蛋白質(zhì)與酶工程知識點(完)---僅供參考

1、1、易錯PCR:通過調(diào)整反應(yīng)條件來使PCR擴增過程中復(fù)制錯配率增加，在目的基因中隨機引入突變，繼而獲得蛋白質(zhì)分子的隨機突變體 * 提高鎂離子濃度或加入錳離子 * 降低體系中一種的dNTP濃度（至少5-10%） * 運用低保真度DNA聚合酶 * 增加DNA聚合酶的濃度 屬于無性進化：單一基因內(nèi)進行遺傳突變，費力、耗時，多用于小片段（800bp以下）2、 酶的概念：酶是一類由活細胞產(chǎn)生的，對其特異底物（substrate）具有高效催化作用的生大分子，包括蛋白質(zhì)和核酸3、 輔酶 :與酶蛋白結(jié)合疏松，可用透析或超濾的方法除去(NAD+)。 輔基 :與酶蛋白結(jié)合緊密，不能用透析或超濾的方法除去(FAD、

2、FMN) 酶的活性中心 ：或稱活性部位，指必需基團在空間結(jié)構(gòu)上彼此靠近，組成具有特定空間結(jié)構(gòu)的區(qū)域，能與底物特異結(jié)合并將底物轉(zhuǎn)化為產(chǎn)物。 4、抗體酶或催化抗體 ：是具有催化功能的抗體。本質(zhì)：免疫球蛋白，即具有催化作用的免疫球蛋白5、酶促反應(yīng)特點：1 酶促反應(yīng)具有極高的效率 2 酶促反應(yīng)具有高度的特異性：絕對特異性、相對特異性、立體結(jié)構(gòu)特異性3 酶促反應(yīng)的可調(diào)節(jié)性：對酶量的調(diào)節(jié)，對酶活性的調(diào)節(jié)6、 誘導(dǎo)契合假說：酶與底物相互接近時，其結(jié)構(gòu)相互誘導(dǎo)、相互變形和相互適應(yīng)，進而相互結(jié)合。這一過程稱為酶-底物結(jié)合的誘導(dǎo)契合假說 。7、 底物濃度對反應(yīng)速度的影響：1 當(dāng)?shù)孜餄舛容^低時：反應(yīng)速度與底物濃度成

3、正比；反應(yīng)為一級反應(yīng)。2 隨著底物濃度的增加：反應(yīng)速度不再成正比例加速；反應(yīng)為混合級反應(yīng)。3 當(dāng)?shù)孜餄舛雀哌_一定程度：反應(yīng)速度不再增加，達最大速度；反應(yīng)為零級反應(yīng)8、 Km與Vmax的意義9、 不可逆性抑制作用：抑制劑通常以共價鍵與酶活性中心或活性中心以外的必需基團相結(jié)合，使酶失活。 可逆性抑制作用：抑制劑通常以非共價鍵與酶或酶-底物復(fù)合物可逆性結(jié)合，使酶的活性降低或喪失；抑制劑可用透析、超濾等方法除去。類型：競爭性抑制、非競爭性抑制、反競爭性抑制。三種抑制劑的特點10、 酶的調(diào)節(jié)：v 酶活性的調(diào)節(jié)（快速調(diào)節(jié)）1 酶原與酶原的激活2 變構(gòu)（別構(gòu)）酶3 酶的共價修飾調(diào)節(jié)v 酶含量的調(diào)節(jié)（緩慢調(diào)節(jié)

4、）1 酶蛋白合成的誘導(dǎo)和阻遏2 酶降解的調(diào)控11、 酶原激活的意義 避免細胞產(chǎn)生的酶對細胞進行自身消化，并使酶在特定的部位和環(huán)境中發(fā)揮作用，保證體內(nèi)代謝正常進行。（消化管內(nèi)的蛋白酶）有的酶原可以視為酶的儲存形式。在需要時，酶原適時地轉(zhuǎn)變成有活性的酶，發(fā)揮其催化作用。（凝血酶與纖溶酶類）12、 變構(gòu)調(diào)節(jié)一些代謝物可與某些酶分子活性中心外的某部分可逆地結(jié)合，使酶構(gòu)象改變，從而改變酶的催化活性，此種調(diào)節(jié)方式稱變構(gòu)調(diào)節(jié)13、 兩種操縱子：乳糖操縱子、色氨酸操縱子14：細胞破碎法：v 實驗室小規(guī)模1 旋刀勻漿法2 研磨法3 高速珠磨法4 反復(fù)凍融5 滲透壓破碎法6 超聲勻漿法v 大規(guī)模提取：高壓勻漿法1

