華東師范大學(xué)生物系生化技術(shù)總復(fù)習(xí)(共8頁(yè))

1、精選優(yōu)質(zhì)文檔-傾情為你奉上1、 名詞解釋：1 【生化技術(shù)】在生物化學(xué)及其相關(guān)學(xué)科應(yīng)用的各種技術(shù)統(tǒng)稱為生化技術(shù)。主要指生物體內(nèi)物質(zhì)及其代謝產(chǎn)物，特別是生物大分子如蛋質(zhì)、核酸的分離、檢測(cè)、制備與改造技術(shù)。2 【抽提】是指用適當(dāng)?shù)娜芤海ㄈ缇彌_液、稀酸、稀堿或有機(jī)溶劑如丙酮、乙醇）進(jìn)行反復(fù)萃取，逐步將原料中有效成分最大限度分離出來(lái)的過(guò)程。3 【有機(jī)溶劑沉淀法】利用與水互溶的有機(jī)溶劑(如甲醇、乙醇、丙酮等)能使蛋白質(zhì)在水中的溶解度顯著降低而沉淀的方法，稱為有機(jī)溶劑沉淀。其原因有二，一是具有脫水作用，二是有機(jī)溶劑的介電常數(shù)比水導(dǎo)致溶劑的極性變小。4 【吸附柱層析】是以固體吸附劑為固定相，以有機(jī)溶劑或緩沖液

2、為流動(dòng)相構(gòu)成柱狀的一種層析方法。常用吸附劑有極性和非極性兩種。前者有羥基磷灰石、硅膠、氧化鋁和人造沸石等，后者有活性炭等。這種層析方法已成為科研、醫(yī)學(xué)、化工及發(fā)酵等部門(mén)常規(guī)使用的一種分離手段。5 【凝膠過(guò)濾層析】使用有一定大小孔隙的凝膠作層析介質(zhì)(如葡聚糖凝膠、瓊脂糖凝膠、聚丙烯酰胺凝膠等)，利用凝膠顆粒對(duì)分子量和形狀不同的物質(zhì)進(jìn)行分離的層析技術(shù)。由于各種分子的大小、形狀不同，擴(kuò)散到凝膠孔隙內(nèi)的速度不同，因而通過(guò)層析柱的快慢不同而分離。 6 【高效疏水層析】利用適度疏水性的填料，以含鹽的水溶液作為流動(dòng)相，借助于疏水作用分離活性蛋白質(zhì)的液相層析法稱為高效疏水層析。7 【毛細(xì)管電泳】以毛細(xì)管為分離

3、通道、高壓電場(chǎng)為驅(qū)動(dòng)力的電泳分離分析法。包括毛細(xì)管自由流動(dòng)電泳、毛細(xì)管區(qū)帶電泳等。 在高電場(chǎng)強(qiáng)度作用下，毛細(xì)管中的待測(cè)物質(zhì)可按其分子質(zhì)量、電荷、淌度等因子的差異得到有效的分離。8 【等電點(diǎn)聚焦電泳】即電聚焦電泳法，是在一定抗對(duì)流截肢（如凝膠）中加入載體兩性電解質(zhì)，當(dāng)直流電通過(guò)時(shí)，形成一個(gè)由陽(yáng)極到陰極pH逐步上升的梯度。兩性化合物在此電泳過(guò)程中，就被濃集在與其等電點(diǎn)相等的pH區(qū)域，從而使不同化合物能按其各自等電點(diǎn)得到分離。9 【離子交換層析】是以離子交換劑為固定相，液體為流動(dòng)相的系統(tǒng)中進(jìn)行的。樣品中待分離的溶質(zhì)離子，與固定相上所結(jié)合的離子交換，不同的溶質(zhì)離子與離子交換劑上離子化的基團(tuán)的親和力和結(jié)

