免疫抑制劑姜黃素逆轉(zhuǎn)胰島素抵抗

1、免疫抑制劑姜黃素逆轉(zhuǎn)胰島素抵抗【摘要】 【目的】 為探討姜黃素(curcumin)對胰島素抵抗的治 療作用及其機制?！痉椒ā坷靡葝u素抵抗的小鼠模型，觀察姜黃素對小鼠胰島 素抵抗的水平、轉(zhuǎn)錄因子I-?資B?琢、循環(huán)細胞因子的變化。【結(jié)果】 姜黃素 能抑制TNF?琢刺激Fao細胞NF-?資B激活；姜黃素治療后小鼠的空腹血糖水平 沒有明顯下降，但空腹胰島素的水平下降約30%葡萄糖耐量曲線的水平也明顯 下降；循環(huán)中TNF?琢( ± )pg/mL vs ( ± )pg/mL水平?jīng)]有明顯改變,而IL-1? 茁(± )pg/mL vs ( ± ) pg/mL 和 I

2、L- 6 ( ± )pg/mL vs ( ±) pg/mL水平明顯 被抑制;胰島素刺激的IRS-1酪氨酸的磷酸化水平明顯升高，而胰島素受體的 磷酸化水平?jīng)]有明顯改變。與IRS-1酪氨酸的磷酸化水平平行，P85的磷酸化水 平也明顯升高，AKT的磷酸化的水平也明顯升高。【結(jié)論】姜黃素能提高小鼠胰島素敏感性，有治療改善肥胖誘導的胰島素抵抗的作用。【關鍵詞】 姜黃素；NF-?資B;胰島素；抵抗)Abstract:【Objective 】 To investigate inhibitory effect ofcurcu min and its mecha nism on in sul

3、in resista nee.【Methods Curcu minco-operated high fat diets were tested for the effect of curcu min on obesity in duced in suli n resista nee in rode nt model. Tran scripti on factor I and circulating cytokines were also detected after curcumin treatment.【Results 】(1) Curcumin inhibitedTNF?琢-stimula

4、ted NF-?資 B activationin Fao cells. (2)The fast ing plasma glucose level was not obviously decreased after the treatme nt of curcu min, but the level of fast ing in sulin decreased by about 30%. Furthermore, the level of glucose toleranee curve dropped significantly.(3) The level of TNF?琢( ± )p

5、g/mLvs ( ±) pg/mL in circulation was not obviously changed, but the level of IL-1?茁(±) pg/mL vs ( ±) pg/mL and IL -6 ( ±) pg/mL vs ( ±) pg/mL was suppressed dramatically. (4) IRS-1 tyros ine phosphorylati on levels stimulated by in suli n obviously in creased, but the phosph

6、orylati on level of in suli n receptor did not cha nge. Being parallel with tyros ine phosphorylati on levels of IRS-1, the phosphorylatio n levels of P85 and AKT in creased accordi ngly. Sign ifica ntly improved in suli n sen sitivity was observed in groups with curcumin.【Conclusion 】 Curcumin inhi

7、bitsNF-?資 B dependent inflammatory pathway and reverses obesity-induced in suli n resista nee.Key words:curcu min, NF-? 資 B, i nsuli n, resista nee姜黃(Curcuma longa L.)是常用中藥，臨床上用于活血、行氣、通經(jīng)、 止痛。姜黃素(curcumin)是一種黃色色素，從姜黃中提取得到的主要有效成分。 近年來,大量研究發(fā)現(xiàn)它具有免疫調(diào)節(jié)、抗氧化、抗炎及抗腫瘤、抗動脈粥樣硬 化等生理和藥理作用1-4。在實驗室資料中姜黃素是良好的免疫調(diào)節(jié)劑，并有