5、5、 解吸方法-洗脫原理 加大反離子的濃度，常用的反離子是NaCl 改變?nèi)芤旱膒H（改變結(jié)合基團的電荷） 同時改變pH與離子強度交換劑選擇的一般原則： *酶蛋白穩(wěn)定存在的pH<pI，用陽離子交換劑 *酶蛋白穩(wěn)定存在的pH>pI，用陰離子交換劑 *兩種pH條件下均能穩(wěn)定存在，二種交換劑均可 4、蛋白質(zhì)與酶的結(jié)構(gòu)和功能 16、 氨基酸的分類：17、 拉氏構(gòu)象圖：兩相鄰肽鍵平面可相對旋轉(zhuǎn)（構(gòu)象角,）：圍繞C旋轉(zhuǎn)的構(gòu)象與角度18、蛋白質(zhì)一級結(jié)構(gòu)：多肽鏈中氨基酸的排列順序。主要化學(xué)鍵：肽鍵（+二硫鍵）19、 螺旋(-helix)：多肽鏈的主鏈原子沿一中心軸盤繞所形成的有規(guī)律的右手螺旋構(gòu)象。簡

6、言之，各個肽平面圍繞同一軸旋轉(zhuǎn)形成的右手螺旋構(gòu)象。兩親性螺旋：（重要）氨基酸側(cè)鏈從螺旋骨架伸出，形成螺旋表面一側(cè)親水（帶電、極性），一側(cè)疏水（易形成疏水內(nèi)核或疏水表面聚合）的特性。螺旋轉(zhuǎn)輪：螺旋沿著螺旋軸的二維投射圖，可以判斷alpa螺旋是否具有兩親性。影響-螺旋穩(wěn)定因素： 側(cè)鏈基團空間位阻：如Ile、Trp、Phe側(cè)鏈基團； 連續(xù)氨基酸側(cè)鏈基團帶有相同電荷（同種電荷互斥） Pro等亞氨基酸存在（不能形成氫鍵,且C參與吡咯環(huán)形成，環(huán)內(nèi)C-N和C-N鍵不能旋轉(zhuǎn)）。20、 motif 的層次、線性motif 的概念（重要）21、四級結(jié)構(gòu)：兩條和兩條以上多肽寡聚蛋白或多聚蛋白質(zhì)形成的高級結(jié)構(gòu)。亞基種

7、類、數(shù)目、空間排布以及亞基互作是四級結(jié)構(gòu)穩(wěn)定因素。 5、 蛋白質(zhì)與酶的修飾技術(shù)1、 酶分子修飾的概念和意義：概念：通過各種方法改變蛋白/酶的分子結(jié)構(gòu)，從而改變其某些特性和功能。主要途徑有化學(xué)途徑和分子生物學(xué)途徑。意義：1 提高蛋白/酶的活力,滿足/適應(yīng)生產(chǎn)工藝的要求2 增強蛋白/酶的穩(wěn)定性3 提高、降低或消除蛋白/酶的抗原性4 研究和了解蛋白/酶的結(jié)構(gòu)：5 彌補天然蛋白的不足，賦予優(yōu)良性狀2、化學(xué)修飾的手段與方法：經(jīng)常被修飾的殘基：親核：絲、半胱、甲硫、蘇、賴、組 親點：酪、色3、側(cè)鏈基團的修飾（1）羧基修飾反應(yīng)-水溶性碳二亞胺類（最標準）、硼氟化三甲烊鹽（2）氨基修飾：采用某些化合物使酶分子

8、側(cè)鏈氨基發(fā)生改變，從而改變酶蛋白的空間構(gòu)象的方法稱為氨基修飾1 亞硝酸 2 2，4，6-三硝基苯磺酸（TNBS）、34（3）巰基修飾：巰基在許多酶中是活性中心的催化基團，巰基還可與另一巰基形成二硫鍵，因此對穩(wěn)定酶的結(jié)構(gòu)和發(fā)揮催化功能具有重要的作用。常用修飾劑：烷基化試劑（碘乙酸、碘乙酰胺）、馬來酰亞胺（4）咪唑基修飾：組氨酸(咪唑基)位于許多酶的活性性中心。常用咪唑基修飾劑：焦碳酸二乙酯（DPC）和碘代乙酸（5）酚羥基（酪氨酸）修飾反應(yīng)：Tyr（酪氨酸）殘基修飾主要是酚羥基的修飾，Thr和Ser殘基修飾為羥基修飾，但反應(yīng)條件苛刻（6）胍基(精氨酸）化學(xué)修飾反應(yīng)：采用二羰基化合物與胍基反應(yīng)生成穩(wěn)