4、合條件不同，洗脫液流過(guò)時(shí)，樣品中的離子按結(jié)合力的弱強(qiáng)先后洗脫。在生物化學(xué)和分子生物學(xué)領(lǐng)域此法常用于分離蛋白質(zhì)、核酸等生物大分子。 10 【高效反相層析】利用非極性烷基固定相作為填料，以含有機(jī)改性劑（如異丙醇）的水溶液作為流動(dòng)相，借助于疏水效應(yīng)分離蛋白質(zhì)或核酸的液相層析法。11 【親和層析】以親和吸附劑作為固定相，以特異性溶液為流動(dòng)相，對(duì)配體（L）具有親和力之有效成分（S）進(jìn)行分離的過(guò)程。即利用分子與其配體間特殊的、可逆性的親和結(jié)合作用而進(jìn)行分離的一種層析技術(shù)。可以選用生物化學(xué)、免疫化學(xué)或其他結(jié)構(gòu)上吻合等親和作用而設(shè)計(jì)的各種層析分離方法。12 【生物傳感器】利用固定化的生物敏感材料(如酶、蛋白質(zhì)

5、、DNA、抗體、抗原、生物膜、微生物、細(xì)胞等)作為識(shí)別元件，與適當(dāng)?shù)睦砘瘬Q能器（如氧電極、光敏管、場(chǎng)效應(yīng)管、壓電晶體等等）及信號(hào)放大裝置構(gòu)成的分析工具或系統(tǒng)，將生化反應(yīng)轉(zhuǎn)變成可定量的物理、化學(xué)信號(hào)，從而能夠進(jìn)行生命物質(zhì)和化學(xué)物質(zhì)檢測(cè)和監(jiān)控的裝置。13 【PCR】即聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，是體外酶促合成特異DNA片段的一種方法,由變性、低溫退火及適溫延伸等幾步反應(yīng)組成一個(gè)周期,循環(huán)進(jìn)行,使目的DNA得以迅速擴(kuò)增,具有強(qiáng)、靈敏度高、操作簡(jiǎn)便、省時(shí)等特點(diǎn)。14 【芯片實(shí)驗(yàn)室】也稱微全分析系統(tǒng)或微流控芯片。它是采用微電子工業(yè)和半導(dǎo)體制造業(yè)中的一些精細(xì)工藝，在硅片、玻片和塑料等表面經(jīng)過(guò)必要的物化處理后，加工出微

6、細(xì)（微米級(jí)）結(jié)構(gòu)，制作成一塊幾平方厘米的、新興的生物芯片，可進(jìn)行化學(xué)或生物化學(xué)的實(shí)驗(yàn)程序。15 【層析】是以基質(zhì)為固定相（柱狀或薄層狀），以液體或氣體為流動(dòng)相，使有效成分和雜志在這兩個(gè)相中連續(xù)不斷、反復(fù)多次地進(jìn)行分配或交換、吸附作用，最終達(dá)到分離混合物的目的。常用幾種溶液有平衡液、洗滌液和洗脫液。16 【固定化酶】是用適當(dāng)?shù)奈锢?、化學(xué)方法，把粗制的或純化的酶固定于某一空間內(nèi)，使其成為既保持了本身的特性，又能在連續(xù)反應(yīng)之后可以回收和重復(fù)使用的一種制品。17 【細(xì)胞凋亡】即程序性細(xì)胞死亡，是細(xì)胞通過(guò)內(nèi)在的程序來(lái)決定其死亡的，常常是生理性的。18 【電滲現(xiàn)象】在電場(chǎng)的影響下，帶電荷的液體對(duì)攜帶相反電

7、荷的固定介質(zhì)進(jìn)行相對(duì)運(yùn)動(dòng)的現(xiàn)象?？梢愿淖儙щ婋x子在電泳中的移動(dòng)速度甚至方向。免疫對(duì)流電泳中也利用了電滲現(xiàn)象。2、 選擇題中的計(jì)算公式1. （P99）【分配系數(shù)Kav】Kav=Ve-Vo/Vt-VoVe：分離物體本身的洗脫體積Vo：外水體積Vt：凝膠床總體積備注：在固定相和層析柱體積已確定時(shí)，Vt和Vo都為恒定值，Ve隨分離物分子質(zhì)量的變化而變化（反關(guān)系）。2. （P328）【總濃度T%；交聯(lián)度C%】T%=a+b/v；C%=b/a+ba：?jiǎn)误w丙烯酰胺重量（g）b：雙體（交聯(lián)劑）甲撐雙丙烯酰胺重量（g）v：溶液中的體積（ml）3、 各章重點(diǎn)第一章 生命大分子物質(zhì)的制備1. 影響抽提有效成分的主要因

