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1、 學(xué)術(shù)論文題 目:抗體酶的研究與應(yīng)用進(jìn)展 類(lèi) 別:綜述型學(xué) 院:生物科學(xué)與工程學(xué)院專(zhuān)業(yè)班級(jí):生物工程1102班學(xué)生姓名:閆超杰 (1112024045)劉青(1112024049) 陳建 (1112024053)周游(1112024050) 楊柚柳椰(1112024047)牛犇(1112024048) 2012年4月28號(hào)抗體酶的制備與應(yīng)用研究進(jìn)展閆超杰,劉青,陳建,周游,楊柚柳椰,牛犇 (陜西理工學(xué)院 生物科學(xué)與工程學(xué)院 生物工程專(zhuān)業(yè) 陜西 漢中 723000) 指導(dǎo)老師 陳琛內(nèi)容摘要:抗體酶是具有催化性質(zhì)的抗體,它同時(shí)具備抗體和酶的特征,可催化多種化學(xué)反應(yīng),如酰基轉(zhuǎn)移、酯水解、酰胺水解、重

2、排反應(yīng)、光誘導(dǎo)反應(yīng)、氧化還原分應(yīng)、金屬螯合反應(yīng)等。用人工方法合成的抗體酶,可作為研究酶作用機(jī)理的有力工具,用于催化大量天然酶不能催化的立體專(zhuān)一性反應(yīng),更為開(kāi)發(fā)具有高度選擇性的藥物提供了新途徑。本文對(duì)抗體酶的設(shè)計(jì)策略、制備方法、催化反應(yīng)類(lèi)型、及應(yīng)用前景作了綜述。關(guān) 鍵 詞:抗體酶,過(guò)渡態(tài)類(lèi)似物,應(yīng)用 抗體酶(Abzyme)是一種新型人工酶制劑,它是依據(jù)對(duì)酶分子催化反應(yīng)機(jī)制的理解,結(jié)合免疫球蛋白的分子識(shí)別特性,應(yīng)用免疫學(xué)、細(xì)胞生物學(xué)、化學(xué)、分子生物學(xué)等技術(shù)制備的具有高度底物專(zhuān)一性及特殊催化活力的新型催化抗體并且具有典型的酶反應(yīng)特性:與配體(底物)結(jié)合的專(zhuān)一性,包括立體專(zhuān)一性并且其催化反應(yīng)的專(zhuān)一性可

3、以達(dá)到甚至超過(guò)天然酶的專(zhuān)一性;具有高效催化性,一般抗體酶催化反應(yīng)速率比非催化反應(yīng)快104108倍,有的反應(yīng)速度已接近于天然酶促反應(yīng)速度;抗體酶還具有與天然酶相近的米氏方程動(dòng)力學(xué)及pH依賴(lài)性等。如今由于抗體酶的多樣性、特異性和穩(wěn)定性,已經(jīng)形成了生物界中一個(gè)嶄新的超分子體系,它把免疫學(xué)、酶學(xué)理論的發(fā)展和抗體在醫(yī)藥、工業(yè)等領(lǐng)域的應(yīng)用推向一個(gè)新水平。近些年來(lái),其研究的技術(shù)日益先進(jìn),應(yīng)用范圍不斷拓寬,越來(lái)越受科學(xué)家們的關(guān)注。1 抗體酶的制備1.1 抗體酶的設(shè)計(jì)策略 目前大多數(shù)抗體酶是通過(guò)以設(shè)計(jì)合理的,將反應(yīng)過(guò)渡態(tài)類(lèi)似的小分子作為半抗原,繼而讓動(dòng)物免疫系統(tǒng)產(chǎn)生針對(duì)半抗原的抗體來(lái)獲得的。最早的設(shè)計(jì)策略涉及運(yùn)