9、定的雜環(huán)，從而改變酶分子空間構(gòu)象的方法。修飾劑：丁二酮、1，2-環(huán)己二酮、丙二醛和苯乙二醛（二羰基化合物）（7）吲哚基(色氨酸)化學(xué)修飾反應(yīng)：4、 大分子結(jié)合（共價）修飾：修試劑：聚乙二醇（PEG）、單甲氧基聚乙二醇（MPEG）、右旋糖酐5、分子內(nèi)交聯(lián)修飾：雙功能基團化合物（雙功能試劑）：戊二醛、己二胺、葡聚糖二乙醛等，在酶蛋白分子中相距較近的兩個側(cè)鏈基團之間形成共價交聯(lián)，從而提高酶穩(wěn)定性的修飾方法。6、金屬離子置換修飾：把酶分子中的金屬離子換成另一種金屬離子，使酶的特性和功能發(fā)生改變的修飾方法。作用如下：1 闡明金屬離子對酶催化作用的影響2 提高酶活力3 增強酶的穩(wěn)定性4 改變酶的動力學(xué)特性

10、7、 氨基酸化學(xué)置換修飾：將酶分子肽鏈上的某一個氨基酸換成另一個氨基酸的修飾方法。缺點：難度大，成本高，專一性差，而且對酶分子逐個進行修飾，操作復(fù)雜，難以工業(yè)化生產(chǎn)。8、 蛋白質(zhì)片段嵌合修飾：一個天然多肽與一個人造多肽（或化學(xué)修飾）相締合，產(chǎn)生半合成結(jié)構(gòu)9、 分子生物學(xué)方法：定點突變技術(shù) 10:、細胞內(nèi)修飾： 6、蛋白質(zhì)與酶分子設(shè)計1、 蛋白質(zhì)分子設(shè)計的分類1 “小改”：定位突變和化學(xué)修飾2 “中改”：結(jié)構(gòu)域進行拼接組裝3 “大改”：完全從頭設(shè)計全新的蛋白質(zhì)2、蛋白質(zhì)與酶分子設(shè)計原理（重要）1 內(nèi)核假設(shè)：蛋白質(zhì)在進化中，由氫鍵連接的二級結(jié)構(gòu)保守內(nèi)部單元組成區(qū)域（骨架）。2 內(nèi)部密堆積，無重疊。

11、3 內(nèi)部氫鍵是最大限度滿足的(主鏈及側(cè)鏈)。4 最優(yōu)的氨基酸側(cè)鏈幾何排列5 疏水基團與親水基團需合理分布：需安排少量的疏水基團在表面，少量的親水基團在內(nèi)部。6 金屬蛋白配位殘基的替換應(yīng)滿足金屬配位幾何，且金屬中心與外圍第二殼層相互作用十分重要7 結(jié)構(gòu)和功能具有專一性（蛋白質(zhì)設(shè)計最困難問題3、 先導(dǎo)化合物：即原型物，是通過各種途徑或方法得到的具有一定生物活性的化學(xué)物質(zhì)，有可能進一步優(yōu)化（活性不高、特異性差、毒副作用大、或藥代動力學(xué)性質(zhì)差）而得到供臨床使用的藥物。4、不同氨基酸的特征：估計就選擇：5、從頭設(shè)計法：是指基于對蛋白質(zhì)折疊規(guī)律的認識，從氨基酸的序列出發(fā)，設(shè)計制造自然界中不存在的全新蛋白質(zhì)

12、，使之具有特定的空間結(jié)構(gòu)和預(yù)期的功能。8、 固定化酶與固定化細胞1、 酶固定化：采用各種方法，將酶與水不溶性載體結(jié)合，制備固定化酶的過程成為酶的固定化。方法：吸附法、包埋法、結(jié)合法、交聯(lián)法.2、 四種方法的比較1) 吸附法： 利用各種固體吸附劑將酶或含酶細胞吸附在其表面上而使酶固定的方法，又稱為物理吸附法常用吸附劑：活性炭、氧化鋁、硅藻土、多孔陶瓷優(yōu)點：操作簡便、條件溫和、不易變性失活、載體廉價、可反復(fù)使用。缺點：酶與載體結(jié)合不牢固，易脫落2) 包埋法：將酶或含酶菌體包埋在各種多孔載體中，使酶固定化的方法。根據(jù)包埋的材料和包埋方法的不同，可分為：凝膠包埋法和半透膜包埋法（微囊化法） 凝膠包埋法

