第六章_植物轉(zhuǎn)化載體的構(gòu)建

1、植物轉(zhuǎn)化載體的構(gòu)建植物轉(zhuǎn)化載體的構(gòu)建植物遺傳轉(zhuǎn)化常用的方法 載體法轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌介導(dǎo)法（Ti質(zhì)粒） 非載體介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化 （1）超聲波法 （2）基因槍法 （3）脂質(zhì)體法 人們很早就發(fā)現(xiàn)雙子葉植物常發(fā)生一種冠癭瘤病，該病在法國(guó)、東歐和意大利的葡萄和果樹(shù)上曾大面積發(fā)生。 1907年首先發(fā)現(xiàn)這種冠癭瘤病是由根癌農(nóng)桿菌引發(fā)的。農(nóng)桿菌的農(nóng)桿菌的TiTi質(zhì)粒質(zhì)粒電鏡下的根癌農(nóng)桿菌冠癭瘤1974年Zaenen等在根癌農(nóng)桿菌內(nèi)發(fā)現(xiàn)并分離了一種與腫瘤誘導(dǎo)有關(guān)的大型質(zhì)粒（大于200kb），稱為Ti質(zhì)粒。The The Agrobacterium Agrobacterium tumefacienstumefaciens

2、 microbe microbe adhering to adhering to plant cells.plant cells. 作為植物基因轉(zhuǎn)化的載體，必須具有兩種功能：1.它能作為媒介將外源基因?qū)胫参锛?xì)胞中去，并且整合到宿主細(xì)胞的基因組DNA上；2.它能提供被寄主細(xì)胞的復(fù)制和轉(zhuǎn)錄系統(tǒng)所識(shí)別的DNA序列。1977年Chilton等在研究農(nóng)桿菌侵染后形成的植物腫瘤細(xì)胞時(shí)，用分子雜交發(fā)現(xiàn)在腫瘤細(xì)胞中存在著農(nóng)桿菌Ti質(zhì)粒的一個(gè)片段，稱為T-DNA（Transfer-DNA）。實(shí)驗(yàn)表明，T-DNA轉(zhuǎn)移到植物細(xì)胞后整合進(jìn)植物基因組中并得以表達(dá)，從而導(dǎo)致了冠癭瘤的發(fā)生。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，整合到植物基因

3、組中的T-DNA可以通過(guò)減數(shù)分裂穩(wěn)定地傳給植物的后代，Ti質(zhì)粒的上述特性成為農(nóng)桿菌介導(dǎo)法植物遺傳轉(zhuǎn)化的重要基礎(chǔ)。TiTi質(zhì)粒是根癌農(nóng)桿菌染色體外的遺傳物質(zhì)；質(zhì)粒是根癌農(nóng)桿菌染色體外的遺傳物質(zhì)；雙股共價(jià)閉合的環(huán)狀雙股共價(jià)閉合的環(huán)狀DNADNA分子；分子；T-DNAT-DNA能夠插入到植物基因組中并能穩(wěn)定表能夠插入到植物基因組中并能穩(wěn)定表達(dá)；達(dá)；長(zhǎng)度長(zhǎng)度150-200KB150-200KB；植物基因工程常用的載體。植物基因工程常用的載體。TiTi質(zhì)粒的生物學(xué)功能質(zhì)粒的生物學(xué)功能l為農(nóng)桿菌提供附著于植物細(xì)胞壁的能力;l參與寄主細(xì)胞合成植物激素吲哚乙酸（IAA）和細(xì)胞分裂素（cyt）的活動(dòng);l誘發(fā)植物

