穩(wěn)定表達PTENEGFREGFRvⅢ人惡性膠質瘤細胞系的建立及其分析鑒定

1、穩(wěn)定表達PTEN EGFR EGFRffl人惡性膠質瘤細胞系的建立及其分析鑒定穩(wěn)定表達PTEN EGFR EGFR人惡性膠質瘤細胞系的建立及其分析鑒定#董裕翠，任歡 *51015（哈爾濱醫(yī)科大學免疫教研室，哈爾濱 150081 ）摘要：目的：分別建立穩(wěn)定表達抑癌基因 PTEN表皮生長因子受體（EGFR 及突變型 EGFRv的惡性膠質瘤細胞系，從基因、蛋白及細胞水平驗證外源性PTEN EGFR和EGFR基因對U87MG細胞的影響。方法：采用PCR方法擴增PTEN基因編碼區(qū)序列， 構建重組表達載體 pcDNA3.1 - /PTEN。分別將 pcDNA3.1 -/PTEN 和 pLWERNL轉染 U

2、87MG細胞，篩選后建立穩(wěn)定細胞系。應用 RT-PCR 和 Western blotting法檢測 PTEN、EGFR在不同抗性細胞克隆的表達。MTT法檢測外源性 PTEN EGFR和 EGFRv基因對細胞增殖 的影響。結果： 構建 真核表 達 載 體 pcDNA3.1 - /PTEN 及 穩(wěn) 定表 達細 胞系 U87MG-PTEN和U87MG-EGFR并經 RT-PCR 及 western blotting驗證。轉染外源性 PTEN抑制細胞增殖（P 0.05），轉染EGFRv促進細胞增殖（P 0.05），轉染EGFR對細胞增殖 無顯著影響（P 0.05 ）。結論：成功建立穩(wěn)定表達抑癌基因 P

3、TEN原癌基因EGFR及其突變體 EGFRv的人惡性膠質瘤細胞系。 為進一步研究所轉染基因對相關下游細胞信號轉導 通路的影響及對惡性膠質瘤發(fā)生發(fā)展的作用打下良好基礎。關鍵詞：惡性膠質瘤；PTEN基因；EGFR基因；EGFR基因；穩(wěn)定轉染中圖分類號： R20Establishment and Identification of Human GlioblastomaCell Line Stably expressing PTEN/EGFR /EGFRvDong Yucui, Ren HuanDepartment of Immunology, Harbin Medical University, H

4、arbin 15008125303540Abstract: Objective ： To establish human glioblastoma cell line U87MG-PTEN, U87MG-EGFRand U87MG-EGFRstably expressing PTEN, epidermal growth factor receptor EGFR andEGFRffl respectively. On gene expressi on, protein expressi on andcell proliferation levels toverify the effect of

5、exoge nous PTEN, EGFR and EGFRv 川 gene on the U87MG cells. Methods ：The PTENgene CDSwas amplified by PCR, then inserted into eukaryotic expression vectorpcDNA3.1 - to constructrecombinant vector pcDNA3.1 - /PTEN.pcDNA3.1 - /PTEN andpLWERNLwere transfectedinto U87MG cellsrespectively. Theexpression o

6、f PTEN and EGFRin different G418 resistant cell clones was detected by RT-PCR andWestern blotting. The effectof exoge nous PTEN, EGFR and EGFRvn gene on the cell proliferati on was tested by MTTassay. Results ：The eukaryotic expression vector pcDNA3.1- /PTENwas constructed. The stablecell lines U87M

7、G-PTEN and U87MG-EGFR were established and verified by RT-PCR andWestern blotting. Stable expression of exogenous PTEN can suppress the growth of humanglioblastoma cell line U87MG P0.05 , stable expression of exogenousEGFR 昭 can in creasethe growth of U87MG P 0.05 , whereas stable expression of EGFR

8、 has much less effect on theU87MG cells growth P 0.05 . Conclusion： We have successfullyestablished humanglioblastoma cell line U87MG-PTENU,87MG-EGFaRnd U87MG-EGFR stably expressingPTEN,EGFRand EGFRffl , respectively. This will lay down a good basis to further study theeffect of transfected gene on

9、the related downstream signaling pathways in glioblastoma and thedevelopment of GBM.Keywords: Glioblastoma; PTEN gene; EGFR gene; EGFRv 川 gene; stable transfect基金項目：本課題受高等學校博士學科點專項科研基金資助（項目編號 20092307110006）作者簡介：董裕翠， 1982- ，女，講師，主要研究惡性腦膠質瘤信號轉導 模式及靶向治療。通信聯(lián)系人：任歡， 1967- ，女，教授，主要研究惡性腫瘤的靶向治療及免疫逃逸機制。 E-ma