4、用過(guò)渡態(tài)類(lèi)似物制備抗體酶,隨后,酶催化的化學(xué)本質(zhì)如鄰近反應(yīng)、酸堿催化、共價(jià)催化等也用于抗體酶的設(shè)計(jì)。目前,抗體酶的設(shè)計(jì)策略有:穩(wěn)定帶電過(guò)渡態(tài)、誘導(dǎo)和轉(zhuǎn)換設(shè)計(jì)、抗體作為熵阱效應(yīng)、反應(yīng)免疫、引入催化基因團(tuán)。1.1.1穩(wěn)定帶電過(guò)渡態(tài) 以過(guò)渡態(tài)類(lèi)似物作為半抗原,利用免疫系統(tǒng)的分子多樣性,則有可能誘導(dǎo)產(chǎn)生對(duì)過(guò)渡態(tài)類(lèi)似物特異性結(jié)合的抗體。這種抗體含有同底物反應(yīng)過(guò)渡態(tài)互補(bǔ)的結(jié)合空腔,因而和酶一樣,也能發(fā)生催化反應(yīng)。1.1.2誘導(dǎo)和轉(zhuǎn)換設(shè)計(jì) 誘導(dǎo)和轉(zhuǎn)換設(shè)計(jì)的原理是利用半抗原和抗體間的電荷互補(bǔ)性,即以帶電基團(tuán)為“誘餌”,在抗體結(jié)合部位誘導(dǎo)帶相反電荷的功能團(tuán),當(dāng)?shù)孜锊淮嬖凇罢T餌”的電荷時(shí),被誘導(dǎo)的功能團(tuán)將以一般酸

5、堿或親核催化對(duì)底物其它基團(tuán)發(fā)生作用。1.1.3抗體作為熵阱效應(yīng) 除穩(wěn)定帶電過(guò)渡態(tài)外,熵阱效應(yīng)對(duì)催化反應(yīng)也有決定性作用。熵阱是指催化劑以有利的定位方向結(jié)合底物的能力,因此限制了底物平動(dòng)和旋轉(zhuǎn)自由度,結(jié)果導(dǎo)致活性部位中底物的有效濃度增加。1.1.4反應(yīng)免疫 通過(guò)使用一個(gè)能和抗體發(fā)生反應(yīng)的化合物作為免疫原,促使抗體結(jié)合部位在免疫過(guò)程中發(fā)生特定的化學(xué)反應(yīng),誘導(dǎo)過(guò)程中抗體和抗原發(fā)生共價(jià)相互作用,產(chǎn)生的抗體同樣也可能催化類(lèi)似的反應(yīng)。1.1.5引入催化基團(tuán) 在抗體酶的結(jié)合部位引入催化基團(tuán),如果引入的催化基團(tuán)與底物結(jié)合部位取向正確,空間排布恰到好處,則應(yīng)產(chǎn)生高活力抗體酶。引入催化基團(tuán)的方法有:利用部位選擇性試

6、劑,以類(lèi)似親和標(biāo)記的方式定向的將催化基團(tuán)引入抗體;用蛋白質(zhì)工程技術(shù)引入帶催化基團(tuán)的氨基酸殘基。1.2 抗體酶的制備方法 制備抗體酶的方法有很多,如誘導(dǎo)法、拷貝法、化學(xué)修飾法、引入輔助分子法、天然來(lái)源抗體酶、基因工程法等。酶的基本概念如張力 、鄰近效應(yīng)、酸堿催化和共價(jià)催化等被用于抗體酶的設(shè)計(jì)。1.2.1誘導(dǎo)法 即單克隆技術(shù)也稱(chēng)為雜交瘤技術(shù)或體內(nèi)免疫法來(lái)制備。因?yàn)檫^(guò)渡態(tài)極不穩(wěn)定,是一種稍縱即逝的結(jié)構(gòu),其壽命約為 s,因此不可能用它對(duì)動(dòng)物進(jìn)行免疫。用一個(gè)或其它幾個(gè)原子或原子團(tuán)取代過(guò)渡態(tài)的特定原子或原子團(tuán)獲得在形狀、電性、酸堿性等諸方面與過(guò)渡態(tài)相似的穩(wěn)定物質(zhì),即過(guò)渡態(tài)相似物,然后用它作為半抗原和載體蛋