8、子（選擇判斷）pH （堿低酸高）、溶劑極性和離子強(qiáng)度、水解酶、溫度（低溫）、攪拌、氧化、金屬離子抽提液與抽提物的比例（5:1）2. 破碎細(xì)胞的常用方法及目的（選擇判斷）機(jī)械破碎：研磨法（鼠肝、兔肝）、組織搗碎器法、超聲波法、凍融法溶脹和自溶：溶脹（紅血球）、自溶3. 化學(xué)處理（脂溶性溶劑或表面活性劑） 4. 生物酶降解（溶菌酶溶解細(xì)胞壁，滲透壓引起細(xì)胞膜破裂）第2章 沉淀法常用的沉淀法（1） 制備蛋白質(zhì)P21鹽析法、有機(jī)溶劑沉淀法、蛋白質(zhì)沉淀法（專一）、聚乙二醇沉淀法（專一）、選擇性沉淀法、結(jié)晶沉淀法（2） 制備核酸P31DNP/RNP 復(fù)合物的解聚、多糖等雜質(zhì)的消除、DNA與RNA的分離第3

9、章 吸附層析1. 吸附層析的基本原理在吸附層析法中，使用的固定相基質(zhì)是顆粒狀的吸附劑。在吸附劑的表面存在著許多隨機(jī)分布的吸附位點(diǎn)，這些位點(diǎn)通過(guò)范德華力和靜電引力與蛋白質(zhì)和核酸等生物分子結(jié)合，其結(jié)合力的大小與各種生物分子的結(jié)構(gòu)和吸附劑的性質(zhì)有密切關(guān)系。假如吸附劑對(duì)A的結(jié)合力小于B時(shí)，則B留在柱子上部，A移至下部。如果A的分配系數(shù)小于B，則A在柱子上的移動(dòng)速度大于B。因此混合物在層析柱中的分離過(guò)程，實(shí)質(zhì)上是吸附、解吸附、再吸附的連續(xù)過(guò)程，或者是在固定相與流動(dòng)相之間連續(xù)分配的過(guò)程。 2. 吸附柱層析法P37第4章 疏水層析疏水層析的基本原理及一般操作P59基本原理：就球形蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)而言，其分子中的

10、疏水性殘基數(shù)是從外向內(nèi)逐步增加的。疏水作用弱的物質(zhì)，用高濃度鹽溶液洗脫時(shí)，會(huì)被先洗脫下來(lái)。當(dāng)鹽溶液濃度降低時(shí)，疏水作用強(qiáng)的物質(zhì)才會(huì)隨后被洗脫下來(lái)。一般操作：P60層析柱的制備（層析柱規(guī)格、固定相、裝柱）加樣與洗脫第5章 離子交換層析 1. 離子交換層析的基本原理及一般操作基本原理：P64離子交換劑是由載體、電荷基團(tuán)（或功能基團(tuán)）和反離子構(gòu)成的。它在水中呈不溶解狀態(tài)，能釋放出反離子。在此期間，它將與溶液中的其他離子或離子化合物相互結(jié)合，結(jié)合后本身的理化性質(zhì)仍保持不變。離子交換劑與溶液中的離子或離子化合物的反應(yīng)主要以離子交換方式進(jìn)行，或者借助離子交換劑上電荷基團(tuán)對(duì)溶液中離子或離子化合物的吸附作用進(jìn)

