn)離心15min。3、將上層水相移入另一EP管中（寧缺毋濫），并加入約0.5mL異丙醇，震蕩混勻后靜置5min，12000轉(zhuǎn)離心10min. 4、棄上清加1mL 75%DEPC 乙醇（-20°C預(yù)冷），漂浮RNA沉淀，（脾

2、臟需用Tip吹打以去盡雜質(zhì)），以7500轉(zhuǎn)離心5min。5、棄上清，置于工作臺(tái)開(kāi)風(fēng)機(jī)干燥30min，待RNA沉淀變成半透明時(shí)，加入DEPC水20uL/40uL，如果沉淀不溶解，置于55-60度溫箱水浴5min左右。-70度保存或立即逆轉(zhuǎn)錄。靜脈血RNA提?。?、 將5mL靜脈血于EDTA抗凝管中，放4冰箱2h左右；2、 3000轉(zhuǎn)離心5min，吸取上清置于1.5mL離心管；3、 加4mL NS于下層血細(xì)胞中，吹打混勻以懸浮細(xì)胞；4、 加4mL大鼠淋巴細(xì)胞分離液到15mL離心管中，將血細(xì)胞懸液緩緩加到裝有大鼠淋巴細(xì)胞分離液的離心管中；2000轉(zhuǎn)離心25min；5、 小心吸取云霧層（即單個(gè)核細(xì)胞）

3、，7500轉(zhuǎn)離心5分鐘，去上清；6、 以1ml NS重懸細(xì)胞，吹打洗滌，6500轉(zhuǎn)離心5min，吸盡上清，存于-80或加入TRIZOL/裂解液。逆轉(zhuǎn)錄步驟(MBI試劑盒)：1、05.mL EP管中加入DEPC水10uLRNA1uLOligo1uL置于PCR儀中70 5min （編號(hào)XIER101）2、放入冰中5min3、點(diǎn)離5秒，加入5×緩沖液4uLRnase抑制劑1uLdNTP2uL置于PCR儀中37 5min （編號(hào)XIER102）4、加入逆轉(zhuǎn)錄酶1uL，用tip頭吹打混勻，放入PCR儀中4260min，7010min（編號(hào)XIER103），然后-20保存。PCR步驟（25uL體

4、系）：模板1uLSense1uLAnti-sense1uLTaqMIX12.5 uL去離子水加至25uL RNA濃度測(cè)定：取1uL RNA原液稀釋至250uL，測(cè)定其A260和A280的值，一般A260/280的比值在1.8-2.0之間滿(mǎn)足實(shí)驗(yàn)要求RNA原液濃度=A260×稀釋倍數(shù)（250）×40（ng/L）Western blotting一、主要試劑的配制(所有單位均為g/mL)1、丙烯酰胺和甲叉丙烯酰胺 丙稀酰胺29g+甲叉雙丙稀酰胺1g= 100ml，儲(chǔ)于棕色瓶，4避光保存。2、10%SDS、10%APS3、Tris-甘氨酸電泳緩沖液 30.3gTris，187.7g

5、甘氨酸，10gSDS，用蒸餾水溶解至1L，得10×緩沖液。4、轉(zhuǎn)移緩沖液 2.9g甘氨酸、5.8gTris堿、0.375g SDS，200mL甲醇，定容1L。5、麗春紅染液儲(chǔ)存液 麗春紅S 2g 三氯乙酸30g 磺基水楊酸 30g 加水至100ml 用時(shí)上述儲(chǔ)存液稀釋10倍即成麗春紅S使用液。使用后應(yīng)予以廢棄。6、考馬斯亮藍(lán)染色液 1g考馬斯亮藍(lán)R-250用250mL的異丙醇攪拌溶解，再加入100mL的冰醋酸，均勻攪拌，再加入650mL的去離子水，均勻攪拌。濾紙過(guò)濾后室溫保存。7、考馬斯亮藍(lán)脫色液 醋酸100mL，乙醇50mL，蒸餾水850mL二、制膠三、電泳 濃縮膠70V，分離膠1