13、：半透膜包埋法：適用于底物和產(chǎn)物都是小分子的酶的固定化。半透膜：聚酰胺膜、火棉 膠膜等3) 結(jié)合法：分為離子鍵結(jié)合法和共價鍵結(jié)合法離子鍵結(jié)合法：通過離子鍵使酶與載體結(jié)合的固定化方法。載體：DEAE-纖維素、TEAE-纖維素、DEAE-葡聚糖凝膠、CM-纖維素。優(yōu)點：條件溫和、操作簡便、活力損失少。缺點：酶與載體結(jié)合不牢固，使用時需嚴格控制好pH值、離子強度、溫度等操作條件。共價鍵結(jié)合法：通過共價鍵使酶與載體結(jié)合的固定化方法。載體：纖維素、瓊脂糖凝膠、葡聚糖凝膠、甲殼質(zhì)、氨基酸共聚物、甲基丙烯醇共聚物等。方法：重氮法、疊氮法、溴化氰發(fā)、烷基化法4) 交聯(lián)法：利用雙功能試劑，在酶分子間或酶與載體間

14、，或酶與惰性蛋白間進行交聯(lián)反應(yīng)，以制備固定化酶的方法。交聯(lián)試劑：戊二醛（常用）、己二胺、順丁烯二酸酐、雙偶氮苯等。 優(yōu)點：結(jié)合牢固，酶不會脫落，可長時間使用。 缺點：交聯(lián)反應(yīng)條件激烈，酶的多個基團被交聯(lián)，致使酶的活力損失大。制備的固定化酶顆粒較小，不便于使用。2、細胞的固定化：固定在載體上并在一定空間范圍內(nèi)進行生命活動的細胞。常用凝膠包埋法優(yōu)點：缺點：3、固定化酶優(yōu)點：缺點：9、 酶的非水相催化1、 非水介質(zhì)酶催化反應(yīng)優(yōu)點：2、酶的非水相催化類型：1) 有機介質(zhì)中的酶催化：酶在含有一定量水（結(jié)合水和溶劑水）的有機溶劑中進行的催化反應(yīng)。反應(yīng)體系：A.微水介質(zhì)體系、B.與水溶性有機溶劑組成的均一體

15、系、C.與水不溶性有機溶劑組成的兩相或多相體系、D.正膠束體系（水包油）、E.反膠束體系（油包水） 適用于：疏水性物質(zhì)（底物或產(chǎn)物）的酶催化作用反應(yīng)體系：兩相界面進行最適水含量：催化反應(yīng)速度達到最大時的水含量 水活度：描述有機溶劑中酶活性與水含量關(guān)系，即為一定壓力和溫度下，反應(yīng)體系中的水摩爾分數(shù)與水活度系數(shù)的乘積。它看直接反映體系中的水分情況，與反應(yīng)體系中的水含量和有機溶劑的極性無關(guān)。不同的酶有不同的最佳水活度。 極性系數(shù)lgP：反應(yīng)有機溶劑與酶活力之間的關(guān)系（P為溶劑在正辛醇和水中的分配系數(shù)）。lgP越大，表明其極性越小，疏水性越強。v 極性較強有機溶劑，會奪取酶分子的結(jié)合水，影響酶分子微環(huán)境水化層，降低酶催化活性，甚至導(dǎo)致酶變性失活。一般選用2lgP4的有機溶劑作為有機介質(zhì)為宜2) 氣相介質(zhì)中的酶催化：適于底物為氣體或者能夠轉(zhuǎn)化為氣體物質(zhì)的酶催化反應(yīng)。3) 超臨界流體介質(zhì)中的酶催化：v 超臨界流體：溫度和壓力超過某物質(zhì)超臨界點的流體。常見的有：CO2、水、氨、甲醇、乙醇、乙烯。v 超臨界流體具備的條件：4) 離子液介質(zhì)中的酶催化：v 離子液：在室溫條件下，有機/無機陰-陽離子低熔點鹽液，呈