8、結(jié) 果提示姜黃素可以抑制宿主抗移植物反應，而且提高受體動物的存活率5,6。在 實驗研究中，炎癥又與胰島素抵抗密切相關7,8。炎癥被證實是代謝綜合征的共 同土壤,聯(lián)想到許多抗炎藥物如阿司匹林可以逆轉(zhuǎn)胰島素抵抗，本文嘗試利用姜黃素治療肥胖合并極度胰島素抵抗的炎癥模型，并對姜黃素逆轉(zhuǎn)胰島素抵抗的機 制作初步探討。1 材料與方法材 料姜黃素購于印度亞洲公司(純度99%)。動物Obob雄性小鼠16只,8周齡、空腹體質(zhì)量(3338 g),購自南京國家模式動物中心，用含脂肪勺標準飼料飼養(yǎng)，實驗前1周紀錄小鼠的 飼料攝取、空腹血糖、空腹胰島素水平及體量等。FAO 細胞 購自 The American Type

9、 CultureCollection(ATCC)。試劑 IR、IRS-1、AKT P85 多克隆抗體由 Steven Shoelson 實驗室(Joslin Diabetes Center, Harvard)提供。FBSTNF琢、胰島素購自 Sigma, St. Louis USA, I-? 資 B?琢 抗體,IKK?酌抗體，購于 Santa Cruz, CA, GST-I-? 資 B(1-54)底物由 Bost on Biologicals, Wellesley, MA 合成。方 法體外細胞實驗FAO細胞使用培養(yǎng)液DMEM購自Gibco公司),細胞置于37 C,5%CO2勺培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。在1

10、0 cm培養(yǎng)皿用10 mL DMEM+10%FBS 含有高濃度葡萄糖(25 mmol/L)的培養(yǎng)液中培養(yǎng)至80%重疊率，經(jīng)5 mL %BSA?育 16 h后接受不同濃度(040 umol/L)的姜黃素預處理，然后接受鼠TNF琢10 nmol/L刺激處理，于20 min后用預冷的PBS終止，并收集細胞，用于制作蛋白勻 漿,備用,I-?資B?琢的水平用免疫印跡的灰度表示。NF-?資B的活性用20 min 內(nèi)試驗細胞和對照細胞I-?資B?琢灰度差值表示。動物實驗利用食物參入法制成含2%姜黃素的顆粒飼料(LabDiets, 5008),低溫保存。動物飼養(yǎng)環(huán)境為中央通氣，層流環(huán)境，恒溫(23 C)、恒

11、濕,12 h明暗光照循環(huán),24 h隨意飲食環(huán)境.動物購入后第5天開始接受口服葡 萄糖耐量試驗，并留取空腹血漿作血漿胰島素水平，和其它循環(huán)因子的檢查。在驗 證空腹血糖和胰島素水平后動物被隨機分成兩組 ，并接受姜黃素治療，對照組用 顆粒飼料5008作為對照。每天記錄動物的攝食量，每3周測量空腹血糖并留取空 腹血漿1次，第6周空腹狀態(tài)下進行第2次口服葡萄糖耐量試驗，并留取空腹血 漿。試驗后繼續(xù)接受姜黃素治療,第7周于空腹狀態(tài)下接受5 U/kg胰島素富強注 射,注射后5 min整,用斷頸法迅速處死動物,留取肝臟經(jīng)液氮過渡后在-80 C低 溫冰箱保存，作胰島素信號分析之用。血漿多種循環(huán)炎癥細胞因子的檢查

12、用Li neo Research 的Lumi nex試劑盒并采用Lumi nex 200監(jiān)測結(jié)果。免疫印跡細胞或組織裂解液（30 mmol/L Hepes, 150 mmol/LNaCI, 1% Triton X-100, pH。蛋白酶抑制劑由 1 mmol/L PMSF, 3 ?滋 mol/Laprotinin, 5 ?滋 mol/L pepstatin,10 ?滋 mol/L leupeptin, 25 mmol/LBen zamid in, 2 mmol/L Na-va nadate, 5 mmol/L ?茁-glycerolphosphate, 10mmol/L NaF, 1 mmol