10、il:huanren2009126-1-4550556065707580在惡性膠質瘤中，表皮生長因子受體（ epidermal growth factor receptor ，EGFR的過表達及突變占45%1。EGFR基因擴增常伴隨結構的變異，其中第三類突變體 （EGFR）v 是惡性膠質瘤中最常見的基因組突變體，該受體缺失 2-7 外顯子。抑癌基因 PTEN（humanphosphatase and tensin homolog deleted on chromosome ten）在正常情況下通過調控原癌基因磷脂酰肌醇（PI） -3-激酶（PI3K）來抑制該信號通路的活化從而發(fā)揮調節(jié) 功能。惡

11、性膠質瘤中36%的PTEN基因發(fā)生了缺失或突變1。研究證實，EGFR PTEN等 基因的異常表達正是促進與之相關信號轉導通路網(wǎng)絡異常活躍的重要因素。因此，EGFR下游區(qū)域密切相關的細胞信號轉導網(wǎng)絡可能是在維持惡性膠質瘤細胞基因表型及功能狀態(tài) 中起關鍵作用的主效通路。人惡性膠質瘤細胞U87MGS達低水平EGFR基因，不表達EGFRS因，PTEN 基因發(fā)生剪接位點突變， 第 3外顯子缺失， 因而不能發(fā)揮其功能。 本實驗將建立分 別表達PTEN和EGFR勺兩種人惡性膠質瘤細胞系，研究外源性 PTEN EGFR和EGFR基因的表達及對U87MG田胞增殖的影響。1 材料與方法1.1 主要材料人惡性膠質瘤

12、細胞U87MG LN229和U87MG-EGFRV為本教研室保存，質粒 載體pcDNA3.1 - 由本校遺傳學教研室饋贈，含 EGFR 基因的表達載體 pLWERNL 由 Dr. FrankFurnari Ludwig Institute, San Diego, CA 惠贈， LipofectamineTM2000 購自 Invitrogen 公司，DNAmarker、限制性內切酶（EcoR Kpn Sal和Neo）購自TaKaRa公司， T4 DNA連接酶購自NEB公司，G418為EMDBiosciences 公司產品，EGFR兔單克 隆抗體、 PTEN兔單克隆抗體、HRP標記抗兔抗體購自C

13、ell Signaling 公司，B -actin 抗購自武漢博士德公司，四甲基偶氮唑藍 MTT 為 Sigma 公司產品。1.2 重組質粒 pcDNA3.1 - /PTEN 的構建0>. 引物設計根據(jù) GeneBank 中 PTEN 的 cDNA 序列，分別在引物 5' 端加上 EcoR 和Kpn 酶切位點，設計引物 P1 （上游引物：CCG GAA TTC GGC TCC CAG ACA TGA,CAG游引物: CGGGGT ACC AAG TTT ATT TTC ATG GTG ）T用于擴增 PTEN 基因編碼區(qū)。根 據(jù)包含PTEN基因第三外顯子的原則設計引物 P2 （上游

14、引物：CATGACAGCCATCAT CAA AG，下游引物：GTC AAG ATC TTC ACA AAA）G創(chuàng)于檢測突變型和野生型 PTEN 的表達。根據(jù)GeneBank中EGFRcDNA序列，設計引物 P3 （上游引物：CTTCGGGGA GCA GCG ATGCGA C 下游弓I物：ACC AAT ACC TAT TCC GTT ACA）C 檢測 EGFR 基因的 表達。根據(jù)GeneBank中B -actin cDNA序列，設計參照引物P4（上游引物：ATTGGC AAT GAG CGGTTC CGC下游引物：CTC CTG CTT GCT GAT CCA CATC引物由上海英俊 生物

15、技術公司合成。.人PTEN cDNA的擴增按 Trizol 試劑說明書提取 LN229 細胞（ LN229 中含完整的 PTEN 基因， 能表達內源性的 PTEN 蛋白2,35min 。以 LN229 cDNA 為模板， P1 為引物，擴增 PTEN 編碼區(qū)序列。反應 條件: 98 變-2-性10s , 65退火10s , 72延伸70s （30個循環(huán)）。PCR產物通過1.5%瓊脂 糖凝膠電泳鑒85人 PTEN 真核表達載體的構建將回收純化的PCR產物及質粒pcDNA3. 1 -分別用EcoR和Kpn雙酶切，低熔點瓊脂糖電泳分離、膠回收純化后，經T4 DNA連接酶連接，轉化大腸桿菌TOP10感

