腺相關(guān)病毒操作手冊(cè)

1、腺相關(guān)病毒1腺相關(guān)病毒腺相關(guān)病毒操作手冊(cè)一、腺相關(guān)病毒（Ade no-Associated Viral Vector , AAV ）簡(jiǎn)介腺相關(guān)病毒屬微小病毒科（parvovirus），為無(wú)包膜的單鏈線狀DNA病毒。AAV 的基因組約4700bp,包括上下游兩個(gè)開(kāi)放讀碼框架（ORF），位于分別由145個(gè)核苷 酸組成的2個(gè)反向末端重復(fù)序列（ITR）之間。基因組中有3個(gè)啟動(dòng)子（P5、P19和P40）和2個(gè)開(kāi)放閱讀讀框（ORF）, rep和 cap,如圖1所示。rep編碼4個(gè)重疊的多功能蛋白，即Rep78 Rep68、Rep52和 Rep40,其中Rep78與Rep68參與AAV 的復(fù)制與整合，Rep

2、52和Rep40具有解螺 旋酶和ATP酶活性，與Rep78 Rep68共同參與單鏈基因組的復(fù)制；cap編碼的VP1、 VP2、VP3是裝配成完整病毒所需要的衣殼蛋白，它們?cè)贏AV病毒整合、復(fù)制和裝 配中其重要作用。<4.8 kb >repcapRepfi cationCapsidITR圖1.AAV基因結(jié)構(gòu)二、腺相關(guān)病毒的優(yōu)點(diǎn)1. 安全性高：迄今從未發(fā)現(xiàn)野生型 AAV對(duì)人體致病，重組AAV基因組序列上 去除了大部分的野生型AAV基因組元件，進(jìn)一步保證了安全性；2. 免疫原性低：AAV2的基因組僅4681個(gè)核苷酸，便于用常規(guī)的重組 DNA技 術(shù)進(jìn)行操作，而且進(jìn)行動(dòng)物實(shí)驗(yàn)時(shí)造成的免疫反應(yīng)

3、小；3. 宿主范圍廣：能感染分裂細(xì)胞和非分裂細(xì)胞；4. 表達(dá)穩(wěn)定：能介導(dǎo)基因的長(zhǎng)期穩(wěn)定表達(dá)；5. 物理性質(zhì)穩(wěn)定：在60°C不能被滅活，能抗氯仿；（漢恒-AAV包裝）三、重組腺相關(guān)病毒載體系統(tǒng)簡(jiǎn)介AAV是一種復(fù)制缺陷型微小病毒，其增殖復(fù)制需要腺病毒或皰疹病毒的輔助。 AAV無(wú)輔助病毒系統(tǒng)(AAV Helper-FreeSystem)可以在無(wú)輔助病毒的條件下生產(chǎn)出重組腺 相關(guān)病毒。在AAV Helper-FreeSystem中，生產(chǎn)具有感染性的AAV病毒顆粒所需的腺 病毒基因產(chǎn)物(如：E2A，E4等基因)大部分由pHelper質(zhì)粒提供，其余的腺病毒基 因產(chǎn)物由穩(wěn)定表達(dá)腺病毒 E1基因的A

4、AV-293宿主細(xì)胞提供。AAV-293細(xì)胞是HEK293 細(xì)胞經(jīng)過(guò)改良腺相關(guān)病毒生產(chǎn)能力而衍生出的亞克隆細(xì)胞系。野生型AAV基因組由病毒rep和cap基因(分別編碼AAV復(fù)制和包裝相關(guān)的基因)及位于兩側(cè)的表達(dá)和包裝 必須的順式作用元件反向末端重復(fù)序列(Inverted Terminal Repeats ITRs)組成。在AAV Helper-Free System中，rep和cap基 因從病毒載體 中被轉(zhuǎn)移到輔助質(zhì)粒 pAAV-RC中，AAV ITRs仍位于病毒載體中。在輔助質(zhì)粒的幫助下，僅需兩端的ITR就能將攜帶的外源片段包裝進(jìn)入腺相關(guān)病毒顆粒，因此，rep和cap基因的轉(zhuǎn)移后空出的位置是