7、白一起對(duì)動(dòng)物進(jìn)行免疫,最后取免疫動(dòng)物的脾細(xì)胞與骨髓腫瘤細(xì)胞進(jìn)行雜交,其雜交細(xì)胞就會(huì)源源不斷地分泌單克隆抗體,進(jìn)過(guò)篩選和純化,可得抗體酶。在抗體酶的制備中,由于大多數(shù)反應(yīng)過(guò)渡態(tài)類(lèi)似物的分子質(zhì)量都較低,即所謂的半抗原,它們本身的免疫原性很弱,必須與某種載體偶聯(lián)才能表現(xiàn)免疫原性,最常見(jiàn)的載體蛋白包括牛血清蛋白(bovine serum albumin, BSA)和鑰孔血藍(lán)蛋白(keyhole limpet hemocyanin, KLH)。而抗體酶單克隆的方法也不斷發(fā)展?,F(xiàn)有酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)、競(jìng)爭(zhēng)性酶聯(lián)免疫吸附法(competivc ELISA)、催化酶聯(lián)免疫吸附法(catELISA)以

8、及用短過(guò)渡態(tài)類(lèi)似物片段進(jìn)行篩選等多種方法。國(guó)內(nèi)鄧超用meso四(a,a,a,a0苯乙酰苯)卟啉為抗原,通過(guò)動(dòng)物免疫、細(xì)胞融合等技術(shù)篩選細(xì)胞株3E4。該細(xì)胞株產(chǎn)生的抗體具有結(jié)合鐵卟啉的能力,且表現(xiàn)出過(guò)氧化物酶活力。 1.2.2拷貝法 用已知的酶作為抗原免疫動(dòng)物,通過(guò)單克隆技術(shù),制得抗該種酶的抗體,再以此種抗體免疫動(dòng)物,再次采用單克隆技術(shù),經(jīng)篩選與純化,就可獲得具有原來(lái)酶活性的抗體。因?yàn)榭乖c該抗原產(chǎn)生的抗體具有互補(bǔ)性,經(jīng)過(guò)上述兩次拷貝,就把酶的活性部位的信息翻錄到抗體酶上,使該抗體酶能高選擇性地催化原酶所催化的反應(yīng)。這種方法雖然不能產(chǎn)生新的催化反應(yīng),但對(duì)自然界來(lái)源稀少的緊缺酶,不失為一種有效的方

9、法。1.2.3化學(xué)修飾法 抗體酶和酶一樣也可以用化學(xué)修飾法的方法加以改造。對(duì)抗體酶進(jìn)行結(jié)構(gòu)修飾的關(guān)鍵是找到一種溫和的方法,在抗體結(jié)合位置或附近引入具有催化功能的基團(tuán)。游離巰基就是適合的基團(tuán)之一,具有高親和性、易于氧化及能通過(guò)二硫化物進(jìn)行交換反應(yīng)或親電反應(yīng)而選擇性修飾的特點(diǎn)。1.2.4引入輔助因子法 很多天然酶活性中心都含有金屬離子。將引入某輔助因子的半抗原通過(guò)共價(jià)鍵連接在載體蛋上免疫后產(chǎn)生的抗體,在金屬離子復(fù)合物作為輔助因子的參與下,這些抗體酶能選擇性地對(duì)肽鍵進(jìn)行水解。1.2.5天然來(lái)源抗體酶 在全身紅斑狼瘡病人的血清中已分離出抗體酶,它具有催化水解DNA的活性。表明在有免疫性缺陷的病人體內(nèi)存

10、在著抗體酶。1.2.6基因工程法-噬菌體展示技術(shù) 通過(guò)基因工程、蛋白質(zhì)工程將編碼的人工合成的基因轉(zhuǎn)入細(xì)菌或酵母菌的表達(dá)系統(tǒng),采用突變等手段隨機(jī)產(chǎn)生抗體,經(jīng)篩選和純化可得抗體酶。隨著DNA重組技術(shù)的進(jìn)展和人們對(duì)抗體分子認(rèn)識(shí)的深化,抗體技術(shù)由細(xì)胞工程抗體(雜交瘤單克隆抗體)發(fā)展到基因工程抗體,尤其是噬菌體抗體庫(kù)技術(shù)的出現(xiàn),將抗體工程推進(jìn)到了一個(gè)新的發(fā)展階段。隨后在噬菌體抗體庫(kù)技術(shù)的基礎(chǔ)上,人們又發(fā)展了噬菌體演示技術(shù)。這種技術(shù)將組建億萬(wàn)種不同特異性抗體可變區(qū)基因庫(kù)和抗體在大腸埃希菌功能性表達(dá)與高效快速的篩選手段結(jié)合起來(lái),徹底改變了抗體酶制備的傳統(tǒng)途徑,使抗體酶的制備和性能改良進(jìn)入了新的階段。噬菌體演

