高效微生物絮凝劑產(chǎn)生菌BJ_的篩選鑒定及絮凝特性研究_

1、文章編號(hào):1008-1402(200902-0301-05高效微生物絮凝劑產(chǎn)生菌BJ -的篩選鑒定及絮凝特性研究李博,趙敏,彭元舉(東北林業(yè)大學(xué),黑龍江哈爾濱150040摘要:從活性污泥中篩選出1株高效微生物絮凝劑產(chǎn)生菌B J -,其絮凝率達(dá)87.6%.通過(guò)生理生化分析及16S rDNA 序列鑒定該菌株為短芽孢桿菌(B acillus brevis .該菌產(chǎn)絮凝劑的最適碳源和氮源分別為20g L 的葡萄糖和2.0g L 的蛋白胨;適宜的初始pH 和培養(yǎng)溫度分別為7.0和30;在培養(yǎng)基中添加0.5g L 的Mg 2+有利于菌體生長(zhǎng),但對(duì)絮凝劑合成無(wú)影響.對(duì)該絮凝劑的特性研究結(jié)果表明:菌液投放量3

2、%、pH 值在59、溫度為60條件下絮凝效果最好,加入濃度為8%的Ca 2+可顯著提高其絮凝活性.實(shí)驗(yàn)證明,該菌起絮凝作用的物質(zhì)存在于發(fā)酵液中,主要成分為雜多糖.關(guān)鍵詞:微生物絮凝劑;絮凝率;鑒定;培養(yǎng)基優(yōu)化;絮凝特性中圖分類號(hào):Q935文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼:A 微生物絮凝劑是微生物產(chǎn)生的一種有絮凝活性的代謝產(chǎn)物,是一類重要天然高分子絮凝劑,其分子量一般高于105,包括糖蛋白、多糖、蛋白質(zhì)、纖維素和DNA 等不同物質(zhì),且具有廢水脫色的獨(dú)特效果1-4.微生物絮凝劑不僅具有高效、無(wú)毒、無(wú)二次污染、使用條件粗放等特點(diǎn),而且其產(chǎn)生菌來(lái)源廣泛,種類多,因此是一類極具開(kāi)發(fā)前途的水處理藥劑5-7.絮凝劑的研究工作已由

3、提純、改性,進(jìn)入到利用生物技術(shù)培育、篩選優(yōu)良菌種,以較低的成本獲得高效絮凝劑的研究階段8-9.本文從活性污泥中篩選獲得一株具有較高絮凝活性的菌株B J -,并對(duì)其培養(yǎng)條件和絮凝特性進(jìn)行了研究,以期提高該菌株合成的微生物絮凝劑的能力,開(kāi)發(fā)具有針對(duì)性的高效微生物絮凝劑,既能明顯提高絮凝效果,還可大大降低絮凝劑投入量,從而降低處理成本.1材料與方法哈爾濱文昌污水處理廠活性污泥200g 放入1000m L 去離子水中,于磁力攪拌器上攪拌10min ,待固體沉淀后,1000r min 離心15min 收集上清(1牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基(g L :牛肉膏3,蛋白胨10,NaCl 5,瓊脂20,pH7.0.(2

4、選擇培養(yǎng)基(g L :鄰苯二甲酸二丁脂(D BP 1.0,K 2HPO 40.6,MgS O 47H 2O 0.6,(NH 42S O 40.12,瓊脂15,pH6.8.(1分離與純化:取0.2m L 樣品于牛肉膏蛋白胨固體培養(yǎng)基均勻涂布,再經(jīng)多次劃線分離純化可獲得多個(gè)純菌株.(2初篩和復(fù)篩:將純化后的菌種接種到50m L 基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基,在35,160r min 條件下振蕩培養(yǎng)72h.取2m L 發(fā)酵液、0.2g 高嶺土、1m L 1%CaCl 2水溶液,加水至50m L ,于磁力攪拌器上攪拌2min 攪拌,靜置觀察,選擇能產(chǎn)生絮狀沉淀并收稿日期:2008-12-10作者簡(jiǎn)介:李博(1983

