HE石蠟切片步驟,免疫組化步驟

1、HE染色1. 取材切取的組織塊不宜太大，以利于固定劑穿透，通常以6mm 6mrK 5mm為宜。注意事項(xiàng)：(1取材動(dòng)作要迅速，不宜作太久的拖延以免組織細(xì)胞的成分、結(jié)構(gòu)等發(fā)生變 化。(2切片材料應(yīng)根據(jù)需要觀察的部位進(jìn)行選，盡可能不要損傷所需要的部分。2. 固定將切好的組織用生理鹽水組織洗 3次，立即投入10%中性福爾馬林固定液或4% 多聚甲醛中固定，固定36小時(shí)。注意事項(xiàng)：(1 一般固定液，都以新配為好，配好后應(yīng)貯存在陰涼處，不宜放在日光下，以免引 起化學(xué)變化，失去固定作用。(2有些混合固定液的成份之間會(huì)發(fā)生氧化還原作用，一定要在使用前才混合，如 果混合太早，固定時(shí)就沒(méi)有作用了。(3固定材料時(shí)，固

2、定液必須充足，一般為材料塊的2030倍，有些水分多的材料, 中間應(yīng)更換1-2次新液。(4材料固定完畢后，保存于嚴(yán)密緊塞或加蓋的容器里，同時(shí)在容器外上標(biāo)簽，并隨 同材料在溶液中投入相應(yīng)的標(biāo)簽，以免相互混淆。標(biāo)簽上注明固定液、材料來(lái)源、 日期等。標(biāo)簽上的文字，應(yīng)用黑色鉛筆或繪圖黑墨水書(shū)寫(xiě)。脫鈣72小時(shí)中間不換液是樣本30倍中杉金橋(進(jìn)口脫鈣液鑷子觸質(zhì)粒由硬變韌性為準(zhǔn)。(美:固定3-5天根據(jù)組織大小確定天數(shù)，越大固定時(shí)間越長(zhǎng)。3. 洗滌材料經(jīng)固定后，PBS或雙蒸水沖洗約3小時(shí)。(20,30,30,60(美:流水沖洗約4小時(shí)4. 脫水材料依次經(jīng)80%、90%、100%、100%各級(jí)乙醇溶液脫水，各30

3、min注意事項(xiàng)：(1脫水必須在有蓋的玻璃品中進(jìn)行，防止吸收空氣中的水分。(2在更換高一級(jí)的脫水劑時(shí)，最好不要移動(dòng)材料以免損壞，可用吸管吸出器皿中 的脫水劑，再用吸水吸盡器皿內(nèi)剩余液，然后于皿中加入高一級(jí)脫水劑。(3在低濃度酒精中，每級(jí)停留不宜太長(zhǎng)，否則易使組織變軟，助長(zhǎng)材料的解體。(4在高濃度或純酒精中，每級(jí)停留的時(shí)間也不宜太長(zhǎng)，否則會(huì)使組織變脆，影響切 片。(5如需過(guò)夜，應(yīng)停留在80%酒精中。(6脫水必須徹底，否則不易透明，甚至使透明劑內(nèi)出現(xiàn)白色混濁現(xiàn)象(美 :80%的酒精X2小時(shí)95%的酒精X2小時(shí)100%的酒精2小時(shí)2100%的酒精X1小時(shí)或者更長(zhǎng)時(shí)間5. 透明（環(huán)保透明脫蠟液中杉金橋純

4、酒精、二甲苯等量混合液15min,二甲苯I 60min、U 30min（至透明為止。由于乙醇與石蠟不相溶，而二甲苯既能溶于乙醇又能溶于石蠟，所以脫水后還要 經(jīng)過(guò)二甲苯以過(guò)渡。當(dāng)組織中全部被二甲苯占有時(shí) ，光線可以透過(guò),組織呈現(xiàn)出不同 程度的透明狀態(tài)。透明注意事項(xiàng)（1使用透明劑時(shí)，要隨時(shí)蓋緊蓋子，以免空氣中的水分進(jìn)入。（2更換每級(jí)透明劑,動(dòng)作要迅速，一方面為了不使材料塊干涸，另一方面能避免吸 收濕氣。（3在透明過(guò)程中，如果材料周?chē)霈F(xiàn)白色霧狀，說(shuō)明材料中的水未被脫凈，應(yīng)退回 純酒精中重新脫水，然后再透明。（美:二甲苯2小時(shí)二甲苯2小時(shí)二甲苯2小時(shí)6透蠟放入二甲苯和石蠟各半的混合液 60min,再