11、示技術(shù)不需要進(jìn)行細(xì)胞融合以獲得雜交瘤細(xì)胞,并且可篩選具有特定功能的未知結(jié)構(gòu),具有生產(chǎn)簡(jiǎn)單、價(jià)格低、降低抗體的免疫原性、易獲得稀有抗體的優(yōu)點(diǎn),因而顯示出有取代雜交瘤技術(shù)的趨勢(shì)。2 抗體酶的催化反應(yīng)類(lèi)型 抗體酶具有典型的酶反應(yīng)特征:與配體結(jié)合的專(zhuān)一性(包括立體專(zhuān)一性),可以達(dá)到甚至超過(guò)天然酶的專(zhuān)一性;具有高效性,比非催化反應(yīng)快倍,有些已經(jīng)接近天然酶反應(yīng)速度;具有與天然酶相近的米氏動(dòng)力學(xué)及pH依賴(lài)性等。由于抗體酶是人工設(shè)計(jì)的酶,理論上其催化范圍可以十分廣泛,隨著半抗原設(shè)計(jì)和抗體酶篩選技術(shù)的不斷發(fā)展,其品種還在不斷增加。催化的反應(yīng)類(lèi)型也在擴(kuò)大,其中有些反應(yīng)沒(méi)有天然的酶可以催化,抗體酶甚至可以使熱力學(xué)上

12、無(wú)法進(jìn)行的反應(yīng)得以進(jìn)行。抗體酶催化的反應(yīng)類(lèi)型包括酯水解、酰胺水解、?;D(zhuǎn)移、光誘導(dǎo)反應(yīng)、氧化還原反應(yīng)、Claisen重排反應(yīng)、金屬螯合反應(yīng)等。2.1 磷酸酯水解反應(yīng) 磷酸二酯鍵是自然界最穩(wěn)定的鍵之一,因此它的水解對(duì)抗體酶來(lái)說(shuō)是個(gè)主要的挑戰(zhàn)。Janda等利用穩(wěn)定的五配位氧代錸(V)配合物A模擬RNA水解時(shí)形成的環(huán)形氧代正膦中間物,產(chǎn)生單抗2G12,可以催化水解磷酸二酯。催化速率常數(shù)=1.53×,米氏常數(shù)=240 umol/L ;/=312。2.2 磺酸酯閉環(huán)反應(yīng) Lerner小組用脒基離子化合物(一種陽(yáng)離子過(guò)渡態(tài)類(lèi)似物)作為半抗原,產(chǎn)生的抗體(17G8)可以催化芳基磺酸酯B的閉合反應(yīng),

13、使B轉(zhuǎn)化為C(1,6- 二甲基環(huán)己烯)和D(2-甲烯-1-甲基環(huán)己烷)的混合物。2.3 ?;D(zhuǎn)移反應(yīng)生物體內(nèi)蛋白質(zhì)合成是一個(gè)復(fù)雜的過(guò)程。氨基酸在摻入肽鏈之前 必須進(jìn)行活化以獲得額外能量,活化過(guò)程即酰基轉(zhuǎn)移反應(yīng),又稱(chēng)酰基化反應(yīng)。1986年,Tramonatano 等成功研制首列?;D(zhuǎn)移抗體酶。Jacolson等設(shè)計(jì)了一個(gè)中性磷酸二酯作為反應(yīng)過(guò)渡態(tài)的穩(wěn)定類(lèi)似物,得到的單克隆抗體可以催化帶丙氨酸的胸腺嘧啶的氨酰化反應(yīng)反應(yīng)速率比無(wú)催化反應(yīng)的速度提高了倍。2.4 重排反應(yīng)Claisen重排反應(yīng)是有機(jī)化合物異構(gòu)化的一種重要形式,分枝酸鹽轉(zhuǎn)化為預(yù)苯酸鹽的反應(yīng)是細(xì)菌、真菌、植物體內(nèi)芳香氨基酸生物合成的關(guān)鍵一步