6、10V，2小時(shí)30分鐘左右。（同時(shí)配封閉液）四、轉(zhuǎn)膜 PVDF膜用100%甲醇浸泡5min，轉(zhuǎn)膜液浸泡5min，視蛋白分子量決定電壓，恒流300mA左右五、封閉（室溫1h） 1g脫脂奶粉+20mL TBS-T（TBS：Tuween=1000：1）六、一抗孵育（4過(guò)夜） 2%脫脂奶粉（TBS-T溶解）稀釋?zhuān)?；TBS-T洗膜10min×3次七、二抗孵育（室溫1h） 10mL 5%脫脂奶粉（PBS-T溶解）1h，TBS-T洗3×10min，再用TBS洗一次，以洗盡吐溫。八、顯色 ECL發(fā)光試劑盒：1：1混合；九、曝光 如有明顯條帶，30s足夠。石蠟切片-免疫組織化學(xué)將神經(jīng)組織切成

7、3-4mm長(zhǎng)片段，裝入銅條盒，流水沖洗20min一、梯度脫水 50%的酒精（3-4h）70%的酒精（3-4h）85%的酒精（過(guò)夜）95%的酒精（1h）（同時(shí)融蠟，78）100%的酒精（1h×2次）1半酒精、1半二甲苯透明（20min）二甲苯（20min）二甲苯（20min）二、浸蠟56-58（20min）58-60（20min）60-62（60min）三、包埋 以60-62包埋（準(zhǔn)備電烙鐵、鑷子）包埋好的蠟塊最好放于4保存。四、切片 4m切片，貼片五、脫蠟至水 1、電吹風(fēng)吹片或烤箱64烤1-2h，至溶蠟（此步后玻片可于4長(zhǎng)期保存）；2、入二甲苯（I）中脫蠟5min，甩干；3、入二甲苯

8、（II）中脫蠟10min（此時(shí)切片應(yīng)透明），甩干；4、入100%乙醇（I）5 min，甩干；5、入100%乙醇（II）5 min，甩干；6、入95%乙醇5 min； 7、入85%乙醇10min8、入70%乙醇10min9、入流水2分鐘，甩干水分；免疫組化 ABC法操作步驟：（ 1 ） 石蠟切片脫蠟至水。（ 2 ） 3%H 2O 2 （30% H 2O 2：甲醇=1：9）室溫孵育 5-10 min，以消除內(nèi)源性過(guò)氧化物酶的活性。（ 3 ） 蒸餾水沖洗，PBS 浸泡5 min×2（如需抗原修復(fù)，可在此步后進(jìn)行，常用的修復(fù)液是pH6.0的0.01 mol/L的檸檬酸鹽緩沖液，3g

9、檸檬酸二鈉+0.4g檸檬酸+蒸餾水=1L）。（ 4 ） 5% 正常山羊血清（PBS 稀釋?zhuān)┓忾]（免疫熒光用10%），室溫孵育 20min，傾去血清，勿洗。滴加一抗工作液， 37 孵育 1-2 h或 4 過(guò)夜（如果選擇4過(guò)夜，需37復(fù)溫45min，防止脫片）。封閉血清最常用的是二抗動(dòng)物的非免疫血清，用PBS稀釋為3%-10%溶液孵育切片，以封閉吸附位點(diǎn)。其它無(wú)關(guān)蛋白，如牛血清白蛋白也常用。封閉時(shí)間一般為10-30min。一抗孵育溫度有幾種：4度、室溫、37度，其中4度效果最佳；孵育時(shí)間：這與溫度、抗體濃度有關(guān)，一般37度1-2h，而4度過(guò)夜和從冰箱拿出后37度復(fù)溫45min。Triton X-1

10、00化學(xué)名稱(chēng)為聚乙二醇辛基苯基醚，是一種去污劑。在細(xì)胞免疫組織化學(xué)或組織免疫組化（>10um厚切片）推薦使用，作為細(xì)胞通透劑，在膜上打孔。（ 5 ） PBS 沖洗， 5min×3 次。（ 6 ） 滴加適量生物素（biotin）標(biāo)記二抗工作液， 37 孵育30min（同時(shí)配制鏈霉卵白素工作液，因其配好30min后才能使用）。（ 7 ） PBS 沖洗，5min×3 次。（ 8 ） 滴加適量的辣根酶或堿性磷酸酶標(biāo)記的鏈霉卵白素（avidin）工作液， 37 孵育30min。（ 9 ） PBS 沖洗，5min×3 次。（ 10 ） DAB顯色劑顯色 3-15min。