5、允許外源基因插入病毒基因組中的最大限度。由于不再需要活的輔助病毒， AAV Helper-Free System提供一個(gè)更安全，更便利的替代逆轉(zhuǎn)錄病毒和腺病毒的基因 傳遞系統(tǒng)。圖2. AAV Helper-FreeSystem腺相關(guān)病毒系統(tǒng)三、重組腺相關(guān)病毒載體不同血清型研究發(fā)現(xiàn)AAV具有多種血清型，各種不同血清型的AAV載體的主要區(qū)別是 衣殼蛋白不同，因此對(duì)不同的組織和細(xì)胞的轉(zhuǎn)染效率存在差異。目前漢恒生物 在 包裝腺相關(guān)病毒時(shí)有 9中不同的AAV血清型可供客戶選擇，建議客戶針對(duì)不 同組織器官選擇相應(yīng)血清型的 AAV病毒，見(jiàn)表1。血清型組織親和性AAV1肌肉，心臟，骨骼肌（包括心?。窠?jīng)組織

6、AAV2中樞神經(jīng)，肌肉，肝臟，腦組織，眼，AAV3肌肉，肝臟，肺，眼AAV4中樞神經(jīng)，肌肉，眼，腦AAV5肺，眼，中樞神經(jīng)，關(guān)節(jié)滑膜，胰腺AAV6肺，心臟AAV7肌肉，肝臟AAV8肝臟，眼，中樞神經(jīng)，肌肉AAV9心臟，肌肉，肺（肺泡），肝臟，中樞神經(jīng)表1. 9種不同血清型對(duì)各組織器官細(xì)胞的親和性漢恒生物（Hanbio）提供各種血清型AAV包裝。四、AAV病毒包裝（一）AAV-293細(xì)胞的凍存隨著傳代的次數(shù)增加，AAV-293細(xì)胞會(huì)出現(xiàn)生長(zhǎng)狀態(tài)下降、突變等。為了防止此 類現(xiàn)象的出現(xiàn)，我們需要在開(kāi)始就對(duì)細(xì)胞進(jìn)行大量?jī)龃妫员ＷC實(shí)驗(yàn)的穩(wěn)定性和持續(xù) 性。在細(xì)胞對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期進(jìn)行凍存，增加細(xì)胞復(fù)蘇成活率。1

7、、去掉細(xì)胞培養(yǎng)上清液，加入PBS洗去殘留的培 養(yǎng)基；2、加入0.25%的胰酶，消化12min后，鏡下觀察細(xì)胞變圓，細(xì)胞間間隙加大時(shí)， 去除胰酶，加入新鮮培養(yǎng)基吹打混勻，移入離心管中3、細(xì)胞計(jì)數(shù)，將細(xì)胞全部晃下，加入3mL37C預(yù)熱的10% DMEM ,用10mL 移液管進(jìn)行吹打，較大力吹打 6-8次即可，不留死角，之后，將所有細(xì)胞吸出，置于 15mL離心管中，取 50ul混勻后的細(xì)胞于 1.5mLeppendof管中，加入 450ul 10%DMEM，即為10倍稀釋，混勻，取10ul細(xì)胞于計(jì)數(shù)板中計(jì)數(shù)。計(jì)數(shù)板上共4大格， 每大格16小格。計(jì)數(shù)時(shí)，4大格均計(jì)數(shù)，總數(shù)除以4（得每大格細(xì)胞數(shù)），再乘

8、以10（10倍稀釋），即為實(shí)際n萬(wàn)/mL細(xì)胞濃度。4、細(xì)胞離心，1000 rpm/min， 5min。去掉上清。5、根據(jù)細(xì)胞計(jì)數(shù)結(jié)果加入細(xì)胞凍存液（70%完全培養(yǎng)基+20%FBS+10%DMSO） 重懸細(xì)胞，密度為3x 106個(gè)/ml。6、分裝進(jìn)細(xì)胞凍存管，放入凍存盒中，放入-80 °C超低溫冰箱。7、第二天將細(xì)胞放于液氮罐中長(zhǎng)久保存，并作記錄。保存過(guò)程中，要不時(shí)復(fù)蘇細(xì)胞檢測(cè)細(xì)胞存活率，觀察細(xì)胞狀態(tài)等。（二）AAV-293細(xì)胞的傳代當(dāng)細(xì)胞生長(zhǎng)到匯合率達(dá)到 80%90%時(shí)需要對(duì)細(xì)胞進(jìn)行傳代操作，以擴(kuò)大細(xì)胞數(shù)量，維持細(xì)胞良好的生長(zhǎng)狀態(tài)。1、消化細(xì)胞，方法同細(xì)胞凍存。2、細(xì)胞離心結(jié)束后，加

