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文檔簡(jiǎn)介
1、腺相關(guān)病毒1腺相關(guān)病毒腺相關(guān)病毒操作手冊(cè)一、腺相關(guān)病毒(Ade no-Associated Viral Vector , AAV )簡(jiǎn)介腺相關(guān)病毒屬微小病毒科(parvovirus),為無(wú)包膜的單鏈線狀DNA病毒。AAV 的基因組約4700bp,包括上下游兩個(gè)開放讀碼框架(ORF),位于分別由145個(gè)核苷 酸組成的2個(gè)反向末端重復(fù)序列(ITR)之間?;蚪M中有3個(gè)啟動(dòng)子(P5、P19和P40)和2個(gè)開放閱讀讀框(ORF), rep和 cap,如圖1所示。rep編碼4個(gè)重疊的多功能蛋白,即Rep78 Rep68、Rep52和 Rep40,其中Rep78與Rep68參與AAV 的復(fù)制與整合,Rep
2、52和Rep40具有解螺 旋酶和ATP酶活性,與Rep78 Rep68共同參與單鏈基因組的復(fù)制;cap編碼的VP1、 VP2、VP3是裝配成完整病毒所需要的衣殼蛋白,它們?cè)贏AV病毒整合、復(fù)制和裝 配中其重要作用。<4.8 kb >repcapRepfi cationCapsidITR圖1.AAV基因結(jié)構(gòu)二、腺相關(guān)病毒的優(yōu)點(diǎn)1. 安全性高:迄今從未發(fā)現(xiàn)野生型 AAV對(duì)人體致病,重組AAV基因組序列上 去除了大部分的野生型AAV基因組元件,進(jìn)一步保證了安全性;2. 免疫原性低:AAV2的基因組僅4681個(gè)核苷酸,便于用常規(guī)的重組 DNA技 術(shù)進(jìn)行操作,而且進(jìn)行動(dòng)物實(shí)驗(yàn)時(shí)造成的免疫反應(yīng)
3、??;3. 宿主范圍廣:能感染分裂細(xì)胞和非分裂細(xì)胞;4. 表達(dá)穩(wěn)定:能介導(dǎo)基因的長(zhǎng)期穩(wěn)定表達(dá);5. 物理性質(zhì)穩(wěn)定:在60°C不能被滅活,能抗氯仿;(漢恒-AAV包裝)三、重組腺相關(guān)病毒載體系統(tǒng)簡(jiǎn)介AAV是一種復(fù)制缺陷型微小病毒,其增殖復(fù)制需要腺病毒或皰疹病毒的輔助。 AAV無(wú)輔助病毒系統(tǒng)(AAV Helper-FreeSystem)可以在無(wú)輔助病毒的條件下生產(chǎn)出重組腺 相關(guān)病毒。在AAV Helper-FreeSystem中,生產(chǎn)具有感染性的AAV病毒顆粒所需的腺 病毒基因產(chǎn)物(如:E2A,E4等基因)大部分由pHelper質(zhì)粒提供,其余的腺病毒基 因產(chǎn)物由穩(wěn)定表達(dá)腺病毒 E1基因的A
4、AV-293宿主細(xì)胞提供。AAV-293細(xì)胞是HEK293 細(xì)胞經(jīng)過(guò)改良腺相關(guān)病毒生產(chǎn)能力而衍生出的亞克隆細(xì)胞系。野生型AAV基因組由病毒rep和cap基因(分別編碼AAV復(fù)制和包裝相關(guān)的基因)及位于兩側(cè)的表達(dá)和包裝 必須的順式作用元件反向末端重復(fù)序列(Inverted Terminal Repeats ITRs)組成。在AAV Helper-Free System中,rep和cap基 因從病毒載體 中被轉(zhuǎn)移到輔助質(zhì)粒 pAAV-RC中,AAV ITRs仍位于病毒載體中。在輔助質(zhì)粒的幫助下,僅需兩端的ITR就能將攜帶的外源片段包裝進(jìn)入腺相關(guān)病毒顆粒,因此,rep和cap基因的轉(zhuǎn)移后空出的位置是