5、-,女,黑龍江哈爾濱人,東北林業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院,碩士研究生.第27卷第2期佳木斯大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版V ol.27N o.22009年03月Journal of Jiamusi University (Natural Science Edition Mar.2009使懸濁液變清的菌株的發(fā)酵液進(jìn)行下一步復(fù)篩.復(fù)篩結(jié)果以絮凝率作為表征參數(shù),以蒸餾水代替發(fā)酵液作對(duì)照,絮凝率計(jì)算公式如下:絮凝率=(A -B A ×100%(1細(xì)菌的培養(yǎng)形態(tài)及生理生化試驗(yàn)細(xì)菌的培養(yǎng)形態(tài)及生理生化試驗(yàn)參照文獻(xiàn)10.(2細(xì)菌DNA 的提取及PCR 擴(kuò)增按傳統(tǒng)方法提取細(xì)菌基因組DNA 11.選擇16S rDNA

6、基因通用引物序列分別為:(5-C AG ATGGG AG CTT 2G CT CCCTG -3;5-CG ACTT C ACCCC AAT C AT CTG-3.PCR 反應(yīng)條件為:94預(yù)變性5min ,94變性30s ,52退火30s ,72延伸1min ,30個(gè)循環(huán).絮凝活性的分布參照文獻(xiàn)12.分別改變發(fā)酵液投加量、pH 值、溫度和Ca 2+根據(jù)文獻(xiàn)13對(duì)微生物絮凝劑進(jìn)行提取和精制.再分別應(yīng)用紫外分光光度計(jì)(T U -1901在200nm 350nm 范圍,以及傅里葉變換紅外光譜儀(FTIR -8400S 光譜儀在4000500(cm -1范圍內(nèi)對(duì)絮凝劑精品進(jìn)行掃描,分析其主要成分.2結(jié)果

7、與討論2.1菌種篩選及鑒定共篩選獲得純培養(yǎng)45個(gè)菌株,選取一株絮凝活性穩(wěn)定并且絮凝率高達(dá)87.6%的菌株進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)研究,命名為B J -.菌株B J -呈桿狀,單個(gè)或成短鏈排列,革蘭氏陽(yáng)性菌,有橢圓型芽孢.菌落扁平、光滑、呈乳白色.其生理生化特征見(jiàn)表1.獲得菌株B J -16S rDNA 擴(kuò)增片段1559bp ,測(cè)序結(jié)果表明該序列與短芽孢桿菌的16S rDNA 序列有較高的同源性為99.3%,結(jié)合形態(tài)學(xué)和生理生化特征鑒定其為短芽孢桿菌屬(B acillusbrevis .表1菌株B J -生理生化特征試驗(yàn)項(xiàng)目結(jié)果試驗(yàn)項(xiàng)目結(jié)果革蘭氏染色+葡萄糖產(chǎn)氣-氧化酶-醋酸鹽利用+接觸酶+檸檬酸鹽利用+V

8、 -P-硝酸鹽利用-乳糖產(chǎn)酸+山梨醇產(chǎn)酸+甲基紅-甘露醇產(chǎn)酸+淀粉水解+明膠水解+“+”表示陽(yáng)性,“-”表示陰性2.2菌株產(chǎn)生絮凝劑的培養(yǎng)條件優(yōu)化劑的影響分別以葡萄糖、蔗糖、乳糖、可溶性淀粉、乙醇、牛肉膏和甘油作為碳源,試驗(yàn)結(jié)果如下:從菌體生長(zhǎng)來(lái)看,葡萄糖最容易被利用,而在乙醇、牛肉膏和甘油為碳源時(shí)基本不生長(zhǎng);從絮凝活性來(lái)看,葡萄糖和蔗糖為碳源時(shí)菌株B J -絮凝率最高,分別達(dá)到86.7%和84.0%;而葡萄糖又是比較廉價(jià)易得的原料,所以選用葡萄糖.不同碳源濃度下試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)圖1.當(dāng)葡萄糖濃度在1525g L 時(shí),絮凝率最高,當(dāng)濃度繼續(xù)增加,絮凝活性出現(xiàn)下降的趨勢(shì).從菌體生長(zhǎng)來(lái)看,以20g L