13、/L Ammon ium Molybdate, 30 mmol/L tetrasodium pyrophosphate, 5 mmol/L EGTA）裂解細胞，SDS-聚丙烯酰胺凝膠（6%）,蛋白加熱 變性后每孔加30 ?滋g,電轉(zhuǎn)移儀將蛋白轉(zhuǎn)到PVDF!。5%兌脂奶粉TBS-T緩沖 液洗膜，加一抗，4 C孵育過夜,TBS-T緩沖液洗膜，加過氧化物酶標記的IgG抗 體（購自AmershamUSA）,室溫1 h,TBS-T緩沖液洗膜，加ECL1 min,暗室顯影23 min后沖洗膠片。凝膠成像分析系統(tǒng)攝像。統(tǒng)計學分析 采用t檢驗。2 結(jié) 果2. 1姜黃素抑制NF-?資B的量效和時效關系Fao細胞

14、在10 cm2培養(yǎng)皿用10 mL在10%FBS+DMElM有高濃度葡萄糖 的培養(yǎng)液中培養(yǎng)至80%重疊，經(jīng)5 mL % BSA孵育16 h后接受姜黃素預處理：劑量 關系用梯度濃度如圖1所示，時效曲線用30卩mol/L。預處理后接受鼠TNF 10 nmol/L刺激處理，于20 min后用預冷的FBS終止，并收集細胞，用于制作蛋白勻 漿。用免疫印跡檢測勻漿內(nèi)I-?資?注?琢的水平。如圖1A所示:20卩mol/L姜黃 素20 min預處理能夠抑制TNF刺激的I?資?注?琢的降解。從姜黃素的時效關系 圖1B可見，姜黃素有效劑量30卩mol/L對NF- k B的抑制作用在3060 min時最 強。2. 2

15、姜黃素以逆轉(zhuǎn)肥胖小鼠的胰島素抵抗經(jīng)過6周姜黃素的治療，小鼠的空腹血糖水平?jīng)]有明顯下降，但空腹胰 島素的水平下降約30%（圖2）, 口服葡萄糖耐量曲線的水平也明顯下降（圖2A）,曲 線下面積的比較有明顯差異（P< ）。由空腹血糖和胰島素水平計算的 HOM指數(shù)用FBS(mmol/L) x胰島素(mmol/L)/計算也呈明顯降低(P< ,圖2C),提示小鼠對胰島素抵抗的水平得到明顯改善。2. 3姜黃素對循環(huán)細胞因子的影響Obob小鼠治療6周后的空腹血漿用Li neo Research Lumi nex 試劑盒 同時檢測細胞因子IL-1?茁,IL-6 和TNF?琢的水平。如圖3所示：盡管循

16、環(huán)胰島 素的水平明顯下降，但TNF?琢 ( ± )pg/mL vs ( ±) pg/mL水平?jīng)]有明顯改變， 與之對應，循環(huán)中 IL-1?茁(± )pg/mL vs ( ±) pg/mL 和 IL-6 ( ± )pg/mL vs (±) pg/mL水平明顯被抑制(P< ) o2. 4姜黃素為胰島素信號的增效劑經(jīng)胰島素刺激的肝臟組織在液氮下作粉碎并以1%Trit on X100 RAPA含有全部蛋白酶抑制劑，和蛋白磷酸酶抑制劑)緩沖液在冰點勻漿。經(jīng)全速4 °C離 心30 min取上清液(1 mg蛋白質(zhì))作IRS-1和IR聯(lián)

17、合免疫沉淀。經(jīng)上樣緩沖液 釋放的沉淀目標蛋白質(zhì)經(jīng) 6%勺SDS-PAGE分離,轉(zhuǎn)移到PVDF1上。用4G10P85 AKT抗體作免疫印跡。如圖4所示：胰島素刺激的IRS-1酪氨酸的磷酸化水平明 顯升高，而胰島素受體的磷酸化水平?jīng)]有明顯改變。 與IRS-1酪氨酸的磷酸化水 平平行,P85的磷酸化水平也明顯升高,AKT的磷酸化的水平也明顯升高。3 討 論胰島素抵抗(IR)及胰島？茁細胞功能減退是2型糖尿病發(fā)病機理的重要 環(huán)節(jié)，目前被認為是一個慢性非特異性炎癥過程，胰島素對胰島素敏感組織作用 的缺陷(肝臟、脂肪組織、骨骼肌)會導致慢性、低水平炎癥狀態(tài)的惡化，任何與 慢性炎癥有關的過程都會削弱胰島素的

