CCK8操作說(shuō)明和檢測(cè)步驟

1、CCK8操作說(shuō)明和檢測(cè)步臊DO JINDO操作說(shuō)明細(xì)胞活性檢測(cè)1 .在96 孔板中接種細(xì)胞懸液（100 ml /孔）。將培養(yǎng)板放在培養(yǎng)箱預(yù)培養(yǎng)（在 37匕，5$C02的條件下）。2 .向每孔加入10 ml的CCK-8溶液 （注意不要在孔中生成氣泡，它們會(huì)影響 0. D值 的讀數(shù)）O3 .將培養(yǎng)板在培養(yǎng)箱內(nèi)孵育1-4小時(shí)。4 .用酶標(biāo)儀測(cè)定在450 nm處的吸光度。5 . 如果笛時(shí)不測(cè)定0.D值，打算以后測(cè)定的話，可以向每孔中加入10 ml 0.1 M HCI溶 液或者1與w/vSDS溶液，并遮蓋培養(yǎng)板避光保存在室溫條件下。在24小時(shí)內(nèi)吸光度不會(huì) 發(fā)生變化。細(xì)胞增殖-毒性檢測(cè)1 .在96 孔板中

2、配制100 ml的細(xì)胞懸液。將培養(yǎng)板在培養(yǎng)箱預(yù)培養(yǎng)24小時(shí)（在 37,5$C02的條件下）,>2 .向培養(yǎng)板加入10 ml不同濃度的待測(cè)物質(zhì)。3 .將培養(yǎng)板在培養(yǎng)箱孵育一段適當(dāng)?shù)臅r(shí)間（例如：6,12, 24或48小時(shí)）。4 .向每孔加入10 ml CCK-8 溶液（注意不要在孔中生成氣泡，它們會(huì)影響 0.D值的讀 數(shù)）O5 . 將培養(yǎng)板在培養(yǎng)箱內(nèi)孵育1-4小時(shí)。6 .用酶標(biāo)儀測(cè)定在450 nm處的吸光度。7 . 如果笛時(shí)不測(cè)定0.D值，打算以后測(cè)定的話，可以向每孔中加入10 ml 0.1 M HCI溶 液或者1與w/vSDS溶液，并遮蓋培養(yǎng)板避光保存在室溫條件下。在24小時(shí)內(nèi)吸光度不會(huì)

3、發(fā)生變化。注意：如果待測(cè)物質(zhì)有氧化性或還原性的話，可在加CCK-8之前更換新鮮培養(yǎng)基，去掉藥 物的影響。當(dāng)然藥物影響比較小的情況可以不更換培養(yǎng)基，直接扣除培養(yǎng)基中加入藥物后的 空白吸收即可。制作標(biāo)準(zhǔn)曲線1 . 先用細(xì)胞計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)所制備的細(xì)胞懸液中的細(xì)胞數(shù)量，然后接種細(xì)胞。2 .按比例 （例如：1/2比例） 依次用培養(yǎng)基等比稀釋成一個(gè)細(xì)胞濃度梯度，一般要 做 3-5個(gè)細(xì)胞濃度梯度，每組3-6個(gè)復(fù)孔o(hù)3 .接種后培界2-4 小時(shí)使細(xì)胞貼壁，然后加 CCK-8試劑培養(yǎng)一定時(shí)間后測(cè)定0.D值, 制作出一條以細(xì)胞數(shù)量為橫坐標(biāo)（X軸），0.D值為縱坐標(biāo)（Y軸）的標(biāo)準(zhǔn)曲線。根據(jù) 此標(biāo)準(zhǔn)曲線可以測(cè)定出未知樣品

4、的細(xì)胞數(shù)量 （使用此標(biāo)準(zhǔn)曲線的前提條件是實(shí)臉的條件要 一致，便于確定細(xì)胞的接種數(shù)量以及加入CCK-8后的培養(yǎng)時(shí)間）。DO JINDO檢測(cè)步驟CCK-8檢測(cè)步驟1 .向各孔中加入100 u I細(xì)胞懸液。a）2 .在37下預(yù)孵育培養(yǎng)板。b）3 .向各孔中加入各濃度的待測(cè)溶液c） 10 Rio4 . 37下孵育。5 .向各孔中加入10 u I的CCK-8溶液d）。6 . 37下孵育1-4小時(shí)。e）7 .測(cè)定450 nm處的0D值。a）使用適當(dāng)?shù)呐囵B(yǎng)基制備50, 000700, 000個(gè)/ml的細(xì)胞懸液。b）建議使用C02培養(yǎng)箱過(guò)夜預(yù)培養(yǎng)。c）使用培養(yǎng)基或PBS來(lái)制備溶液。d）如果待測(cè)溶液有還原性，測(cè)