9、的葡萄糖作為碳源時(shí)菌體濃度最高,過(guò)高或過(guò)低的糖濃度都不利于B J -生長(zhǎng),這是由于糖濃度過(guò)低不能提供足夠的能量和物質(zhì)來(lái)源,而糖濃度過(guò)高會(huì)引起發(fā)酵液中滲透壓過(guò)高,使細(xì)胞失水生長(zhǎng)受到抑制.考慮到成本因素,選擇最優(yōu)碳源濃度為20g L 的葡萄糖.圖1碳源濃度對(duì)菌株B J -生長(zhǎng)及絮凝活性的影響的影響203佳木斯大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版2009年分別以蛋白胨、牛肉膏、酵母浸粉、大豆餅粉、尿素、K NO 3和(NH 42S O 4作為氮源,試驗(yàn)結(jié)果表明:細(xì)菌B J -在尿素、K NO 3和(NH 42S O 4三種無(wú)機(jī)氮源中無(wú)法正常生長(zhǎng),而在有機(jī)氮源中生長(zhǎng)狀況差別不大,其中以蛋白胨為氮源時(shí)菌株同時(shí)具有最高的

10、菌體濃度和高達(dá)90.2%的絮凝率,所以選擇蛋白胨為最佳氮源. L.圖2氮源濃度對(duì)菌株B J -生長(zhǎng)及絮凝活性的影響分別在培養(yǎng)基中加入0.5g L 不同金屬離子,試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表2.金屬離子對(duì)絮凝活性的影響不大,但Mg2+,Ca2+,Na+,Fe 2+和K +對(duì)B J -生長(zhǎng)有較強(qiáng)的促進(jìn)作用,而A13+作為培養(yǎng)基組分.表2金屬離子對(duì)菌株B J -生長(zhǎng)及絮凝活性的影響金屬離子菌體濃度(OD 600絮凝率(%2+0.5577.2該菌生長(zhǎng)最適pH 值在7.5左右,過(guò)高或過(guò)低均不利于菌株生長(zhǎng),這是由于pH 值過(guò)低或過(guò)高都會(huì)引起微生物表面電荷的改變,從而不利于細(xì)胞對(duì)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的吸收14.對(duì)于絮凝劑的產(chǎn)生,最適p

11、H值為6.0,此時(shí)絮凝率高達(dá)90%,這是由于該菌產(chǎn)物略呈酸性 .圖3初始pH 對(duì)菌株B J -生長(zhǎng)及絮凝活性的影響在2030范圍內(nèi),隨著培養(yǎng)溫度的上升,菌株B J -的生長(zhǎng)量和絮凝率都逐漸增加,而在30條件下,生物量和絮凝率均達(dá)到最大值,當(dāng)溫度繼續(xù)升高時(shí),生物量和絮凝率又同時(shí)呈逐漸下降的趨勢(shì) .圖4培養(yǎng)溫度對(duì)菌株B J -生長(zhǎng)及絮凝活性的影響2.3微生物絮凝劑絮凝特性的研究2.3.1絮凝活性的分布將菌株B J -在最適條件下160r min 振蕩培共設(shè)5個(gè)絮凝劑投加量梯度:1m L ,2m L ,3m L ,4m L 和5m L ,與其相對(duì)應(yīng)的絮凝率分別為67.4%,77.9%,83.9%,7