16、受態(tài)細胞，重組質粒分別經 Sal 和 Nco 酶切及基因測序鑒定。G418對U87MG細胞的毒性試驗9095U87MG在5% CO237條件下培養(yǎng)于 DMEM培養(yǎng)基（含10%胎牛血清、100U/ml霉素和100卩g/ml鏈霉素）。取生長狀態(tài)良好的細胞制成單細胞懸液，接種于 6 孔板中，待細胞貼壁后， 更換含有 G418 的濃度分別為 100、 200、 300、 400、 500、 600、 700、 800、 900和1000卩g/ml DMEM培養(yǎng)基，每種濃度設2個平行孔，每隔3天換藥1 次，以 10-14 天細胞全部死亡的最低 G418 濃度為最佳篩選濃度。1.3 穩(wěn)定轉染細胞系的建立按

17、照 LipofectamineTM2000 操作說明書，用表達載體 pcDNA3.1 - /PTEN 和 pLWERNL分別轉染U87MG細胞。轉染約48小時后，在含G418的選擇性培養(yǎng)基中 篩選細胞 2-3 周，獲得抗性細胞克隆，擴增培養(yǎng)、鑒定后，建立穩(wěn)定細胞系。1.4 穩(wěn)定細胞系的鑒定100RT-PCR 法分別收集 pcDNA3.1 - /PTEN 和 pLWERNL 轉染后挑取的細胞克隆，按Trizol 試劑說明書提取細胞總RNA取1卩g進行反轉錄。以P2為引物的PCR反應條件：94 預變性 3min ，94變性30s , 58退火30s , 72延伸45s （30個循環(huán)），72延伸10

18、min。以P3 為引物的PCR反應條件：94預變性2min，94變性30s，58退火30s，72延伸60s（ 30 個循105110115環(huán)），72延伸 10min 。以 P4 為引物的 PCR 反應條件： 98變性 10s ，54退 火 15s ， 72延伸 30s （ 28 個循環(huán)）。取 PCR 產物進行瓊脂糖凝膠電泳分析。. Western Blotting 法分別收集pcDNA3.1 -/PTEN 和pLWERNL轉染后挑取的細胞克隆，經裂解 液裂解細胞，Bradford 法測蛋白濃度。樣品于 100 水浴 5 min , 取等量蛋白上樣進行SDAS - PAGE 電泳,電泳后將蛋白轉

19、移至硝酸纖維膜上 ,5 %脫脂奶粉封閉 ,隨后與特異性一抗孵 育 4 過夜，次日與辣根過氧化物酶 HRP 標記的二抗室溫孵育 1 小時后，暗室中用 ECL 化 學發(fā)光試劑作用雜交膜顯影成像于 X 膠片上。1.5 細胞增殖實驗分別取對數(shù)生長期 U87MG U87MG-PTENJ87MG-EGF和 U87MG-EGFR細胞，胰酶消化后制成單細胞懸液，按每孔4 X 103個細胞接種于96孔板中，每 孔體積100卩L。用含10%胎牛血清的培養(yǎng)液培養(yǎng)24小時后，更換無血清培養(yǎng)液。以U87MG為 對照組，U87MG-PTEN U87MG-EGFR和U87MG-EGFR為試驗組，每組細胞設4個復 孔， 6

20、個時間檢測點，分別于第 1 、2、3、4、5、6 天檢測。在指定時間點每孔加入MTT 5mg/ml 20 卩 l ,37孵育 4h后吸棄孔內培養(yǎng)基，每孔加入 DMSOWOy l，室溫振蕩10min ,在酶聯(lián)免疫檢測-3-120125130儀 490nm 波長下測定其吸光度值，以細胞增殖百分率為縱坐標、時間為橫 坐標繪制細胞生長曲線圖。1.6 統(tǒng)計學方法本實驗數(shù)據(jù)以均數(shù)土標準差（X ± S）表示，采用SPSS軟件包進行統(tǒng)計學 處理，組間樣本均數(shù)比較采用方差分析，以 P 0.05 作為有無顯著性差異的判斷標準。2 結果2.1 重組質粒的鑒定重組質粒 pcDNA3.1 - /PTEN ，經