4、產(chǎn)生瘤并決定所誘導(dǎo)的腫瘤的形態(tài)學(xué)特征和冠癭堿的成分;l賦予寄主菌株具有分解代謝各種冠癭堿化合物能力;l賦予寄主菌株對(duì)土壤桿菌所產(chǎn)生的細(xì)菌素的反應(yīng)性;l決定寄主菌株的植物寄主范圍;l有的Ti質(zhì)粒能夠抑制某些根瘤土壤桿菌噬菌體的生長(zhǎng)發(fā)育，即具有對(duì)噬菌體的排外性。 根據(jù)其誘導(dǎo)的植物冠癭瘤中所合成根據(jù)其誘導(dǎo)的植物冠癭瘤中所合成的冠癭堿種類不同分：的冠癭堿種類不同分： 章魚(yú)堿型（章魚(yú)堿型（octopineoctopine） 胭脂堿型（胭脂堿型（nopalinenopaline） 農(nóng)桿堿型（農(nóng)桿堿型（agropineagropine） 琥珀堿型（琥珀堿型（agrocinoineagrocinoine）Ti

5、質(zhì)粒結(jié)構(gòu)質(zhì)粒結(jié)構(gòu)T-DNA區(qū)、毒性區(qū) ( vir)、質(zhì)粒復(fù)制起點(diǎn) ( ori)、質(zhì)粒結(jié)合轉(zhuǎn)移位點(diǎn) (con)、冠癭堿分解位點(diǎn) (ocs or nos) T-DNA(Transfer DNA) 是農(nóng)桿菌侵入植物細(xì)胞時(shí)從Ti質(zhì)粒上轉(zhuǎn)移到植物細(xì)胞的一段DNA； T-DNA兩端各有一段25bp的同向重復(fù)序列，是T-DNA的邊緣區(qū)（LB和RB）； 在同一條單鏈的LB和RB內(nèi)各形成一個(gè)缺口，單鏈T-DNA進(jìn)入植物細(xì)胞。TiTi質(zhì)粒的基因位點(diǎn)及其功能區(qū)質(zhì)粒的基因位點(diǎn)及其功能區(qū)T-DNA區(qū)（transferred-DNA regions）：T-DNA是農(nóng)桿菌侵染植物細(xì)胞時(shí)，從Ti質(zhì)粒上切割下來(lái)轉(zhuǎn)移到植物細(xì)胞的

6、一段DNA，稱為轉(zhuǎn)移DNA。該片斷上的基因與腫瘤形成有關(guān)（致瘤基因）。章魚(yú)堿的遺傳圖胭脂堿的遺傳圖Vir區(qū)（毒性區(qū)）：與T-DNA區(qū)彼此相鄰，該區(qū)段上的基因與T-DNA從細(xì)菌轉(zhuǎn)移到植物細(xì)胞的遺傳過(guò)程有關(guān)，區(qū)段上的基因能夠使農(nóng)桿菌表現(xiàn)毒性Vir區(qū)段總長(zhǎng)度約35kb，由7個(gè)互補(bǔ)群組成毒性區(qū)中各位點(diǎn)的表達(dá)情況分為兩種：組成性表達(dá)植物誘導(dǎo)性表達(dá)Vir區(qū)(virulence region)：該區(qū)段激活T-DNA的轉(zhuǎn)移，使農(nóng)桿菌表現(xiàn)出毒性，故稱為毒性區(qū)。它與T-DNA區(qū)相鄰，合起來(lái)占質(zhì)粒的1/3。Vir基因的功能：n誘導(dǎo)根癌農(nóng)桿菌附著到植物受傷的部位上- VirA蛋白nVir基因產(chǎn)物加工T-DNA形成單股

7、DNA片段- VirD蛋白nT-DNA被轉(zhuǎn)入植物細(xì)胞，整合到寄主基因組中-VirD、E蛋白nT-DNA基因被表達(dá)，使植物細(xì)胞增殖并產(chǎn)生冠癭堿ConCon區(qū)區(qū)(region encoding conjugation)(region encoding conjugation)：該區(qū)段上存：該區(qū)段上存在著細(xì)菌間結(jié)合轉(zhuǎn)移的有關(guān)基因（在著細(xì)菌間結(jié)合轉(zhuǎn)移的有關(guān)基因（tratra），調(diào)控），調(diào)控TiTi質(zhì)質(zhì)粒在農(nóng)桿菌之間轉(zhuǎn)移，冠癭堿能激活粒在農(nóng)桿菌之間轉(zhuǎn)移，冠癭堿能激活tratra基因，誘導(dǎo)基因，誘導(dǎo)TiTi質(zhì)粒轉(zhuǎn)移，因此稱為質(zhì)粒轉(zhuǎn)移，因此稱為結(jié)合轉(zhuǎn)移編碼區(qū)結(jié)合轉(zhuǎn)移編碼區(qū)。Opine diffuses in