5、定不含細(xì)胞，但含有CCK-8的待測(cè)溶液在450 nm 處的空白吸光度。如果該吸光度很小，則可以直接加入CCK-8 ,如果吸光度相 對(duì)較大，則需要除去培養(yǎng)基，并用培養(yǎng)基洗滌細(xì)胞兩次，然后加入新的100 U I 培養(yǎng)基和10 u I CCK-8進(jìn)行檢測(cè)。e）白細(xì)胞可能需要培養(yǎng)較長(zhǎng)時(shí)間?；盍τ?jì)算細(xì)胞活力* （%）二A（加藥）-A （空白）/A （0加藥）-A （空白）X100A （加藥）：具有細(xì)胞、CCK-8溶液和藥物溶液的孔的吸光度A （空白）：具有培養(yǎng)基和CCK-8溶液而沒(méi)有細(xì)胞的孔的吸光度A （0加藥）：具有細(xì)胞、CCK-8溶液而沒(méi)有藥物溶液的孔的吸光度*細(xì)胞活力：細(xì)胞增殖活力或細(xì)胞毒性活力問(wèn)

6、答：1 . 一個(gè)孔中應(yīng)接種多少個(gè)細(xì)胞？當(dāng)使用標(biāo)準(zhǔn)96孔板時(shí)，貼壁細(xì)胞的最小接種量至少為1,000個(gè)/孔（100 u I培養(yǎng)基）。檢 測(cè)白細(xì)胞時(shí)的靈敏度相對(duì)較低，因此推薦接種量不低于2,500個(gè)/孔（100 ul培養(yǎng)基）。 如果要使用24孔板或6孔板實(shí)臉，請(qǐng)先計(jì)算每孔相應(yīng)的接種量，并按照每孔培養(yǎng)基總體積 的10舟加入00«8溶液。2 .能否用384孔板進(jìn)行試驗(yàn)？可以。向各孔中加入培養(yǎng)基體積10$的CCK-8溶液，如果加入的CCK-8體積太少，可以先將 CCK-8溶液稀釋1倍，然后加入培養(yǎng)基體積20$的量。3 .能否用24孔板進(jìn)行試驗(yàn)？可以。向各孔中加入培養(yǎng)基體積10$的CCK-8溶液。

7、4 .酚紅會(huì)影響檢測(cè)嗎？不會(huì)。培養(yǎng)基中酚紅的吸光度可以在計(jì)算時(shí)，通過(guò)扣除空白孔中本底的吸光度而消去，因此 不會(huì)對(duì)檢測(cè)造成影響°5 . CCK-8與的菩結(jié)合檢測(cè)之間是否有相關(guān)性？有。然而，請(qǐng)注意由于CCK-8使用的檢測(cè)原理與的苔檢測(cè)的不同，因此結(jié)果可能不同。6 . CCK-8能否檢測(cè)細(xì)菌細(xì)胞？可以檢測(cè)E.coli,但不能檢測(cè)酵母細(xì)胞。向100 1 I E.coli培養(yǎng)液中加入10 u I CCK-8 溶液，并培養(yǎng)1-4個(gè)小時(shí)或過(guò)夜。7 . CCK-8穩(wěn)定嗎？CCK-8在0-5匕下能夠保存至少6個(gè)月，在-20C下避光可以保存1年。如果需要長(zhǎng)期保存， 我們推薦-20的儲(chǔ)藏條件。8 .如果沒(méi)

8、有450 nm的濾光片，還可以使用哪些其他濾光片？還可使用450 nm到490 nm之間的濾光片。9 .如何減少由于CCK-8試劑在槍頭上或孔壁上的殘留所帶來(lái)的誤差？可以在加樣前用培養(yǎng)基稀釋CCK-8試劑并混勻后加樣。10 . CCK-8是什么顏色？應(yīng)該是粉紅色。若顏色不一樣，有可能會(huì)影響測(cè)定。11 . CCK8能否對(duì)活細(xì)胞進(jìn)行染色？不能。因?yàn)镃CK8的主要成分是一種水溶性的四喳鹽(WST8),并通過(guò)電子載體IMethoxy PMS 將活細(xì)胞中的電子交換到培養(yǎng)基中的WST8上。由于生成的甲a也是高度水溶性的，因此 CCK8不能對(duì)細(xì)胞進(jìn)行染色。12 . CCK8檢測(cè)溶液對(duì)細(xì)胞是否有毒？CCK8溶