18、作用，作為惡性循環(huán)，胰島素抵抗又會使 炎癥惡化。在抗炎藥物對胰島素抵抗有逆轉(zhuǎn)作用的報道之后，我們探索新的抗炎 藥物對胰島素抵抗的治療作用，姜黃素是繼阿司匹林后又一個具有類似協(xié)同作 用的活性成分11 o在姜黃素治療6周后,盡管治療組和對照組的體重沒有明顯 改善，但小鼠空腹血糖的水平明顯下降，而且胰島素的水平也明顯降低，提示胰島 素的敏感性明顯升高，葡萄糖耐量曲線在治療后也明顯改善，說明小鼠整體對葡 萄糖的處理能力明顯升高，即obob小鼠的胰島素抵抗的水平得到明顯改善。這 些都進一步說明姜黃素治療改善肥胖誘導的胰島素抵抗。研究證實NF-?資B是啟動和控制炎癥的主要核轉(zhuǎn)錄因子,在非激活條件 下,NF

19、-?資B和胞漿內(nèi)一種被稱為NF-?資B的抑制物(I-?資B)的蛋白質(zhì)結(jié)合處于 無功能狀態(tài)。我們利用胰島素敏感組織來源的細胞系FAO驗證了姜黃素能夠抑制TNF?琢刺激的I?資B?琢的降解,繼而抑制NF-?資B的活性，我們推測在高度 肥胖NF-?資B高度激活的肥胖小鼠obob體內(nèi),姜黃素可能具有更加明顯的改善 代謝的作用。在NF-?資B激活的模型上我們證實炎癥激發(fā)的高水平循環(huán)細胞因子是 系統(tǒng)性胰島素抵抗的原因。采用細胞因子的中和抗體可以逆轉(zhuǎn)胰島素抵抗，在NF-?資B抑制型模型,胰島素敏感性升高,而且循環(huán)中細胞因子的水平較低。在肥 胖發(fā)生過程中,NF-?資B活性與動物的體重呈正相關。Obob小鼠的肝

20、臟，脂肪以 及淋巴組織中NF-?資B的活性水平升高，循環(huán)細胞因子的水平增高，這些都說明 炎癥介質(zhì)與胰島素抵抗的關系。經(jīng)姜黃素治療的肥胖動物循環(huán)中細胞因子IL-1,IL-6水平均明顯下降,由于IL-1和IL-6是NF-?資B活性調(diào)控的重要因子,因此， 我們認為姜黃素在胞漿內(nèi)有多個作用靶點，通過對上述細胞因子的抑制作用，影 響NF-?資B的活性,繼而達到逆轉(zhuǎn)胰島素抵抗和改善胰島素敏感性的作用。在肝臟組織的胰島素信號檢測中，胰島素刺激的IRS-1酪氨酸磷酸化的水平明顯升 高,AKT的活性也明顯增強。這些結(jié)果都進一步說明肥胖小鼠胰島素的敏感性在 治療后得到了改善，姜黃素能提高obob小鼠胰島素的敏感性

21、，姜黃素作為一個免 疫調(diào)節(jié)劑用于抑制免疫排斥的同時，對系統(tǒng)性炎癥也有抑制作用，可能是通過抑 制NF-?資B來改善胰島素敏感性的?！緟⒖嘉墨I】HUANG H C, JAN T R, YEH S F. I nhibitory effect of curcumi n, anan ti-i nflammatoryage nt, on vascular smooth muscle cell proliferati on J.Eur J Pharmacol, 1992, 221(3):381-384.CHENH W, HUANG! C. Effect of curcumin on cell cycle p

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