8、to the surrounding cells and serves as a signal molecules for the conjugation of the agrobacteriumOriOri區(qū)區(qū)(origin of (origin of replication)replication)：該區(qū)：該區(qū)段基因調(diào)控段基因調(diào)控TiTi質(zhì)粒的質(zhì)粒的自我復(fù)制，故稱為復(fù)自我復(fù)制，故稱為復(fù)制起始區(qū)。制起始區(qū)。Ti質(zhì)粒是來(lái)自細(xì)菌（原核）系統(tǒng)，為何其基因能在真核生物中表達(dá)？證據(jù)一. T-DNA的基因不含有內(nèi)含子，幾乎每個(gè)基因的翻譯起始位點(diǎn)都是AUG證據(jù)二. 無(wú)論是胭脂堿合成酶基因nos還是章魚(yú)堿合

9、成酶基因ocs的5末端都具有真核特有的TATA-box,CAAT-box證據(jù)三. T-DNA產(chǎn)生的mRNA均是典型的植物mRNA分子植物基因轉(zhuǎn)化載體系統(tǒng)目的基因中間表達(dá)載體改良的Ti質(zhì)粒轉(zhuǎn)化載體系統(tǒng)一元載體系統(tǒng)雙元載體系統(tǒng)Ti質(zhì)粒天然Ti質(zhì)粒存在的缺陷中間表達(dá)載體的特性卸甲載體構(gòu) 建 Ti質(zhì)粒上還存在一些對(duì)于T-DNA轉(zhuǎn)移不起任何作用的基因。 卸甲載體的構(gòu)建onc-卸甲載體onconc- -卸甲載體就是無(wú)毒或缺少核心區(qū)卸甲載體就是無(wú)毒或缺少核心區(qū)(non-(non-oncogeniconcogenic) )的的TiTi質(zhì)粒。質(zhì)粒。缺失的核心區(qū)被大腸桿缺失的核心區(qū)被大腸桿菌質(zhì)粒菌質(zhì)粒pBR322

10、pBR322取代。這樣任何適合于克隆到取代。這樣任何適合于克隆到pBR322pBR322質(zhì)粒中的外源質(zhì)粒中的外源DNADNA片斷，都可以通過(guò)與片斷，都可以通過(guò)與pBR322pBR322質(zhì)粒質(zhì)粒DNADNA的同源重組，而被整合到的同源重組，而被整合到onconc- -卸卸甲載體上。甲載體上。onc+卸甲載體onconc+ +卸甲載體是失去部分核心區(qū)基因的卸甲載體是失去部分核心區(qū)基因的TiTi質(zhì)粒。質(zhì)粒。對(duì)于研究外源基因在轉(zhuǎn)基因植株中對(duì)于研究外源基因在轉(zhuǎn)基因植株中的表達(dá)，以及對(duì)于以改良農(nóng)作物為目的的的表達(dá)，以及對(duì)于以改良農(nóng)作物為目的的植物基因工程來(lái)說(shuō)，使用植物基因工程來(lái)說(shuō)，使用onconc+ +卸