11、（ 11 ） 自來(lái)水充分沖洗，蘇木素復(fù)染（數(shù)秒或不染），脫水，透明，封片。PK-4001試劑盒內(nèi)容：A:   封閉用血清B：生物素標(biāo)記二抗       PK-4001: 生物素標(biāo)記羊抗兔IgGC：卵白素D：生物素化辣根酶工作液的配制1、稀釋液:可以采用多種緩沖液對(duì)本系列產(chǎn)品進(jìn)行稀釋?zhuān)畛Ｓ玫牡南♂屢菏侵行缘牧姿猁}緩沖液（10mM PBS）。2、封閉血清:稀釋比例1:503、生物素化抗體:稀釋比例1:2004、ABC復(fù)合物:將試劑C和D按1:100的稀釋比例等量混合，放置30分鐘后方可使用。貼心提

12、示1、本系列檢測(cè)試劑盒適用于絕大多數(shù)組織，但對(duì)于內(nèi)源性生物素含量比較豐富的組織（如腎臟、肝臟等），應(yīng)選用非生物素檢測(cè)系統(tǒng)。2、本品為濃縮液，需預(yù)先稀釋方可使用，稀釋后的液體不能長(zhǎng)期保存。3、如以每張切片加入1滴（約50µl）計(jì)算，1/4Kit可做750張切片，1Kit可做3000張切片。Weil髓鞘染色法1試劑配制A液: 蘇木精1g, 無(wú)水酒精 100ml, 溶解后備用B液:硫酸鐵胺4g,蒸餾水100ml, 溶解后備用C液：鐵氰化鉀12.5g, 硼砂2.5g, 蒸餾水1000mLD 液： 綜合染液，A液1份，B液1份，蒸餾水2份，混勻2實(shí)驗(yàn)方法（1） 石蠟切片常規(guī)脫蠟入水，將切片轉(zhuǎn)入

13、D液染色20min; (2) 取出切片充分水洗后，置于B液分色，至灰質(zhì)和白質(zhì)可以區(qū)別為止（3） 自來(lái)水沖洗，蒸餾水洗滌2次；（4）置于C液中分色片刻，取出后蒸餾水洗滌；（5）常規(guī)酒精脫水，二甲苯透明，中性樹(shù)膠封固3 結(jié)果判斷正常神經(jīng)髓鞘被深蘭色至黑色，灰質(zhì)至深黃色至無(wú)色，變性和潰變的髓鞘不著色。1、石蠟切片和冰凍切片的比較？（1）要求做冰凍切片的不一定能做石蠟切片，這是今天我向一老師請(qǐng)教得出的結(jié)論。因?yàn)樽魇炃衅瑫r(shí)要高溫烤片，可能會(huì)破壞組織的抗原性，如果組織的抗原性較穩(wěn)定，則可作石蠟切片；但是要求做石蠟切片的，可作冰凍切片。（2）冰凍切片的優(yōu)點(diǎn)是能夠較好的保存組織的抗原免疫活性，做免疫組化時(shí)不

14、需抗原修復(fù)這一步。缺點(diǎn)是細(xì)胞內(nèi)易形成冰晶而破壞細(xì)胞結(jié)構(gòu)，可能會(huì)使抗原彌散；切片厚度較石蠟的厚，做的片子沒(méi)石蠟的漂亮。當(dāng)你買(mǎi)一抗時(shí)，目錄上都寫(xiě)著做什么樣的切片，如果它寫(xiě)著只能做冰凍，就不能做石蠟，如寫(xiě)著兩者都可，那就都能做。（3）石蠟切片的優(yōu)點(diǎn)可以保持組織細(xì)胞的形態(tài)結(jié)構(gòu)，且容易存放在室溫，而冰凍切片比較麻煩，一定要存在-80度的低溫冰箱中，尤其是用來(lái)做原位雜交的的切片，為了防止RNA降解，保存一貫很重要。由于石蠟切片可以切到4微米左右，所以原位雜交探針容易滲透到組織中去，容易成功，而且得到的顏色/形態(tài)都較冰凍切片好。2、一抗的選擇要點(diǎn)和技巧是什么？（1）單克隆和多克隆抗體的選擇。由一種克隆產(chǎn)生的