5、放入石蠟I 60分鐘、石蠟U透蠟30 分鐘。透蠟的目的是除去組織中的透明劑（如二甲苯等，使石蠟滲透到組織內(nèi)部達(dá)到飽 和程度以便包埋。透蠟時(shí)間根據(jù)組織大小而定。透蠟應(yīng)在恒溫箱內(nèi)進(jìn)行 ，并保持箱 內(nèi)溫度在55-60C左右，注意溫度不要過(guò)高，以免組織發(fā)脆。一般置于恒溫箱 0.5h。透蠟注意事項(xiàng)(1盡量保持在較低溫度中進(jìn)行，以石蠟不凝固為度；(2透蠟溫度要恒定，不可忽高忽低；(3操作要迅速，力求在最短的時(shí)間內(nèi)完成石蠟透入過(guò)程，以免引起組織變硬、變 脆、收縮等。(美:石蠟2小時(shí)石蠟2小時(shí)石蠟2小時(shí)7. 包埋包埋時(shí)，用鑷子夾取石蠟?zāi)Ｗ?金屬質(zhì)地在酒精燈上稍加熱，放在平的桌面上，從 溫箱中取出盛放純石蠟的蠟

6、杯，倒入少許石蠟。再將鑷子稍加熱，夾取材料將切面朝 下放入蠟?zāi)Ｖ?，排列整齊。再放上包埋盒，輕輕倒入熔蠟。8. 切片 將已固定和修好的石蠟塊裝在切片機(jī)的夾物臺(tái)上。 將切片刀固定在刀夾上，刀口向上。 搖動(dòng)推動(dòng)螺旋，使石蠟塊與刀口貼近，但不可超過(guò)刀口。 調(diào)整石蠟塊與刀口之間的角度與位置，刀片與石蠟切片約成15度左右。 調(diào)整厚度調(diào)節(jié)器到所需的切片厚度，一般為4-10微米。 一切調(diào)整好后主可以開(kāi)始切片。此時(shí)右手搖動(dòng)轉(zhuǎn)輪，讓蠟塊切成蠟帶，左手持毛筆將蠟帶提起，搖轉(zhuǎn)速度不可太急，通常以40-50r/min 切成的蠟帶到20-30cm長(zhǎng)時(shí),右手用另一支毛筆輕輕將蠟帶挑起，以免卷曲，并 牽引成帶，平放在蠟帶盒上

7、，靠刀面的一面較光滑，朝下，較皺的一面朝上。 用單面刀片切取蠟片一小段，放在載玻上加水一滴，置于放大鏡或顯微鏡下觀 察切片是否良好。 切片工作結(jié)束后，應(yīng)將切片刀取下用氯仿擦去刀上沾著的石蠟，把切片機(jī)擦拭 干凈妥為保存。9. 展片、貼片打開(kāi)水浴鍋，使水溫維持在40-45C,另準(zhǔn)備30%乙醇溶液。 切片時(shí),將一碗30%乙醇溶液放于切片機(jī)旁的桌面上。 用小鑷子夾取預(yù)先用刀片割開(kāi)的蠟帶，放在乙醇溶液的水面上，使切片展開(kāi)。 （可省 小鑷子輕輕地將連在一起的切片分開(kāi)，用一個(gè)載玻片將切片完整，已展開(kāi)的切 片撈至溫水中，使之充分展開(kāi)。 另取潔凈的載玻片，撈起展開(kāi)的切片,使其位于切片1/3處,另一端（磨邊,粗糙

8、 的一端磨面上標(biāo)記或貼上標(biāo)簽，放于切片架上。10. 脫蠟復(fù)水將溫箱溫度調(diào)至65C,待溫度控制在60C時(shí),將切片連同切片架放入干燥的溫箱 內(nèi)3-5小時(shí)至蠟熔化。之后,石蠟切片經(jīng)脫蠟透明I、U脫蠟各 20mi n,勿動(dòng)（防治組織掉此步為關(guān)鍵步 請(qǐng)輕拿輕放。然后放入100%、95%、90%、80%、70%各級(jí)酒精溶液中各5min,再 放入蒸餾水中3min。11. 染色切片放入蘇木精中染色約10-30mi n。染色時(shí)間應(yīng)根據(jù)染色劑的成熟程度及室溫高低，適當(dāng)縮短或延長(zhǎng)。室溫高時(shí)促 進(jìn)染色，染色時(shí)間可短些，否則可適當(dāng)延長(zhǎng)時(shí)間，冬季室溫低時(shí)可放入恒溫箱中染色。12. 水洗用自來(lái)水流水沖洗約15min。使切片