11、甲載體可卸甲載體可以快速地增生冠癭組織，比較快速而容易以快速地增生冠癭組織，比較快速而容易得到轉(zhuǎn)化體。得到轉(zhuǎn)化體。Ti質(zhì)粒的其他部分右邊界（RB）胭脂合成酶基因（Nos)pBR322（含AMPr）左邊界（LB）卸甲載體 中間載體的構(gòu)建 為了解決Ti質(zhì)粒不能直接導(dǎo)入目的基因的困難，構(gòu)建中間載體（intermediate vector）是有效的方法之一。 中間載體是一種在普通大腸桿菌的克隆載體上插入一段合適的DNA片斷而構(gòu)成的小型載體。中間載體可以分為共整合系統(tǒng)中的中間載體和雙元載體系統(tǒng)的中間載體。共整合系統(tǒng)中的中間載體特點(diǎn)l 必須含有與受體Ti質(zhì)粒同源序列，這樣當(dāng)它被引入根癌農(nóng)桿菌后可以高頻地與

12、受體Ti質(zhì)粒的同源重組。LIHK Ka an nr rSpe/Strr LIH OCStmstmr共整合作用共培養(yǎng)Ti 質(zhì)粒pMON載體植物細(xì)胞內(nèi)LIHLIH可以沒(méi)有Ti質(zhì)粒的邊界序列共整合載體系統(tǒng)程序目的基因的基因操作克隆到中間載體農(nóng)桿菌農(nóng)桿菌大腸桿菌中間載體與受體載體中間載體與受體載體(onc(onc- -) )發(fā)生同源重組發(fā)生同源重組中間載體中間載體中間表達(dá)載體-選擇標(biāo)記供植物轉(zhuǎn)化體的選擇標(biāo)記： 新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶基因(npt) 卡那霉素具有抗性(kanr) 潮霉素B磷酸轉(zhuǎn)移酶基因，可抗潮霉素(hygr)供細(xì)菌轉(zhuǎn)化體的選擇標(biāo)記: 氨芐青霉素抗性(Ampr) 四環(huán)素抗性(Tcr ) 慶大霉素

13、抗性(Genr) 中間表達(dá)載體-啟動(dòng)子及調(diào)控序列中間載體導(dǎo)入農(nóng)桿菌結(jié)合轉(zhuǎn)移法(conjugative transfer)傳導(dǎo)（conduction）協(xié)助質(zhì)粒本身從大腸桿菌轉(zhuǎn)移到農(nóng)桿菌，適宜依賴rec介導(dǎo)的重組。含有受體Ti質(zhì)粒的農(nóng)桿菌含有協(xié)助質(zhì)粒的大腸桿菌菌株含有中間質(zhì)粒的大腸桿菌菌株三親雜交法三親雜交法大腸桿菌大腸桿菌大腸桿菌大腸桿菌農(nóng)桿菌農(nóng)桿菌E.coliE.coli GJ23 GJ23菌株含兩個(gè)輔助質(zhì)粒，菌株含兩個(gè)輔助質(zhì)粒，R64dRd11R64dRd11和和pGJ28pGJ28，前者具有自主轉(zhuǎn)，前者具有自主轉(zhuǎn)移的功能，后者含移的功能，后者含mobmob基因?；颉Ｖ虚g載體和受體載體的同

14、源重組同源重組同源重組(Homologous recombination)(Homologous recombination)指指DNADNA同源序列同源序列間的重組，常發(fā)生于兩個(gè)較長(zhǎng)的同源間的重組，常發(fā)生于兩個(gè)較長(zhǎng)的同源DNADNA片段或同源染片段或同源染色體之間。色體之間。The plasmid contains a gene interrupted by a marker gene (XR). Recombination involving two crossovers between the plasmid and wild type chromosomal DNA with the interrupted gene and the selectable marker. 表 23-2 各種重組的類型 類型 事件 同源性 蛋白和酶 特異位點(diǎn) 重組機(jī)制 行為和結(jié)果 復(fù)制 真核 減數(shù)分裂 完全同源 內(nèi)切酶、 外切酶 Holliday 模型和Meselson-Radding 模型 交互交換 修復(fù)性復(fù)制 轉(zhuǎn)化 完全同源 RecA, B, C, D 單向取代 修復(fù)性復(fù)制 接合 完全同源 RuvABC 單向取代 修復(fù)性復(fù)制 同 源重組 原核 廣泛性 轉(zhuǎn)導(dǎo) 完全同源 DNAPo