9、入完全培養(yǎng)基重懸。3、 根據(jù)具體情況，將細(xì)胞分到10cm培養(yǎng)皿中，每個(gè)培養(yǎng)皿補(bǔ)足到10ml培養(yǎng)基。（三）AAV-293細(xì)胞的復(fù)蘇當(dāng)細(xì)胞傳代次數(shù)過(guò)多，細(xì)胞狀態(tài)變差時(shí)，或者細(xì)胞出現(xiàn)污染事故時(shí)，需要丟棄并對(duì)最初凍存的細(xì)胞進(jìn)行復(fù)蘇。1、設(shè)置溫度為3742C的水浴。2、查看細(xì)胞庫(kù)記錄，根據(jù)記錄從液氮罐中取出凍存的細(xì)胞（需戴上棉手套，防止被凍傷），迅速丟入水浴鍋中并快速晃動(dòng)，盡量在 12min內(nèi)使細(xì)胞溶液完全 溶解。3、將細(xì)胞溶液轉(zhuǎn)移到15ml離心管中，并在其中加上1ml新鮮的完全培養(yǎng)基，混勻后離心，1000 rpm/min，5min。4、 去掉上清，加入5ml新鮮的完全培養(yǎng)基，混勻沉淀后，轉(zhuǎn)入 6 cm

10、培養(yǎng)皿。5、將培養(yǎng)皿平穩(wěn)放入37C、5% CO2和95%相對(duì)濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。6、第二天觀察細(xì)胞存活率。給細(xì)胞換一下培養(yǎng)基。以后每天觀察細(xì)胞生長(zhǎng)情況。（四）AAV包裝和濃縮1. 質(zhì)粒擴(kuò)增構(gòu)建好的AAV載體、包裝質(zhì)粒和輔助質(zhì)粒需經(jīng)過(guò)大量抽提，濃度大于1ug/ul,A260/280在1.7-1.8間方可用以包毒。推薦使用Qiagen大抽試劑盒進(jìn)行質(zhì)粒的大量去 內(nèi)毒素抽提。2. 傳AAV-293細(xì)胞將培養(yǎng)AAV-293細(xì)胞T75瓶中的培養(yǎng)基吸凈，加入2mL 4度冰箱取出的0.25%胰 酶，使其均勻覆蓋瓶底，置于37度培養(yǎng)箱中3-5min，取出，搖晃可發(fā)現(xiàn)細(xì)胞于底部脫 離，將其全部晃下，加入3mL3

11、7度水浴中預(yù)熱的10% DMEM，移液槍用10mL移液 管進(jìn)行吹打，較大力吹打6-8次即可，不留死角，瓶口處較難吹打可將移液管對(duì)準(zhǔn)培 口，小力將培養(yǎng)基打出即可覆蓋到接近瓶口的細(xì)胞。之后，將所有細(xì)胞吸出，置于15mL離心管中，取50ul混勻后的細(xì)胞于1.5mLeppendof管中，加入450ul 10% DMEM， 即為10倍稀釋，混勻，取10ul細(xì)胞于計(jì)數(shù)板中計(jì)數(shù)。計(jì)數(shù)板上共4大格，每大格16小 格。計(jì)數(shù)時(shí)，4大格均計(jì)數(shù)，總數(shù)除以4 （得每大格細(xì)胞數(shù)），再乘以10 （10倍稀釋）， 即為實(shí)際n萬(wàn)/mL細(xì)胞濃度。傳代當(dāng)天記為第一天，若第二天進(jìn)行轉(zhuǎn)染，鋪900-1000萬(wàn) /T75;若第三天轉(zhuǎn)染，

12、鋪350-400萬(wàn)/T75。每瓶T75加10mL 10% DMEM 培養(yǎng)基。轉(zhuǎn) 染當(dāng)天觀察細(xì)胞密度，80-90%滿即可進(jìn)行轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染前無(wú)需換培養(yǎng)基。3. 做脂轉(zhuǎn)complex試劑名稱試劑數(shù)量載體質(zhì)粒5ul(1.0ug/ul)包裝質(zhì)粒5ul(1.0ug/ul)輔助質(zhì)粒5ul(1.0ug/ul)注：Lipofiter TM轉(zhuǎn)染試劑為漢恒生物產(chǎn)品，使用說(shuō)明參考Lipofiter TM說(shuō)明書(shū)。4. AAV病毒收毒：病毒顆粒同時(shí)存在于包裝細(xì)胞和培養(yǎng)上清中?？梢詫⒓?xì)胞和培養(yǎng)上清都收集下來(lái)以獲得最好的收率。1）準(zhǔn)備一個(gè)干冰乙醇?。▽⒁掖純A入裝有干冰的泡沫盒即可，也可用液氮替代干 冰乙醇浴）和37°