5、允許外源基因插入病毒基因組中的最大限度。由于不再需要活的輔助病毒, AAV Helper-Free System提供一個(gè)更安全,更便利的替代逆轉(zhuǎn)錄病毒和腺病毒的基因 傳遞系統(tǒng)。圖2. AAV Helper-FreeSystem腺相關(guān)病毒系統(tǒng)三、重組腺相關(guān)病毒載體不同血清型研究發(fā)現(xiàn)AAV具有多種血清型,各種不同血清型的AAV載體的主要區(qū)別是 衣殼蛋白不同,因此對(duì)不同的組織和細(xì)胞的轉(zhuǎn)染效率存在差異。目前漢恒生物 在 包裝腺相關(guān)病毒時(shí)有 9中不同的AAV血清型可供客戶選擇,建議客戶針對(duì)不 同組織器官選擇相應(yīng)血清型的 AAV病毒,見(jiàn)表1。血清型組織親和性AAV1肌肉,心臟,骨骼?。òㄐ募。?,神經(jīng)組織
6、AAV2中樞神經(jīng),肌肉,肝臟,腦組織,眼,AAV3肌肉,肝臟,肺,眼AAV4中樞神經(jīng),肌肉,眼,腦AAV5肺,眼,中樞神經(jīng),關(guān)節(jié)滑膜,胰腺AAV6肺,心臟AAV7肌肉,肝臟AAV8肝臟,眼,中樞神經(jīng),肌肉AAV9心臟,肌肉,肺(肺泡),肝臟,中樞神經(jīng)表1. 9種不同血清型對(duì)各組織器官細(xì)胞的親和性漢恒生物(Hanbio)提供各種血清型AAV包裝。四、AAV病毒包裝(一)AAV-293細(xì)胞的凍存隨著傳代的次數(shù)增加,AAV-293細(xì)胞會(huì)出現(xiàn)生長(zhǎng)狀態(tài)下降、突變等。為了防止此 類現(xiàn)象的出現(xiàn),我們需要在開始就對(duì)細(xì)胞進(jìn)行大量?jī)龃妫员WC實(shí)驗(yàn)的穩(wěn)定性和持續(xù) 性。在細(xì)胞對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期進(jìn)行凍存,增加細(xì)胞復(fù)蘇成活率。1
7、、去掉細(xì)胞培養(yǎng)上清液,加入PBS洗去殘留的培 養(yǎng)基;2、加入0.25%的胰酶,消化12min后,鏡下觀察細(xì)胞變圓,細(xì)胞間間隙加大時(shí), 去除胰酶,加入新鮮培養(yǎng)基吹打混勻,移入離心管中3、細(xì)胞計(jì)數(shù),將細(xì)胞全部晃下,加入3mL37C預(yù)熱的10% DMEM ,用10mL 移液管進(jìn)行吹打,較大力吹打 6-8次即可,不留死角,之后,將所有細(xì)胞吸出,置于 15mL離心管中,取 50ul混勻后的細(xì)胞于 1.5mLeppendof管中,加入 450ul 10%DMEM,即為10倍稀釋,混勻,取10ul細(xì)胞于計(jì)數(shù)板中計(jì)數(shù)。計(jì)數(shù)板上共4大格, 每大格16小格。計(jì)數(shù)時(shí),4大格均計(jì)數(shù),總數(shù)除以4(得每大格細(xì)胞數(shù)),再乘
8、以10(10倍稀釋),即為實(shí)際n萬(wàn)/mL細(xì)胞濃度。4、細(xì)胞離心,1000 rpm/min, 5min。去掉上清。5、根據(jù)細(xì)胞計(jì)數(shù)結(jié)果加入細(xì)胞凍存液(70%完全培養(yǎng)基+20%FBS+10%DMSO) 重懸細(xì)胞,密度為3x 106個(gè)/ml。6、分裝進(jìn)細(xì)胞凍存管,放入凍存盒中,放入-80 °C超低溫冰箱。7、第二天將細(xì)胞放于液氮罐中長(zhǎng)久保存,并作記錄。保存過(guò)程中,要不時(shí)復(fù)蘇細(xì)胞檢測(cè)細(xì)胞存活率,觀察細(xì)胞狀態(tài)等。(二)AAV-293細(xì)胞的傳代當(dāng)細(xì)胞生長(zhǎng)到匯合率達(dá)到 80%90%時(shí)需要對(duì)細(xì)胞進(jìn)行傳代操作,以擴(kuò)大細(xì)胞數(shù)量,維持細(xì)胞良好的生長(zhǎng)狀態(tài)。1、消化細(xì)胞,方法同細(xì)胞凍存。2、細(xì)胞離心結(jié)束后,加