21、 Sal 酶切可得到長度 4480bp 和 2185bp 兩條片段，經Nco 酶切可得到長度 3342bp 、 2588bp 和 735bp 三條片段，與預期片段一 致（圖 1 ）。經基因測序、BLAST比對，重組質粒的插入片段序列與 GenBank數(shù)據(jù)庫中PTEN 編碼區(qū)序列相符。圖 1 pcDNA3.1 - /PTEN 酶切鑒定結果Fig.1 Restrictive endonuclease digestion of pcDNA3.1 - /PTEN1352.2M:DNA marker 1: Sal 酶切質粒 2: Nco 酶切質粒G418 最佳篩選濃度的確定800、900、1000 卩

22、g/ml 組于第 2 天，500、600、700 卩 g/ml 組于第 3 天， 300、400 卩 g/ml組于第5天開始出現(xiàn)抑制細胞生長現(xiàn)象，第10天，除200、300卩g/ml組 有細胞存活外，其余各組細胞全部死亡。 因此，可以認為在本實驗條件下 G418 最佳篩選濃度 為 400 卩 g/ml。1402.3 穩(wěn)定細胞系的鑒定RT-PCR水平. ( 1)：用引物 P2 進行 PCR 擴增，在轉染 pcDNA3.1 - /PTEN 的三株細胞 克隆中可擴增出兩條條帶，即突變型 PTEN( 283bp)和野生型PTEN (328bp),而在U87MG細胞只能檢測到突變型PTEN (283bp

23、)的表達(圖2 )。下圖為相對應細胞內 參照基因 B -actin145(336bp )的表達。-4-圖2 RT-PCR檢測PTEN mRN的穩(wěn)定表達Fig.2 RT-PCR analysis of PTEN mRNA stable expressionM: DNA marker1: U87MG 細胞2：轉染 pcDNA3.1 - /PTEN 的 9 號克隆1503: 轉染 pcDNA3.1 - /PTEN 的 10 號克隆4: 轉染 pcDNA3.1 - /PTEN 的 14 號克隆.(2):以P3為弓I物，進行PCR擴增，在U87MG和pLWERNL轉染的U87MG細胞9號克隆中可擴增出E

24、GFR的條帶(1044bp),且轉染pLWERNL的細 胞中 EGFR 基因表達更強(圖3 )。下圖為相對應細胞中內參照基因B -actin (336bp)的表達。155圖3 RT-PCR檢測EGFR mRN的穩(wěn)定表達Fig.3 RT-PCR analysis of EGFR mRNA stable expressionM:代表 DNA marker1: U87MG細胞2:轉染pLWERN的U87MG田胞9號克隆160165. Western Blotting 水平檢測. 1 圖 4 結果顯示，轉染 pcDNA3.1 - /PTEN 的三株細胞克?。?9 號， 10 號和 14 號）表達PTE

25、N蛋白（54kDa,這表明PTEN在此三株細胞克隆中得到了穩(wěn)定表 達，且 14 號的蛋白表達最強，故將其建立穩(wěn)定細胞系，即為U87MG-PTEN圖4 Western Blotting檢測PTEN蛋白的穩(wěn)定表達Fig.4 Western Blotting analysis of PTEN protein stable expression1:U87MG細胞2：轉染 pcDNA3.1 - /PTEN 的 9 號克隆3: 轉染 pcDNA3.1 - /PTEN 的 10 號克隆 4: 轉染 pcDNA3.1 - /PTEN 的 14 號克隆-5-.2 圖5 結果表明，轉染 pLWERNL的U87MG

26、細胞9 號克隆表達 EGFR蛋白170175180185（170kDa）,而在U87MG細胞和其余轉染pLWERNL后所挑取的細胞克隆中 均沒有檢測到 EGFR 蛋白的表達,這表明 EGFR 蛋白在 9 號克隆中得到了穩(wěn)定表達, 故將其建立穩(wěn)定細胞系，即為U87MG-EGFR圖5 Western Blotting 檢測EGFR蛋白的穩(wěn)定表達Fig.5 Western Blotting analysis of EGFR protein stable expression1: U87MG細胞2:轉染pLWERN的 U87MG田胞9號克隆2.4 細胞增殖實驗 各組細胞生長曲線見圖 6 。統(tǒng)計學分析表