14、。Hilvert等設(shè)計(jì)了一個(gè)椅式構(gòu)象的氧雜雙環(huán)化合物作為反應(yīng)的過(guò)渡態(tài)類(lèi)似物,制備出了可催化分枝酸生成預(yù)苯酸這樣一個(gè)Clasien重排反應(yīng)的酶,誘導(dǎo)的抗體酶比原反應(yīng)速度加快倍。而且還觀察到新抗體酶表現(xiàn)出了高度的立體專(zhuān)一性,它只催化(-)分枝酸為底物的反應(yīng),對(duì)(+)公枝酸無(wú)作用。2.5 氧化-還原反應(yīng)氧化還原反應(yīng)在生物體內(nèi)十分廣泛,如呼吸鏈上的系列反應(yīng)。Shokat制得了對(duì)氧化態(tài)=8 mmol/L,對(duì)還原態(tài)=300 nmol/L的抗體,使標(biāo)準(zhǔn)電位變?yōu)?40 mV。由于黃素還原態(tài)的還原范圍擴(kuò)大,使一些原來(lái)無(wú)法按其還原的物質(zhì)(標(biāo)準(zhǔn)還原電位差大于無(wú)抗體酶催化的黃素標(biāo)準(zhǔn)還原電位差)得以還原。這意味著抗體酶

15、可以使熱力學(xué)上原來(lái)無(wú)法進(jìn)行的氧化還原反應(yīng)得以進(jìn)行。2.6 金屬螯合反應(yīng)金屬螯合反應(yīng)對(duì)于輔酶、輔因子和酶的結(jié)合來(lái)說(shuō)意義重大。P.G.Schultz等用G-甲基卟啉誘導(dǎo)產(chǎn)生的抗體可催化平面狀卟啉的金屬螯合反應(yīng),該抗體不僅可催化和卟啉的螯合,還可催化和卟啉的螯合。實(shí)驗(yàn)表明,抗體酶對(duì)其中某些金屬卟啉具有很高的親合力,意味著可以研制抗體血紅素復(fù)合物為催化劑催化氧還反應(yīng),電子傳遞反應(yīng)等。2.7 光誘導(dǎo)反應(yīng)光誘導(dǎo)反應(yīng)包括光聚合反應(yīng)和光裂解反應(yīng)。這兩類(lèi)反應(yīng)在植物體內(nèi)顯得尤為重要。DNA的修復(fù)也涉及到光誘導(dǎo)反應(yīng),Cochran對(duì)胸腺嘧啶二聚體光解進(jìn)行研究,發(fā)現(xiàn)天然光復(fù)活酶的活性中心是色氨酸,由此找到相應(yīng)的抗體酶

16、IgG15F1-3B1,此抗體的轉(zhuǎn)換數(shù)(T.N.)和光復(fù)活酶相近。Balan研究了光聚合反應(yīng)的抗體酶,通過(guò)誘導(dǎo)法,得到的抗體酶催化效率雖不高,但也使反應(yīng)速度提高了2.5倍。3 抗體酶的利用價(jià)值 從抗體酶的實(shí)踐看出,抗體酶是研究酶作用機(jī)理的有力工具。酶抑制劑的研究支持了Pauling過(guò)渡態(tài)理論,但它只能提供作用過(guò)程中結(jié)合專(zhuān)一性的信息,不能給出結(jié)合后發(fā)生催化反應(yīng)以及結(jié)合與催化之間的關(guān)系??贵w酶實(shí)驗(yàn)則彌補(bǔ)了這一缺陷。 除了基礎(chǔ)理論研究的價(jià)值,抗體酶的應(yīng)用前景也令人鼓舞。Lerner指出,若將催化水解反應(yīng)的抗體酶研究深入下去,極有可能得到一種新型蛋白酶,這種抗體酶在醫(yī)學(xué)上可用來(lái)專(zhuān)一破壞病毒蛋白質(zhì)及清除