15、特異性抗體叫做單克隆抗體。單克隆抗體能目標(biāo)明確地與單一的特異抗原決定簇結(jié)合，就像導(dǎo)彈精確地命中目標(biāo)一樣。另一方面，即使是同一個(gè)抗原決定簇，在機(jī)體內(nèi)也可以由好幾種克隆來(lái)產(chǎn)生抗體，形成好幾種單克隆抗體混雜物，稱(chēng)為多克隆抗體。在抗原抗體反應(yīng)中，一般單克隆抗體特異性強(qiáng)，但親和力相對(duì)小，檢測(cè)抗原靈敏度相對(duì)就低；而多克隆抗體特異性稍弱，但抗體的親和力強(qiáng)，靈敏度高，但易出現(xiàn)非特異性染色（可以通過(guò)封閉等避免）。（2）應(yīng)用范圍的選擇。有的一抗只能用于Western blotting，或免疫組化、免疫熒光、免疫沉淀等；甚至表明石蠟切片或冰凍切片。（3）種屬反應(yīng)性的選擇（species reactivity）。這一

16、點(diǎn)很重要，表明這種抗體可能存在種屬差異，且這種抗體適合檢測(cè)哪種種屬動(dòng)物體內(nèi)的抗原。（4）種屬來(lái)源，一般兔來(lái)源的多是多克??；而小鼠來(lái)源的多是單克隆，但也有另外。根據(jù)此來(lái)源來(lái)選擇相應(yīng)的二抗。（5）生產(chǎn)廠家的選擇。如santa Cruz公司抗體一般1ml，價(jià)格2100元左右；而chemicon公司一抗一般100ul，價(jià)格2800元左右。這兩個(gè)廠家的同一種抗體它的實(shí)際效價(jià)穩(wěn)定是不同的，我一般用后者抗體做免疫組化效果較好，而前者做Western blotting效果還可以。3、在什么情況下使用Triton-X100（1）Triton X-100化學(xué)名稱(chēng)為聚乙二醇辛基苯基醚，是一種去污劑。在免疫組織化學(xué)（

17、>10um厚切片） 和免疫細(xì)胞化學(xué)中一般用Triton X-100 作為細(xì)胞通透劑，在膜上打孔。（2）其作用原理：Triton X-100 可以溶解細(xì)胞膜、細(xì)胞核膜、細(xì)胞器膜上的脂質(zhì)而使抗體及大分子結(jié)構(gòu)的物質(zhì)進(jìn)入胞漿和胞核內(nèi)，故在細(xì)胞免疫組化時(shí)尤為推薦使用，這樣抗體就能順利進(jìn)入胞內(nèi)與相應(yīng)抗原結(jié)合。（3）Triton X-100既是一種表面活性劑，也有抗氧化作用。4、封閉血清的選擇原則是什么？（1）膜上或切片上有剩余的位點(diǎn)可以非特異性吸附抗體，造成后續(xù)結(jié)果的假陽(yáng)性?。?）封閉血清一般是和二抗同一來(lái)源的，血清中動(dòng)物自身的抗體，預(yù)先能和組織中有交叉反應(yīng)的位點(diǎn)發(fā)生結(jié)合，否則在后面的步驟中如果和二