11、行。這些過(guò)程都是可逆的。離子交換層析之所以能成功把各種物質(zhì)分開(kāi)，其主要依據(jù)是離子交換劑對(duì)各種離子或離子化合物有不同結(jié)合力。一般操作：P83離子交換劑的處理、再生和轉(zhuǎn)型；分離物質(zhì)的交換；物質(zhì)的洗脫與收集2. 常用離子交換劑的交換基團(tuán)離子交換樹(shù)脂按它的交換基團(tuán)分成陽(yáng)離子交換樹(shù)脂和陰離子交換樹(shù)脂兩大類：陽(yáng)離子交換樹(shù)脂又分為強(qiáng)酸性與弱酸性，前者具有的磺酸基交換基團(tuán)，適用于所有的酸性溶液,后者則是羧基、膦酸基或酚羥基,僅能用于中性至堿性溶液，但交換容量大，容易再生。陰離子交換樹(shù)脂又分為強(qiáng)堿性與弱堿性，前者帶有季胺基，適用于所有酸度的溶液，還能交換吸附弱酸；后者帶有叔胺基或仲胺基，僅能用于中性至酸性溶液。

12、3. 結(jié)合實(shí)驗(yàn)給出多組分，分析分離結(jié)果（陰性陽(yáng)性，分離前后順序）第六章 凝膠過(guò)濾 基本原理和一般操作基本原理：P98凝膠過(guò)濾層析所用的載體是具有立體網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)、篩孔直徑較一致，且呈珠狀顆粒的物質(zhì)。這種物質(zhì)可以全部或者部分排阻某些大分子化合物于篩孔之外，而不能排阻某些小分子化合物，但可讓其在篩孔中自由地?cái)U(kuò)散、滲透。在同一凝膠過(guò)濾柱上分離分子質(zhì)量不同的物質(zhì)時(shí)，由于流動(dòng)相的作用，這些分離物質(zhì)將發(fā)生排阻和擴(kuò)散效應(yīng)。若將緩沖液連續(xù)傾入柱中，柱中物質(zhì)的排阻和擴(kuò)散效應(yīng)也將不斷發(fā)生，其最終結(jié)果是分子質(zhì)量大的物質(zhì)先從柱中流出，分子質(zhì)量小的物質(zhì)則后從柱中流出。一般操作:P101凝膠的選擇和處理、凝膠柱的制備、加樣與

13、洗脫、凝膠柱的再生及保存第7章 親和層析 1. 基本原理親和層析是以親和吸附劑為固定相，以特異性溶液為流動(dòng)相，對(duì)與配體具有親和力之有效成分進(jìn)行分離的過(guò)程。每對(duì)反應(yīng)物之間都有一定的親和力。在親和層析中，特有的配體才能和匹配的生命大分子之間具有親和力，并產(chǎn)生復(fù)合物。且進(jìn)行反應(yīng)時(shí)呈液相狀態(tài)。實(shí)質(zhì)上親和層析是把具有識(shí)別能力的配體以共價(jià)鍵的方式固化到含有活化基團(tuán)的載體上，制成親和吸附劑，或稱固相載體。而固化后的配體仍保持束縛特異物質(zhì)的能力。樣品中隊(duì)配體有親和力的物質(zhì)可借助靜電引力、范德華力以及結(jié)構(gòu)互補(bǔ)效應(yīng)等作用吸附到固定相上，而無(wú)親和力或非特異吸附的物質(zhì)則被平衡緩沖液洗滌出來(lái)。然后恰當(dāng)?shù)馗淖兤胶饩彌_液的

14、pH，或增加離子強(qiáng)度，或加入抑制劑等因子，即可把有效成分從固定相上解離下來(lái)。2. 親和層析分離的三種情況（1） 親和力較?。嚎梢赃B續(xù)用大體積平衡緩沖液進(jìn)行洗脫，得到遲緩的大分子物質(zhì)峰。（2） 親和力一般時(shí)：主要靠改變緩沖液的性質(zhì)使有效成分與配體間的親和力減小到足以分離的程度。（3） 親和力較大時(shí)：可用與配體競(jìng)爭(zhēng)的溶液或者用含蛋白質(zhì)變性劑的溶液進(jìn)行洗脫。 a.競(jìng)爭(zhēng)性洗脫劑。專一性強(qiáng)，能洗脫出和配體特異結(jié)合的有效成分，洗脫時(shí)需要較大體積的洗脫液。 b.蛋白質(zhì)變性劑。即劇烈洗脫條件，洗脫下的有效成分需要經(jīng)過(guò)適當(dāng)?shù)奶幚?，方可恢?fù)活性。第8章 聚焦層析基本原理：P133該方法分離純化蛋白質(zhì)的依據(jù)是等電點(diǎn)