13、C水?。?）將產(chǎn)毒的細(xì)胞連同培養(yǎng)基一同收集到一個(gè)15ml的離心管中。收集細(xì)胞時(shí)，將培養(yǎng)盤(pán)傾斜一定角度將細(xì)胞刮到培養(yǎng)基中；3）1000rpm/min，離心3分鐘，分離細(xì)胞和上清，將上清另外存放，細(xì)胞用1ml PBS 重懸；4）將細(xì)胞懸浮液在干冰乙醇浴和 37°C水浴中反復(fù)轉(zhuǎn)移，凍融四次。每次融解后 稍加震蕩。注意：每次凝固和解凍大概需要十分鐘的時(shí)間。5. AAV病毒濃縮：1）10,000 g離心去除細(xì)胞碎片，將離心上清轉(zhuǎn)移到一個(gè)新離心管中。2）將兩次收集的上清混合在一起，用0.45um濾器過(guò)濾除雜質(zhì)3）加入1/2體積的1M NaCI, 10% PEG8000溶液，混合均勻，4度過(guò)夜4）

14、12,000 rpm離心2h，棄上清，病毒沉淀用適量的PBS溶液溶解，待完全溶解后 用0.22um濾器過(guò)濾除菌。5） 加入Benzonase核酸酶消化去除殘留的質(zhì)粒 DNA （終濃度為50 U/ml ）。合 上管蓋，顛倒幾次以充分混合。在 37 °C孵育30分鐘；6）用0.45 ym過(guò)濾頭過(guò)濾，取濾出液，即為濃縮的 AAV病毒。6. AAV的純化1） 向病毒濃縮液中添加固體CsCl直到密度為1.41 g/ml （折射率為1.372）;2） 將樣品加入到超速離心管中，用預(yù)先配好的1.41 g/ml CsCl溶液將離心管剩 余空間填滿；3）在175,000 g下離心24小時(shí)，以形成密度梯

15、度。按順序分步收集不同密度的樣品，取樣進(jìn)行滴度測(cè)定。收集富集有AAV顆粒的組分；4）重復(fù)上述過(guò)程一次。5） 將病毒裝入100 kDa的透析袋，4度透析脫鹽過(guò)夜。此即為純化的 AAV病五、AAV病毒包裝滴度測(cè)定（采用Q-PCR法）1）取20ul濃縮病毒液，加入1ul RNAse-free DNAse，混勻，37C水浴反應(yīng)30min。2）4,12 000rpm/min，離心10 min，取10ul上清到另一個(gè)無(wú)菌的1.5ml EP管 中。3）加入90ul Dilution Buffer （1 mM Tris-HCl, pH 8.0, 0.1 mM EDTA，150mM NaCl） 混勻，37r金屬

16、浴反應(yīng)30min。4）自然冷卻至室溫，加入1ul蛋白酶K，65C水浴反應(yīng)1h。5）100C金屬浴反應(yīng)10mi n,自然冷卻至室溫。6）進(jìn)行Q-PCR檢測(cè)滴度。六、AAV病毒的儲(chǔ)存、稀釋1. 病毒的儲(chǔ)存：收到病毒液后在很短時(shí)間內(nèi)即使用 腺相關(guān)病毒 進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，可以將病毒暫時(shí)放置 于4C保存；如需長(zhǎng)期保存請(qǐng)放置于-80C （病毒置于凍存管，并 使用封口膜封口）。1 ）病毒可以存放于-80 r 6個(gè)月以上；但如果病毒儲(chǔ)存時(shí)間超過(guò)6個(gè)月，建議在使 用前需要重新測(cè)定病毒滴度。2）反復(fù)凍融會(huì)降低病毒滴度：每次凍融會(huì)降低病毒滴度 10%;因此在病毒使用過(guò) 程中應(yīng)盡量避免反復(fù)凍融，為避免反復(fù)凍融，建議收到病毒后按照每次的 使用量進(jìn)行 分裝。2. 病毒的稀釋：如果需要稀釋病毒，請(qǐng)將病毒取出置于冰浴融解后，使用 PBS緩沖液或培養(yǎng)目 的細(xì)胞無(wú)血清培養(yǎng)基（含血清或含雙抗不影響病毒感染）?；靹蚍?裝后4 °C保存（請(qǐng)盡量 在三天內(nèi)用完）分裝后使用。七、使用安全注意事項(xiàng)1 病毒操作時(shí)最好使用生物安全柜。如果使用普通超凈工作臺(tái)操作病毒，請(qǐng)不 要 打開(kāi)排風(fēng)機(jī)。2 病毒操作時(shí)請(qǐng)穿實(shí)驗(yàn)服，帶口罩