18、抗發(fā)生結(jié)合，會(huì)造成背景。（3）也可以用小牛血清、BSA、羊血清等，但不能與一抗來(lái)源一致。5、抗體孵育條件的比較？（1）一抗孵育溫度有幾種：4度、室溫、37度，其中4度效果最佳；孵育時(shí)間：這與溫度、抗體濃度有關(guān)，一般37度1-2h，而4度過(guò)夜和從冰箱拿出后37度復(fù)溫45min。（2）二抗一般室溫或37度30min-1h，具體時(shí)間需要摸索。6、一抗4度孵育后為什么要進(jìn)行37度復(fù)溫？（1）一方面，防止切片從4度直接放入PBS易脫片；（2）另一方面，使抗原抗體結(jié)合更穩(wěn)定。一般不需要，但對(duì)表達(dá)較弱的抗原可能有用，4度和37度時(shí)分子運(yùn)動(dòng)方式不同，前者分子碰撞機(jī)率和運(yùn)動(dòng)速度小于后者，后者結(jié)合更快，但敏感性也

19、提高了并易造成非特異染色。（3）其實(shí)，我更贊同后一種說(shuō)法，因?yàn)槲覈L試把肝臟或睪丸片子從4度過(guò)夜拿出后，直接用PBS洗沒(méi)發(fā)生過(guò)脫片現(xiàn)象。事實(shí)勝于雄辯！7、DAB顯色時(shí)間如何把握？（1）DAB顯色時(shí)間不是固定的，主要由顯微鏡下控制顯色時(shí)間，到出現(xiàn)淺棕色本底時(shí)即可沖洗；（2）DAB顯色時(shí)間很短（如幾秒或幾十秒）就出現(xiàn)很深的棕褐色，這很可能說(shuō)明你的抗體濃度過(guò)高或抗體孵育時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，需要下調(diào)抗體濃度或縮短你的抗體孵育時(shí)間；（3）此外，若很短時(shí)間就出現(xiàn)背景很深，還有可能你前面的封閉非特異性蛋白不全，需要延長(zhǎng)封閉時(shí)間；（4）DAB顯色時(shí)間很長(zhǎng)（如超過(guò)十幾分鐘）才出現(xiàn)陽(yáng)性染色，一方面可能說(shuō)明你的抗體濃度過(guò)低或孵

20、育時(shí)間過(guò)短（最好一抗4度過(guò)夜）；另一方面就是封閉時(shí)間過(guò)長(zhǎng)。8、免疫組化結(jié)果如何分析？（1）陽(yáng)性著色細(xì)胞計(jì)數(shù)法。在40*光鏡下，隨機(jī)選擇不重疊的10個(gè)視野，人工或機(jī)器計(jì)數(shù)陽(yáng)性著色細(xì)胞，每組36張不同動(dòng)物組織切片，然后進(jìn)行組間比較即可。（2）灰密度分析法。通過(guò)在不同組別和不同動(dòng)物組織切片上選擇相同區(qū)域、相同條件下用image j進(jìn)行灰密度分析，然后進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析即可。（3）評(píng)分法。通過(guò)在光學(xué)顯微鏡下對(duì)組織切片分別按染色程度（03分為陰性著色、淡黃色、淺褐色、深褐色）、陽(yáng)性范圍進(jìn)行評(píng)分（14分為025%、2650%、5175%、76100%），最終可以分?jǐn)?shù)相加，再進(jìn)行比較。對(duì)于以上這幾種方法，各有利弊

21、，請(qǐng)細(xì)心選擇。要想得到正確結(jié)果的前提是你要做出著色均勻、背景很淺的高質(zhì)量切片。9、在什么情況下進(jìn)行組織抗原修復(fù)，抗原修復(fù)的條件是什么？（1）由于組織中部分抗原在甲醛或多聚甲醛固定過(guò)程中，發(fā)生了蛋白之間交聯(lián)及醛基的封閉作用，從而失去抗原性。通過(guò)抗原修復(fù)，使得細(xì)胞內(nèi)抗原決定族重新暴露，提高抗原檢測(cè)率。（2）修復(fù)方法從強(qiáng)到弱一般分為三種，高壓修復(fù)、微波修復(fù)、胰酶修復(fù)。修復(fù)液也分為若干種（具體的可以查閱相關(guān)資料，大量的：中性的、高pH的等）。（3）微波修復(fù)，我們一般用6min*4次，效果不錯(cuò)10、內(nèi)源性過(guò)氧化物酶的滅活時(shí)間和濃度是什么？（1）一般3%過(guò)氧化氫滅活時(shí)間短點(diǎn)，可以10min左右；而0。3%