9、液自身因?yàn)楦邼舛鹊腎Methoxy PMS的存在而具有一點(diǎn)毒性。但是，加到培養(yǎng)基中的 CCK8是沒(méi)有毒性的，因?yàn)楸幌♂屃?10倍。因此，長(zhǎng)時(shí)間的培養(yǎng)，如過(guò)夜或者培養(yǎng)數(shù)天是可 以的。同一個(gè)細(xì)胞培養(yǎng)液在CCK8檢測(cè)后還可以用于其他細(xì)胞增殖檢測(cè)，如結(jié)晶紫檢測(cè)，中 性紅檢測(cè)或者DNA熒光檢測(cè)等。由于每種細(xì)胞對(duì)于CCK8的耐受力都不同，因此在需要進(jìn)行 長(zhǎng)時(shí)間培養(yǎng)時(shí)，先檢測(cè)一下細(xì)胞在加入CCK8培養(yǎng)后的活力。13 .在做加藥實(shí)臉時(shí)，藥物對(duì)測(cè)定是否有影響？如何解決？有時(shí)會(huì)有影響。如果藥物具有還原性，會(huì)和CCK8發(fā)生顯色反應(yīng)，增加吸光度。解決辦法： 首先要確認(rèn)藥物是否有吸收，在含有藥物的培養(yǎng)基中加入CCK8,

10、測(cè)定450 nm的吸光度，如 果它的吸光度比不含藥物的培養(yǎng)基（加CCK8）的吸光度高，則證明藥物有影響，可在加CCK8 之前更換培養(yǎng)基，去掉藥物的影響。14 .每次測(cè)定的數(shù)值不一樣，是什么原因？如何解決？可能會(huì)有以下幾個(gè)原因：1.當(dāng)在培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)時(shí)，培養(yǎng)板最外一圈的孔最容易干燥揮發(fā)， 由于體積不準(zhǔn)確而增加誤差。一般情況下，最外一周的孔只加培養(yǎng)基，不作為測(cè)定孔用。2. 有可能會(huì)因?yàn)镃CK8沾在壁上而產(chǎn)生誤差，建議在加入CCK8后，輕輕敲擊培養(yǎng)板以幫助混勻。 3.每孔的細(xì)胞數(shù)量過(guò)多或過(guò)少。請(qǐng)預(yù)先在1,000100,000個(gè)/孔范圍內(nèi)摸索條件。15 .如何設(shè)定空白對(duì)照？在不含細(xì)胞的培養(yǎng)基中加入CCK

11、8,培養(yǎng)一定的時(shí)間，測(cè)定450 nm的吸光度即為空白對(duì)照。 在做加藥實(shí)臉（細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)）時(shí)，還應(yīng)考慮藥物的吸收，可在不含細(xì)胞，加入藥物的培養(yǎng)基 中加入CCK8,培養(yǎng)一定的時(shí)間，測(cè)定450 nm的吸光度作為空白對(duì)照。16 .哪些物質(zhì)會(huì)影響CCK8的測(cè)定？當(dāng)有還原性物質(zhì)存在時(shí)會(huì)影響CCK8的測(cè)定，例如含有維生素C的Glucose等（一般培養(yǎng)基 中的量不多，酚紅或血清不影響測(cè)定）。在有酚紅存在的情況下，會(huì)增加空白吸收，但不影 響測(cè)定，扣除空白吸收即可。17 .在實(shí)臉中吸光度值太高，如果不能減少細(xì)胞數(shù)量，如何解決？可以縮短加入CCK8后的培養(yǎng)時(shí)間。例如：可以把加入CCK8試劑后的培養(yǎng)時(shí)間由2小時(shí)縮短