12、4.2%和56.5%.由此可見(jiàn),在低濃度范圍內(nèi)隨著絮凝劑濃度的提高,絮凝率隨之提高;但達(dá)到一定值后再增加絮凝劑的濃度,所形成的絮凝體會(huì)重新變成穩(wěn)定的膠體,絮凝率反而303第2期李博,等:高效微生物絮凝劑產(chǎn)生菌B J -的篩選鑒定及絮凝特性研究分別測(cè)定2m L發(fā)酵液對(duì)pH值為3,4,5,6,7, 8,9和10的100m L高嶺土懸濁液的絮凝率,對(duì)應(yīng)結(jié)果為69.5%,73.3%,78.7%,84.8%,84.2%, 82.9%,77.7%和70.0%.試驗(yàn)結(jié)果顯示,pH在5 9的范圍內(nèi),絮凝劑的絮凝效果都比較理想,可知該絮凝劑屬于非離子型絮凝劑,在酸堿情況下均能保持較好的絮凝效果,利于該菌株合成的

13、微生物絮凝劑的推廣和應(yīng)用.設(shè)10個(gè)溫度梯度:10,20,30,40,50,60,70,80, 90和100(、考察該絮凝劑的熱穩(wěn)定性.結(jié)果表明,菌株B J-所合成的絮凝劑在1060范圍內(nèi)隨著溫度的升高絮凝活性逐漸增大,在3060范圍內(nèi)絮凝活性基本保持不變,以60為最佳條件.但當(dāng)溫度超過(guò)60后,絮凝活性開(kāi)始迅速下降,高嶺土懸濁液出現(xiàn)渾濁現(xiàn)象.2.4絮凝劑有效成分的提取及鑒定應(yīng)用干燥提取得到的絮凝劑粗品處理高嶺土懸濁液,絮凝率達(dá)89.9%.將此絮凝劑粗品進(jìn)行層析,選擇波長(zhǎng)490nm比色,結(jié)果如圖5所示:第3 10管出現(xiàn)主吸收峰,第3035管出現(xiàn)弱吸收峰.分別將310管、3035管分別進(jìn)行混合,前者

14、絮凝活性達(dá)92.6%,而后者基本沒(méi)絮凝活性,因此可確定有效成分得到充分分離.最后將第310洗脫液混合后真空冷凍干燥,得到白色粉末即絮凝劑精制品,將此絮凝劑精品處理同樣高嶺土懸濁液,絮凝率為81.7%,其絮凝活性低于絮凝劑粗品,因此絮凝劑粗品具有實(shí)際應(yīng)用價(jià)值 .圖5絮凝劑有效成分的硅膠柱層析圖譜分析絮凝劑精制品表征結(jié)果如下:該絮凝劑精品在205nm處出現(xiàn)唯一的強(qiáng)吸收峰,Amax絮凝劑精品經(jīng)紅外掃描結(jié)果如圖6所示, 3230,1640,1440和1040cm-1處的吸收峰是所有已知多糖類的特征峰.其中,3230cm-1是-OH伸縮振動(dòng)的特征峰;1640cm-1和1440cm-1吸收峰分別是-C-O

15、-O非對(duì)稱伸縮振動(dòng)和對(duì)稱伸縮振動(dòng)引起的結(jié)果,表明有羧酸根離子存在;1040cm-1處是C-O-C和C-O-H兩種C-O的伸縮振動(dòng)引起的吸收峰.綜上,精制絮凝劑的有效成份為酸性多糖,其表面活性基團(tuán)有大量的-OH,-C OO-1,該絮凝劑為陰離子絮凝劑 .圖6絮凝劑精品紅外掃描圖譜3結(jié)論30、pH7.0,葡萄糖為20gL、蛋白胨為2.0gL,并添加0.5gL Mg2+的條件下生長(zhǎng)良好.對(duì)影響絮凝作用的各種因素系統(tǒng)分析的結(jié)果表明:菌液投放量為3%,pH控制在59、溫度為60條件下絮凝效果最好,加入濃度為8%的Ca2+可顯著提高其絮凝活性.其后又對(duì)該菌株的發(fā)酵液分別進(jìn)行了乙醇粗提和柱層析精提,得到微生