22、過(guò)氧化氫則可以適當(dāng)延長(zhǎng)封閉時(shí)間，一般1030min。（2）用甲醇配置過(guò)氧化氫比雙蒸水或PBS可能好在保護(hù)抗原和固定組織作用，過(guò)氧化氫孵育時(shí)間過(guò)長(zhǎng)易引起脫片。（3）現(xiàn)用現(xiàn)配，配好后4度避光保存。11、如何才能充分脫蠟？（1）蠟不溶于水，如果脫蠟不干凈，少許蠟存留于切片上，將會(huì)引起染色不均勻、陽(yáng)性物時(shí)隱時(shí)現(xiàn)、真假難辨、背景染色增加等。為了解決上述的問(wèn)題，切片在染色前必須徹底脫蠟，目前用于脫蠟的試劑主要是二甲苯，因它脫蠟力強(qiáng)，脫蠟時(shí)間較短；（2）脫蠟的時(shí)間要根據(jù)季節(jié)，室溫和試劑的新鮮謀面是在不同。如果在夏天，室溫較高，脫蠟試劑也新鮮，則脫蠟時(shí)間不需很多，3-5分鐘就已足夠。如果在冬天，室溫較低，脫蠟

23、試劑也較陳舊，則脫蠟時(shí)間需要延長(zhǎng)，10-20分鐘或更長(zhǎng)。（3）當(dāng)天切的切片，燒烤2小時(shí)后進(jìn)行染色，切片帶有溫度進(jìn)行脫蠟這將可加速脫蠟的過(guò)程，如果預(yù)先切好烤好的切片，在染色前，還必須對(duì)切片進(jìn)行加溫10-20分鐘，然后再行脫蠟，這樣脫蠟速度加快，效果更好?？傊?，操作時(shí)應(yīng)根據(jù)不同的季節(jié)，不同的室溫，不同的試劑來(lái)決定，脫蠟的時(shí)間，原則上是要徹底、干凈、完全地脫去切片上的蠟。12、如何最大限度地降低組織非特異性染色？（1）縮短一抗/二抗孵育時(shí)間、稀釋抗體來(lái)控制。這是最重要的一條。（2）一抗用多克隆抗體易出現(xiàn)非特異性著色，建議試用單克隆抗體看看。（3）內(nèi)源性過(guò)氧化物酶和生物素在肝臟、腎臟等組織含量很高（含

24、血細(xì)胞多的組織），需要通過(guò)延長(zhǎng)滅活時(shí)間和增加滅活劑濃度來(lái)降低背景染色；（4）非特異性組分與抗體結(jié)合，這需要通過(guò)延長(zhǎng)二抗來(lái)源的動(dòng)物免疫血清封閉時(shí)間和適當(dāng)增加濃度來(lái)加強(qiáng)封閉效果；（5）縮短DAB孵育時(shí)間或降低DAB濃度/過(guò)氧化氫濃度等；（6）適當(dāng)增加PBS沖洗次數(shù)和浸洗時(shí)間，在一抗、二抗或SP孵育之后的浸洗尤為重要；（7）防止標(biāo)本染色過(guò)程中出現(xiàn)干片，這容易增強(qiáng)非特異性著色。13、蘇木素復(fù)染時(shí)間的把握？（1）蘇木素復(fù)染時(shí)間要看當(dāng)時(shí)的室溫、溶液的新舊、目標(biāo)抗原的定位等情況，一般數(shù)秒-數(shù)分鐘。不過(guò)這個(gè)如果染色不理想可以補(bǔ)救的。即：染色深則分化時(shí)間稍長(zhǎng)些即可；染色淺則再置于蘇木素中染色即可。（2）鹽酸酒精