12、為1小時(shí)。18 .設(shè)定參比波長(zhǎng)的目的是什么？必須設(shè)定嗎？不一定要設(shè)定。CCK-8試劑在參比波長(zhǎng)沒(méi)有吸光度。設(shè)定參比波長(zhǎng)的目的是為了取出由于樣 品混濁所帶來(lái)的吸收°19 .說(shuō)明書(shū)上僅寫(xiě)了 96孔板的測(cè)定方法，如果使用24孔板貨12孔板，應(yīng)該加多少量CCK-8 試劑？一般情況下建議加入CCK-8試劑的量是培養(yǎng)基體積的1/10。20 .在CCK-8顯色過(guò)程中，如何終止反應(yīng)？有一下幾種方法（96孔板）：1、在顯色反應(yīng)后，將培養(yǎng)板放寬4c冰箱內(nèi), 2、每孔加10 U I 0.1 M HCL溶液。3、每孔加10 u I 1% （w/v）的SDS （十二烷基硫酸鈉）溶液。注意： 反應(yīng)停止后，應(yīng)在2

13、4小時(shí)之內(nèi)測(cè)定。21 ,必須預(yù)培養(yǎng)細(xì)胞嗎？不一定。如果要向保持細(xì)胞的最好狀態(tài)，建議預(yù)培養(yǎng)細(xì)胞。如果不做細(xì)胞預(yù)培養(yǎng)，細(xì)胞內(nèi)的 脫氨酶可能會(huì)不穩(wěn)定。也有人不做細(xì)胞預(yù)培養(yǎng)，但在做標(biāo)準(zhǔn)曲線和檢測(cè)時(shí)需要統(tǒng)一檢測(cè)條件。22 .如果加入的藥物中含有金屬，是否會(huì)有影響？金屬對(duì)CCK-8顯色有影響。當(dāng)終濃度為1 Mm的氯化亞鉛、氯化鐵、硫酸銅會(huì)抑制5$、15*、 90席的顯色反應(yīng)，使靈敏度降級(jí)。如果終濃度是10 Mm的話，將會(huì)100舟抑制。23 . CCK-8試劑的保存條件？在避光條件下CCK-8試劑在4可保存一年。如果需要保存較長(zhǎng)時(shí)間的話，推薦在-20匕下 保存。但是CCK-8若反復(fù)解凍和冰凍將會(huì)增加空白吸收

14、，從而影響檢測(cè)結(jié)果，若經(jīng)常使用可 將試劑存放在4c冰箱內(nèi)保存。24 .預(yù)培養(yǎng)后，更換培養(yǎng)基需要細(xì)胞計(jì)數(shù)嗎？一般情況下用臏蛋白酶處理對(duì)數(shù)增長(zhǎng)期的細(xì)胞，用血球計(jì)數(shù)也計(jì)數(shù)，制備成一定濃度的細(xì)胞 懸液即可。如果想要精密計(jì)數(shù)細(xì)胞的話，可以預(yù)培養(yǎng)后取培養(yǎng)基用血球計(jì)數(shù)盤(pán)進(jìn)行計(jì)數(shù)，25 .CCK-8對(duì)于不同的細(xì)胞，靈敏度是否一樣？不一樣，懸浮細(xì)胞與貼壁細(xì)胞相比較難染色。對(duì)于貼壁細(xì)胞，一般加入CCK-8培養(yǎng)1-4小時(shí) 吸光度已經(jīng)很高，但對(duì)于懸浮細(xì)胞則可能吸光度較低，可以通過(guò)延長(zhǎng)CCK-8的加入時(shí)間或增 加細(xì)胞數(shù)量來(lái)解決。26 .懸浮細(xì)胞和貼壁細(xì)胞在數(shù)量上有何區(qū)別？懸浮細(xì)胞由于染色比較困那，一般需要增加細(xì)胞數(shù)量和延長(zhǎng)培養(yǎng)時(shí)間。貼壁細(xì)胞染色比較容 易，若細(xì)胞數(shù)量過(guò)大，有時(shí)吸光度會(huì)超過(guò)酶標(biāo)儀的讀數(shù)。27 .應(yīng)該每次做標(biāo)準(zhǔn)曲線嗎？建議每次做。雖然細(xì)胞是一樣的，但是細(xì)胞的狀態(tài)不一定一樣，對(duì)于狀態(tài)不一樣的細(xì)胞，建 議每次做標(biāo)準(zhǔn)曲線。如果試劑的批號(hào)不一樣，靈敏度可能會(huì)有輕微的差異，對(duì)于不同的批號(hào) 建議分別做標(biāo)準(zhǔn)曲線,28 .有時(shí)在藥物作用情況下，細(xì)胞已經(jīng)死亡，但是脫