15、的差異和離子交換行為。蛋白質(zhì)所帶電荷取決于它的等電點(diǎn)和層析柱中的pH。當(dāng)柱中的pH低于蛋白質(zhì)的pI時(shí)，蛋白質(zhì)帶正電荷，且不與陰離子交換劑結(jié)合。而隨著洗脫劑向前移動(dòng)，固定相中的pH是隨著時(shí)間變化的。當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)移動(dòng)至pH高于其pI的環(huán)境時(shí)，蛋白質(zhì)變?yōu)閹ж?fù)電荷，并與陰離子交換劑結(jié)合。由于洗脫劑的通過(guò)，蛋白質(zhì)周?chē)沫h(huán)境pH再次低于pI時(shí)，它又帶正電荷，并從交換劑解吸附下來(lái)。隨著洗脫液向柱底的遷移，上述過(guò)程將反復(fù)進(jìn)行，于是各種蛋白質(zhì)就按各自的等電點(diǎn)大小被洗下來(lái)，從而分離。不同蛋白質(zhì)具有不同等電點(diǎn)，他們?cè)诒浑x子交換劑結(jié)合以前，移動(dòng)之距離是不一樣的，洗脫出來(lái)的先后次序是按等電點(diǎn)大小排列的。蛋白質(zhì)按其等電點(diǎn)在p

16、H梯度環(huán)境中進(jìn)行排列的過(guò)程叫做聚焦效應(yīng)。pH梯度的形成是聚焦效應(yīng)的先決條件。加入樣品后，它將迅速移動(dòng)到與它等電點(diǎn)相同的pH處，從此位置開(kāi)始緩慢進(jìn)行吸附、解吸附，知道pH<pI時(shí)被洗出；在其洗出之前，加入第二份相同樣品將遷移到第一個(gè)樣品緩慢移動(dòng)處，然后兩份樣品以相同速度移動(dòng)直到洗出。第9章 高效液相色譜 1. 高效液相色譜的特點(diǎn)高壓、高效、高速、高沸點(diǎn)且具有分離效率高、分析速度快、檢測(cè)靈敏度高和應(yīng)用范圍廣的特點(diǎn)，適合高沸點(diǎn)、大分子、強(qiáng)極性和熱穩(wěn)定性差的化合物的分離和分析。2. 儀器構(gòu)成（1） 進(jìn)樣系統(tǒng)將待測(cè)或欲分離的樣品液有效地注入色譜柱。進(jìn)樣量控制為一個(gè)恒定值。有益于提高分析樣品的重復(fù)性

17、。（2） 輸液系統(tǒng)流速可調(diào)且穩(wěn)定，當(dāng)高壓流動(dòng)相通過(guò)層析柱時(shí)，可降低樣品在柱中的擴(kuò)散效應(yīng)，加快其移動(dòng)速度。有益于提高分辨率、回收樣品、保持樣品的生物活性等。（3） 分離系統(tǒng)固定相載體粒度小，柱床極易達(dá)到均勻、致密狀態(tài)，極易降低渦流擴(kuò)散效應(yīng)。載體粒度小、微孔淺，樣品在微孔區(qū)內(nèi)傳質(zhì)短。有益于縮小譜帶寬度、提高分辨率。具恒溫器，通過(guò)改善傳質(zhì)速度，縮短分析時(shí)間，就能增加色譜柱效率。（4） 檢測(cè)系統(tǒng)紫外、示差折光、熒光檢測(cè)器 （5） 數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)可對(duì)測(cè)試數(shù)據(jù)進(jìn)行采集、貯存、顯示、打印和處理等操作，使樣品的分離、制備或鑒定工作能正確開(kāi)展。第10章 固定化的酶與微生物1. 酶固定化的方法載體結(jié)合法（物理吸附法