25、是分化，氨水是返蘭。作用不同。片子復(fù)染完后流水振洗，然后置于鹽酸酒精中數(shù)秒（一定動(dòng)作要快）后拿出流水振洗，在放入氨水中返蘭即可。（3）如果分化的顏色過(guò)淺，可以復(fù)置于蘇木素中染色。14、PBS的清洗方式選擇、次數(shù)和時(shí)間的選擇？（1）單獨(dú)沖洗，防止交叉反應(yīng)造成污染。臨床上每天檢測(cè)的病例很多，所用的抗體種類(lèi)及項(xiàng)目也多，如果在加入一抗孵育完后，將它們?cè)谝粋€(gè)缸內(nèi)洗，這樣就會(huì)造成交叉污染，影響最后的結(jié)果。正確的做法是單獨(dú)地進(jìn)行沖洗，沖洗的PBS為一次性，保證切片沒(méi)有相互交叉污染的機(jī)會(huì)。（2）溫柔沖洗，防止切片的脫落。沖洗切片，取出切片，將PBS從上輕輕地沖洗，讓PBS自上而下流下來(lái)，不要拿起切片將PBS對(duì)

26、準(zhǔn)切片沖洗，這樣由于沖出的PBS有一定的沖擊力，很容易使切片周邊引起松動(dòng)，導(dǎo)致切片的脫落。（3）沖洗的時(shí)間要足夠，才能徹底洗去結(jié)合的物質(zhì)。沖洗切片有人提出用微振蕩器振染，振下未結(jié)合的各種物，使之不產(chǎn)生背景，此種做法一是浪費(fèi)時(shí)間，二是很容易導(dǎo)致切片的脫落。切片的沖洗據(jù)實(shí)踐認(rèn)為，用一小燒杯柔和地于切片上沖洗，就能徹底沖洗去未結(jié)合的物質(zhì)，無(wú)需附加其它條件，沖洗好于切片上再注入PBS，持續(xù)2分鐘左右就完全足夠了。（4）PBS的PH和離子強(qiáng)度的使用和要求。中性及弱鹼性條件（PH7-8）有利于免疫復(fù)合物的形成，而酸性條件則有利于分解；低離子強(qiáng)度有利于免疫復(fù)合物的形成，而高離子強(qiáng)度則有利于分解。（5）常用試

27、劑的配制和使用。在免疫組織化學(xué)的染色過(guò)程中，用得最多的試劑就是緩沖液，因?yàn)榍衅谡麄€(gè)染色中，抗體的加、換、切片的沖洗，DAB的配制都離不開(kāi)緩沖液?？梢?jiàn)緩沖液在整個(gè)染色中都起至關(guān)鍵的作用，緩沖液的過(guò)酸或偏堿，都將影響染色的結(jié)果。15、脫片產(chǎn)生的原因和如何防止脫片？（1）多聚賴(lài)氨酸玻片質(zhì)量的問(wèn)題。我原先是買(mǎi)的，邁新按說(shuō)也是不錯(cuò)的，可是都脫成什么樣子了。后面補(bǔ)做第二批時(shí)用的病理科老師自己做的片子，要好一點(diǎn)。（2）組織切的不好，切片機(jī)的問(wèn)題例如比較老的舊的機(jī)器切的厚或者不均勻，或者切片者手法不好等。（3）組織的問(wèn)題，我用的組織癌癥的很多，越是癌癥組織有壞死之類(lèi)越容易脫。（4）沒(méi)烤好，時(shí)間短溫度不夠之類(lèi)。（5）操作的時(shí)候甩的太猛了，有脫片嫌疑的片子最好不甩或輕輕甩，用衛(wèi)生紙從邊緣上慢慢吸水。（6）修復(fù)的問(wèn)題：抗原修復(fù)的時(shí)候高壓時(shí)間過(guò)長(zhǎng)了，或者放進(jìn)100度的修復(fù)液時(shí)手法不好，咚的一聲就丟進(jìn)去了，這樣超容易脫片。此外，用EDTA修復(fù)比檸檬酸容易脫片，但是你要用到EDTA的時(shí)候也沒(méi)辦法，只有從另外的問(wèn)題上著手。（7）此外，一旦見(jiàn)到有組織漂起來(lái)操作就更加要謹(jǐn)慎，用PBS的時(shí)候盡量用泡的，不要沖?；旧习堰@些方面都注意到了，能