9、入完全培養(yǎng)基重懸。3、 根據(jù)具體情況,將細(xì)胞分到10cm培養(yǎng)皿中,每個(gè)培養(yǎng)皿補(bǔ)足到10ml培養(yǎng)基。(三)AAV-293細(xì)胞的復(fù)蘇當(dāng)細(xì)胞傳代次數(shù)過(guò)多,細(xì)胞狀態(tài)變差時(shí),或者細(xì)胞出現(xiàn)污染事故時(shí),需要丟棄并對(duì)最初凍存的細(xì)胞進(jìn)行復(fù)蘇。1、設(shè)置溫度為3742C的水浴。2、查看細(xì)胞庫(kù)記錄,根據(jù)記錄從液氮罐中取出凍存的細(xì)胞(需戴上棉手套,防止被凍傷),迅速丟入水浴鍋中并快速晃動(dòng),盡量在 12min內(nèi)使細(xì)胞溶液完全 溶解。3、將細(xì)胞溶液轉(zhuǎn)移到15ml離心管中,并在其中加上1ml新鮮的完全培養(yǎng)基,混勻后離心,1000 rpm/min,5min。4、 去掉上清,加入5ml新鮮的完全培養(yǎng)基,混勻沉淀后,轉(zhuǎn)入 6 cm
10、培養(yǎng)皿。5、將培養(yǎng)皿平穩(wěn)放入37C、5% CO2和95%相對(duì)濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。6、第二天觀察細(xì)胞存活率。給細(xì)胞換一下培養(yǎng)基。以后每天觀察細(xì)胞生長(zhǎng)情況。(四)AAV包裝和濃縮1. 質(zhì)粒擴(kuò)增構(gòu)建好的AAV載體、包裝質(zhì)粒和輔助質(zhì)粒需經(jīng)過(guò)大量抽提,濃度大于1ug/ul,A260/280在1.7-1.8間方可用以包毒。推薦使用Qiagen大抽試劑盒進(jìn)行質(zhì)粒的大量去 內(nèi)毒素抽提。2. 傳AAV-293細(xì)胞將培養(yǎng)AAV-293細(xì)胞T75瓶中的培養(yǎng)基吸凈,加入2mL 4度冰箱取出的0.25%胰 酶,使其均勻覆蓋瓶底,置于37度培養(yǎng)箱中3-5min,取出,搖晃可發(fā)現(xiàn)細(xì)胞于底部脫 離,將其全部晃下,加入3mL3
11、7度水浴中預(yù)熱的10% DMEM,移液槍用10mL移液 管進(jìn)行吹打,較大力吹打6-8次即可,不留死角,瓶口處較難吹打可將移液管對(duì)準(zhǔn)培 口,小力將培養(yǎng)基打出即可覆蓋到接近瓶口的細(xì)胞。之后,將所有細(xì)胞吸出,置于15mL離心管中,取50ul混勻后的細(xì)胞于1.5mLeppendof管中,加入450ul 10% DMEM, 即為10倍稀釋,混勻,取10ul細(xì)胞于計(jì)數(shù)板中計(jì)數(shù)。計(jì)數(shù)板上共4大格,每大格16小 格。計(jì)數(shù)時(shí),4大格均計(jì)數(shù),總數(shù)除以4 (得每大格細(xì)胞數(shù)),再乘以10 (10倍稀釋), 即為實(shí)際n萬(wàn)/mL細(xì)胞濃度。傳代當(dāng)天記為第一天,若第二天進(jìn)行轉(zhuǎn)染,鋪900-1000萬(wàn) /T75;若第三天轉(zhuǎn)染,
12、鋪350-400萬(wàn)/T75。每瓶T75加10mL 10% DMEM 培養(yǎng)基。轉(zhuǎn) 染當(dāng)天觀察細(xì)胞密度,80-90%滿即可進(jìn)行轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染前無(wú)需換培養(yǎng)基。3. 做脂轉(zhuǎn)complex試劑名稱試劑數(shù)量載體質(zhì)粒5ul(1.0ug/ul)包裝質(zhì)粒5ul(1.0ug/ul)輔助質(zhì)粒5ul(1.0ug/ul)注:Lipofiter TM轉(zhuǎn)染試劑為漢恒生物產(chǎn)品,使用說(shuō)明參考Lipofiter TM說(shuō)明書。4. AAV病毒收毒:病毒顆粒同時(shí)存在于包裝細(xì)胞和培養(yǎng)上清中??梢詫⒓?xì)胞和培養(yǎng)上清都收集下來(lái)以獲得最好的收率。1)準(zhǔn)備一個(gè)干冰乙醇?。▽⒁掖純A入裝有干冰的泡沫盒即可,也可用液氮替代干 冰乙醇?。┖?7°