9、顏色變藍(lán)（或放入堿性水中也可，但要注意 流水不能過(guò)大，以防切片脫落。13. 分化將切片放入1%鹽酸乙醇液中褪色，約2秒至數(shù)十秒鐘。見(jiàn)切片變紅，顏色較淺 即可。14. 漂洗（反藍(lán)切片再放入自來(lái)水流水中使其恢復(fù)藍(lán)色。15. 脫水I切片入50%乙醇70%乙醇80%乙醇中各5min。（沒(méi)放5016. 復(fù)染用0.5%伊紅乙醇液對(duì)比染色1-3min。伊紅主要染細(xì)胞質(zhì)，著色濃淡應(yīng)與蘇木精染細(xì)胞核的濃淡相配合，如果細(xì)胞核染 色較濃，細(xì)胞質(zhì)也應(yīng)濃染，以獲得鮮明的對(duì)比。反之，如果細(xì)胞核染色較淺，細(xì)胞質(zhì)也應(yīng) 淡染?？稍谝良t乙醇液中滴加數(shù)滴冰醋酸助染，促使細(xì)胞質(zhì)容易著色，并且經(jīng)乙醇脫 水時(shí)不易褪色。17脫水U將切片放

10、入95%乙醇中洗去多余的紅色撚后放入無(wú)水乙醇中3-5min。最后用 吸水紙吸干多余的乙醇18透明切片放入二甲苯I、U中各 5min。二甲苯應(yīng)盡量保持無(wú)水，應(yīng)經(jīng)常更換，或用紗布包無(wú)水硫酸銅放入染色缸內(nèi)吸收 水分。切片如在二甲苯中出現(xiàn)白霧現(xiàn)象，說(shuō)明脫水未盡，應(yīng)退回乙醇中重新脫水，否則 切片難以鏡檢。19.封藏:中性樹(shù)膠圭寸存因切片經(jīng)二甲苯透明，使用中性樹(shù)膠作為圭寸藏劑，樹(shù)膠可用二甲苯稀釋至合適的 稠度。封藏的方法：封片前應(yīng)根據(jù)材料的大小，選用不同規(guī)格的蓋玻片。材料透明后，在桌上放一張 潔凈的吸水紙，將含材料的載玻片從二甲苯中取出放在紙上（切片的一面向上，迅速地 在切片的中央滴一滴樹(shù)膠（千萬(wàn)不能待二

11、甲苯干燥后再進(jìn)行，用右手持小鑷子輕輕地 夾住蓋玻片的右側(cè)，稍為傾斜使其左側(cè)與封藏劑接角，然后再緩慢地將蓋玻片放下，這 樣就可以減少或避免產(chǎn)生氣泡。如膠液不足，可以用玻棒再滴一滴樹(shù)膠從蓋玻片邊 緣補(bǔ)足。如膠液過(guò)多，可在干燥以后用刀刮去，并用紗布蘸二甲苯拭去殘留的樹(shù)膠。染色結(jié)果:細(xì)胞核被蘇木素染成藍(lán)色，細(xì)胞質(zhì)被伊紅染色呈粉紅色。免疫組化染色1. 石蠟切片，步驟同前。切片經(jīng)貼片后，60C烤片30min使蠟熔化，經(jīng)二甲苯I、 U各10min,脫蠟。然后，將切片放入100%、95%、90%、80%、70%乙醇中3-5min, 再放入蒸餾水中3min,水化。2. 脫蠟和水化后，用PBS（pH7.4具體看所用抗體及染色試劑說(shuō)明沖洗 3次，每次 3分鐘。洗瓶沖洗。3. 根據(jù)抗體的要求，對(duì)組織抗原進(jìn)行相應(yīng)的修復(fù)?？蛇x步驟，具體見(jiàn)抗體說(shuō)明 書(shū)。4. 每張切片加1滴或50卩l(xiāng) 3%過(guò)氧化氫，室溫下孵育10分鐘，以阻斷內(nèi)源性過(guò)氧 化物酶的活性。PBS沖洗3次，每次3分鐘。此步驟是對(duì)內(nèi)源性過(guò)氧化物酶含量高 的組織而言。4. 除去PBS液，每張切片加1滴或50卩的第一抗體，室溫下孵育60分鐘或4C 過(guò)夜，具體參見(jiàn)每種抗體的說(shuō)明書(shū)。PBS沖洗3次，每次3分鐘。5. 除去PBS液，每張切片加1滴或50卩即用型MaxVisionTM試劑或SP試劑, 室溫下孵育10-15分鐘。PBS沖洗3次，每次