16、物絮凝劑粗品和403佳木斯大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版2009年精制絮凝劑.研究表明絮凝劑粗品有實(shí)際應(yīng)用價(jià)值,對(duì)高嶺土懸濁液的絮凝率高達(dá)92.6%.通過(guò)對(duì)精制絮凝劑進(jìn)行了結(jié)構(gòu)分析,發(fā)現(xiàn)該絮凝劑的有效成分為酸性多糖,且為陰離子絮凝劑.由此可見(jiàn)菌株B J -所合成的微生物絮凝劑具有絮凝率高、使用條件粗放的特點(diǎn),所以具有一定的實(shí)際應(yīng)用價(jià)值與發(fā)展前景.參考文獻(xiàn):1辛寶平,莊源益,李彤.生物絮凝劑的研究和應(yīng)用J .環(huán)境科學(xué),1998,6(5:57-62.2李和平,鄭澤根,朱柱,等.微生物絮凝劑J .重慶環(huán)境科學(xué),2000,1-21.3吳鍵,戴桂馥.微生物細(xì)胞的絮凝與微生物絮凝劑J .環(huán)境污染與防治,1994,1

17、2(6:27-29.4傅旭慶,汪大環(huán).微生物絮凝劑及其絮凝機(jī)理J .污染防治技術(shù),1998,11(1:6-9.5王猛,施憲法,柴曉利,等.微生物絮凝劑的研究J .環(huán)境污染與防治,1994,12(6:113-115.6馬放,李淑更,金文標(biāo),等.微生物絮凝劑的研究現(xiàn)狀及發(fā)展趨勢(shì)J .工業(yè)用水與廢水,2002,33(1:7-9.7黃曉武,胡勇有,浦躍武,等.微生物絮凝劑產(chǎn)生菌的篩選和特性研究J .工業(yè)用水與廢水,2002,35(3:5-7.8Ning H ,Y in L ,Jian C ,et al.Identification of a N ovel Bioflocculant10趙斌,何紹江.微

18、生物學(xué)實(shí)驗(yàn)M.北京科學(xué)出版社,2002,89-94,35.11覃宗華,蔡建平,葉秀華,等.納豆芽胞桿菌16S rRNA 基因的克隆及其系統(tǒng)進(jìn)化分析J .中國(guó)微生態(tài)學(xué)雜志,2005,17(5:324-326.12周禮.微生物絮凝劑產(chǎn)生菌的篩選、優(yōu)化及絮凝特性研究D.成都:四川大學(xué),2006.13瞿廣飛.產(chǎn)絮凝劑微生物的特征及其培養(yǎng)條件研究D .武漢:武漢理工大學(xué),2003.14鄭懷禮.生物絮凝劑與絮凝技術(shù)M.北京化學(xué)工業(yè)出版社,環(huán)境科學(xué)與工程出版中心,2004,132-148.15鄧述波,余剛,蔣展鵬,等.微生物絮凝劑M BFA9的絮凝機(jī)理研究J .水處理技術(shù),2001,27(1:22-25.1

19、6鄭榮珍,方仲根,葉海輝,等.蕃拉蘆薈水溶性多糖的分離和鑒定J .熱帶作物學(xué)報(bào),2000.21(3:49-57.The Screening of a Bio -flocculant -producing B acterium ,Optimizingof Its Culture Conditions and Characteristics of the Bio -flocculantLI Bo ,ZH AO Min ,PENG Yuan -ju(N ortheast Forestry U niversity ,H arbin 150040,China Abstract :A strain B J

20、 -with a high capability of producing bio -flocculant was is olated from activated sludge of Sequencing Batch Reactor.Its flocculating efficiency could achieve 87.6%.The strain was identified as Ba 2cillus brevis based on its m orphological ,physio logical properties and 16S rDNA sequence analysis.This study showed that the optimum pH and tem per ature