13、C水??;2)將產(chǎn)毒的細(xì)胞連同培養(yǎng)基一同收集到一個(gè)15ml的離心管中。收集細(xì)胞時(shí),將培養(yǎng)盤傾斜一定角度將細(xì)胞刮到培養(yǎng)基中;3)1000rpm/min,離心3分鐘,分離細(xì)胞和上清,將上清另外存放,細(xì)胞用1ml PBS 重懸;4)將細(xì)胞懸浮液在干冰乙醇浴和 37°C水浴中反復(fù)轉(zhuǎn)移,凍融四次。每次融解后 稍加震蕩。注意:每次凝固和解凍大概需要十分鐘的時(shí)間。5. AAV病毒濃縮:1)10,000 g離心去除細(xì)胞碎片,將離心上清轉(zhuǎn)移到一個(gè)新離心管中。2)將兩次收集的上清混合在一起,用0.45um濾器過(guò)濾除雜質(zhì)3)加入1/2體積的1M NaCI, 10% PEG8000溶液,混合均勻,4度過(guò)夜4)
14、12,000 rpm離心2h,棄上清,病毒沉淀用適量的PBS溶液溶解,待完全溶解后 用0.22um濾器過(guò)濾除菌。5) 加入Benzonase核酸酶消化去除殘留的質(zhì)粒 DNA (終濃度為50 U/ml )。合 上管蓋,顛倒幾次以充分混合。在 37 °C孵育30分鐘;6)用0.45 ym過(guò)濾頭過(guò)濾,取濾出液,即為濃縮的 AAV病毒。6. AAV的純化1) 向病毒濃縮液中添加固體CsCl直到密度為1.41 g/ml (折射率為1.372);2) 將樣品加入到超速離心管中,用預(yù)先配好的1.41 g/ml CsCl溶液將離心管剩 余空間填滿;3)在175,000 g下離心24小時(shí),以形成密度梯
15、度。按順序分步收集不同密度的樣品,取樣進(jìn)行滴度測(cè)定。收集富集有AAV顆粒的組分;4)重復(fù)上述過(guò)程一次。5) 將病毒裝入100 kDa的透析袋,4度透析脫鹽過(guò)夜。此即為純化的 AAV病五、AAV病毒包裝滴度測(cè)定(采用Q-PCR法)1)取20ul濃縮病毒液,加入1ul RNAse-free DNAse,混勻,37C水浴反應(yīng)30min。2)4,12 000rpm/min,離心10 min,取10ul上清到另一個(gè)無(wú)菌的1.5ml EP管 中。3)加入90ul Dilution Buffer (1 mM Tris-HCl, pH 8.0, 0.1 mM EDTA,150mM NaCl) 混勻,37r金屬
16、浴反應(yīng)30min。4)自然冷卻至室溫,加入1ul蛋白酶K,65C水浴反應(yīng)1h。5)100C金屬浴反應(yīng)10mi n,自然冷卻至室溫。6)進(jìn)行Q-PCR檢測(cè)滴度。六、AAV病毒的儲(chǔ)存、稀釋1. 病毒的儲(chǔ)存:收到病毒液后在很短時(shí)間內(nèi)即使用 腺相關(guān)病毒 進(jìn)行實(shí)驗(yàn),可以將病毒暫時(shí)放置 于4C保存;如需長(zhǎng)期保存請(qǐng)放置于-80C (病毒置于凍存管,并 使用封口膜封口)。1 )病毒可以存放于-80 r 6個(gè)月以上;但如果病毒儲(chǔ)存時(shí)間超過(guò)6個(gè)月,建議在使 用前需要重新測(cè)定病毒滴度。2)反復(fù)凍融會(huì)降低病毒滴度:每次凍融會(huì)降低病毒滴度 10%;因此在病毒使用過(guò) 程中應(yīng)盡量避免反復(fù)凍融,為避免反復(fù)凍融,建議收到病毒后按照每次的 使用量進(jìn)行 分裝。2. 病毒的稀釋:如果需要稀釋病毒,請(qǐng)將病毒取出置于冰浴融解后,使用 PBS緩沖液或培養(yǎng)目 的細(xì)胞無(wú)血清培養(yǎng)基(含血清或含雙抗不影響病毒感染)?;靹蚍?裝后4 °C保存(請(qǐng)盡量 在三天內(nèi)用完)分裝后使用。七、使用安全注意事項(xiàng)1 病毒操作時(shí)最好使用生物安全柜。如果使用普通超凈工作臺(tái)操作病毒,請(qǐng)不 要 打開排風(fēng)機(jī)。2 病毒操作時(shí)請(qǐng)穿實(shí)驗(yàn)服,帶口罩
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