27、明， 在無血清狀態(tài)下培養(yǎng) 6 天后， 試驗組細胞U87MG-PTENU87MG-EGFR與對照組細胞U87MG相比，吸光度值都有顯著 性差異（P 0.05）；而試驗組細胞U87MG-EGFRT對照組細胞U87MG相比，吸光度 值無顯著性差異（P 0.05 ）。這表明在無血清狀態(tài)下，外源性PTEN的表達能抑制U87MG 細胞的增殖，EGFR能促進U87MG細胞的增殖，而野生型EGFR對U87MG細胞增殖影響 不顯著。Fig.6圖6 各組細胞生長曲線圖cell proliferation under serumfree conditions3 討論抑癌基因 PTEN 和原癌基因 EGFR 功能狀態(tài)

28、及其基因變異方式與惡性膠質瘤的發(fā)生發(fā)展190195等生物學行為有密切關系，并且影響膠質瘤的臨床治療效果和預后判定PTEN基因編碼的蛋白質具有雙特異性蛋白 / 脂質磷酸酶活性 4 ，在誘導細胞周期阻滯和凋亡 以及細胞的粘附、遷移、分化等多方面均起到了至關重要的作用 5-7 。研究表明，外源性 PTEN 在 PTEN 突變的惡性膠質瘤細胞中的表達，可誘導 G1 期阻滯，有效抑制腫瘤細胞生長。 在惡性膠質瘤發(fā)生和發(fā)展過程中 , EGFR 常常出現(xiàn)基因擴增和重排，導致基 因突變使腫瘤細胞表面的抗原表型發(fā)生變化，其中最常見的突變類型為EGFRv其激活 表現(xiàn)為配體非依賴性酪氨酸激酶組成性激活8。到目前為止

29、，EGFRv在將近61 %惡性 膠質瘤被檢測至嘰而在多種正常組織中未檢測到。許多研究表明，EGFRV能促進細胞增殖， 抑制細胞凋-6-亡，提高腫瘤細胞致瘤性 9 ，EGFRvIII 還能提高細胞活力， 促進腫瘤細胞 的遷移和侵襲 10 。因其只在腫瘤細胞中表達 , 而在正常細胞中不表達 , 具有腫瘤特異性 , 而成為 腫瘤靶向治療的235200205210215220225230熱點。在本研究中，將重組真核表達載體 pcDNA3.1 -/PTEN和pLWERNL分別轉 染人惡性膠質瘤細胞U87MG從基因和蛋白兩個水平驗證了轉染基因的穩(wěn)定表達，分別 建立了穩(wěn)定表達外源性PTEN EGFR基因的細

30、胞系U87MG-PTEN和U87MG-EGF，并就外 源性 PTEN、EGFR和EGFRv基因對細胞增殖的影響進行了研究。MTT實驗表明，PTEN 能抑制U87MG細胞的增殖，EGFRvIII能促進U87MG細胞的增殖，而 EGFR對 U87MG細胞增殖影響不顯著。穩(wěn)定細胞系U87MG-PTEN U87MG-EGF和 U87MG-EGFR啲成功構建為進一步研究所轉染基因PTEN EGFR和 EGFRv對相關下游細胞信號轉導通路的影響 及對惡性膠質瘤發(fā)生發(fā)展的作用打下良好的基礎， 從而明確膠質瘤中不同分子亞型的細胞 下游相關信號轉導通路的差別，有助于正確區(qū)分不同分子亞型不同作用靶點，提出有效的、

31、 有針對性的治療靶點，為臨床應用提供理論依據(jù)。4 結論本研究成功建立穩(wěn)定表達抑癌基因PTEN、原癌基因EGFR及其突變體EGFRV 勺人惡性膠質瘤細胞系。這為進一步研究所轉染基因對相關下游細胞信號轉導通 路勺影響及對惡性膠質瘤發(fā)生發(fā)展勺作用提供了良好勺體外實驗模型。 參考文獻 References1 The Cancer Genome Atlas Research Network. Comprehensive genomic characterization defines humanglioblastoma genes and core pathways J.nature, 2008,455

32、 7216 :1061-1068.2 Li J, Yen C, Liaw D, et al. PTEN, a putative protein tyrosinephosphatase gene mutated in human brain, breast,and prostate cancerJ. Science, 1997, 275 5308 :1943-1947.3 Furnari FB, Lin H, Huang HS, et al. Growth suppression of glioma cells by PTEN requires a functionalphosphatase catalytic domainJ. Proc Natl Acad Sci U S A, 1997, 9423 :12479-12484.4 Myers MP, Stolarov JP, Eng C, et al. P-TEN, the tumor suppressor from human chromosome 10q23, is adual-specificity phosphataseJ. Proc Natl Acad Sci U S A, 1997, 9417 : 9052-9057.5 Li DM, Sun H. PTEN/MMAC1/TEP1 sup