17、體內(nèi)“垃圾”。Lerner還提到,將具有立體專(zhuān)一性的抗體酶應(yīng)用 于制藥工業(yè),將有助于解決對(duì)映體拆分的難題。隨著制備抗體酶新方法的不斷發(fā)展,抗體酶的催化反應(yīng)的范圍將進(jìn)一步拓寬特別是對(duì)那些天然酶不能催化的反應(yīng),則可研制抗體酶來(lái)進(jìn)行催化。 其次,抗體酶的研究,為人們提供了一條合理途徑去設(shè)計(jì)適合于市場(chǎng)需要的蛋白質(zhì),即人為地設(shè)計(jì)制作酶。這是酶工程的一個(gè)全新領(lǐng)域。例如:利用動(dòng)物免疫系統(tǒng)產(chǎn)生抗體的高度專(zhuān)一性,可以得到一系列高度專(zhuān)一性的抗體酶,成為針對(duì)性強(qiáng)、藥效高的藥物,于是生產(chǎn)高純度立體專(zhuān)一性的藥物成為現(xiàn)實(shí)。又如:以某個(gè)生化反應(yīng)的過(guò)渡態(tài)類(lèi)似物來(lái)誘導(dǎo)免疫反應(yīng),產(chǎn)生特定抗體酶,以治療某種酶先天性缺陷的遺傳病???/p>

18、體酶還可有選擇地使病毒外殼蛋白的肽鍵裂解,從而防止病毒與靶細(xì)胞結(jié)合。另外,抗體酶的固定化已獲得成功,將大大地推進(jìn)工業(yè)化進(jìn)程。4 存在的問(wèn)題與展望 抗體酶的研究雖然已經(jīng)取得了長(zhǎng)足的發(fā)展,但是目前所得到的抗體酶的催化效率還較低,其根本原因是由于使用過(guò)渡態(tài)類(lèi)似物制備抗體,過(guò)渡態(tài)類(lèi)似物畢竟不是過(guò)渡態(tài)本身,其形狀、電性、鍵長(zhǎng)、鍵角、極性等均有差異,其轉(zhuǎn)動(dòng)和振動(dòng)能級(jí)也不相同。因此,要得到高效率的抗體酶,選擇過(guò)渡態(tài)類(lèi)似物是關(guān)鍵,過(guò)渡態(tài)類(lèi)似物的選擇依賴(lài)于人們對(duì)反應(yīng)過(guò)渡態(tài)的全面了解,而化學(xué)反應(yīng)的過(guò)渡態(tài)極不穩(wěn)定,有些即使在攝氏零下幾十度,仍然難以將其俘獲。另外天然酶催化反應(yīng)中有許多輔助因子參加,如何將輔助因子引入

19、到抗體酶中以拓寬抗體酶研究值得探索。同時(shí),對(duì)多酶體系或是單酶體系通過(guò)多個(gè)基元完成的催化反應(yīng),中間要經(jīng)過(guò)多個(gè)過(guò)渡態(tài),如何用單一過(guò)渡態(tài)類(lèi)似物誘導(dǎo)出高效率的抗體酶也是富有挑戰(zhàn)性的問(wèn)題。雖然在抗體酶的研究上存在一些問(wèn)題,但抗體酶的重要價(jià)值卻引起了化學(xué)家、生物學(xué)家、免疫學(xué)家及酶學(xué)研究者的格外關(guān)注。抗體酶是當(dāng)今科學(xué)前沿多學(xué)科的交叉領(lǐng)域,它突破了傳統(tǒng)的膠束、配位化合物、印跡分子等模擬酶的框架,開(kāi)辟了嶄新的模擬酶研究方向和催化劑研究的新領(lǐng)域,無(wú)論是在理論探索方面或是實(shí)際應(yīng)用方面都已顯示出潛在的應(yīng)用價(jià)值。 參考文獻(xiàn)1 由德林. 酶工程原理M. 北京:科學(xué)出版社,2011.2 梅樂(lè)和,岑沛霖.現(xiàn)代酶工程M. 北京

20、:化學(xué)工業(yè)出版社,20063 袁勤生,趙健.酶與酶工程M. 上海:華東理工大學(xué)出版社,2005.4 施巧琴. 酶工程M北京:科學(xué)出版社,2010.5 王夢(mèng)陽(yáng),陳海麗.簡(jiǎn)述抗體酶J. 河南化工,2010,27(8):53.6 陳蘇婷. 抗體酶的研究進(jìn)展EB. 中國(guó)科技論文在線, 2005. Abzyme preparation and application prospectYan Chaojie ,Liu Qing ,Chen Jian ,Zhou You ,Yang Youliuye ,Niu Ben(School of Bioscience and Engineering ,Shaanxi University of Technology Hanzhong, 723000)【Abstract 】 Abzyme,as both an antibody and an enzyme,is a kind of antibody used as catalysts,which catalyses many chemical reactions,e.g. acyl

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