18、、離子結(jié)合法、共價(jià)結(jié)合法）、交聯(lián)法、包埋法2. 固定化對(duì)酶的穩(wěn)定性、活性影響 P166（1）活性降低（2）活性曲線和最適pH發(fā)生偏移（3）穩(wěn)定性優(yōu)于游離酶（4）米氏常數(shù)變化依情況而定（5）可能增加抵抗氧化作用的性能（6）可能喪失對(duì)底物或生成物的選擇性，提高相對(duì)活性第14章 生物芯片1. 基因芯片的基本原理 基因芯片是將大量已知基因片段（與核酸印跡雜交相反，亦稱靶基因）以微陣列方式固定在支持物上，待測(cè)樣品用熒光試劑標(biāo)記制作成探針。當(dāng)探針與芯片上的靶基因雜交后，經(jīng)嚴(yán)格洗滌，去除未雜交或部分配對(duì)的探針DNA分子，用熒光檢測(cè)儀定量分析雜交信號(hào)強(qiáng)度。由于探針與靶基因完全配對(duì)時(shí)產(chǎn)生的熒光信號(hào)比含一個(gè)或兩個(gè)

19、錯(cuò)配堿基的雜合分子高數(shù)十倍，因而精確測(cè)定熒光信號(hào)即可實(shí)現(xiàn)檢測(cè)的特異性。同時(shí)通過(guò)檢測(cè)每個(gè)靶基因分子的雜交信號(hào)強(qiáng)度，就可以獲取樣品分子的數(shù)量和序列信息。2. 生物芯片的主要類型基因芯片、蛋白質(zhì)芯片、芯片實(shí)驗(yàn)室第15章 聚合酶鏈反應(yīng) 1.PCR的類型和基本原理 （1）普通PCR使用離體模板DNA進(jìn)行擴(kuò)增的，這種DNA是從組織或細(xì)胞中分離出來(lái)的。雙鏈DNA在多種酶的作用下可以變性解鏈成單鏈，在與啟動(dòng)子的參與下，根據(jù)復(fù)制成同樣的兩分子挎貝。在PCR實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，DNA在高溫時(shí)也可以發(fā)生變性解鏈，當(dāng)溫度降低后又可以復(fù)性成為雙鏈。因此，通過(guò)溫度變化控制DNA的變性和復(fù)性，并設(shè)計(jì)引物做啟動(dòng)子，加入DNA聚合酶、

20、dNTP就可以完成特定基因的體外復(fù)制。（2） 原位PCR 使用細(xì)胞或組織的DNA作模板進(jìn)行擴(kuò)增的。并可用這種模板DNA來(lái)確定其生存細(xì)胞的類型，或在細(xì)胞中的位置，或生存細(xì)胞在組織中的百分比等。細(xì)胞經(jīng)固定液處理后，具有一定的通透性，PCR試劑，Taq聚合酶、引物等容易滲入。隨之開(kāi)始原位PCR擴(kuò)增，雖然有少量產(chǎn)物可擴(kuò)散到細(xì)胞的周?chē)h(huán)境中，但大部分仍保留在細(xì)胞內(nèi)。因此，利用標(biāo)記引物在原位進(jìn)行PCR，即可借助直接顯色或用特異性探針與擴(kuò)增產(chǎn)物雜交，獲得較滿意的檢測(cè)結(jié)果。（3） 反轉(zhuǎn)錄PCR擴(kuò)增真核生物基因時(shí)，需從mRNA開(kāi)始，經(jīng)反轉(zhuǎn)錄成cDNA后，再進(jìn)行PCR擴(kuò)增，這一過(guò)程稱反轉(zhuǎn)錄PCR。提取組織或細(xì)胞中

21、的總RNA，以其中的mRNA作為模板，采用dT或隨機(jī)引物利用逆轉(zhuǎn)錄酶反轉(zhuǎn)錄成cDNA。再以cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，而獲得目的基因或檢測(cè)基因表達(dá)。RT-PCR使RNA檢測(cè)的靈敏性提高了幾個(gè)數(shù)量級(jí)，使一些極為微量RNA樣品分析成為可能。 （4） 反向PCR反向PCR可以對(duì)一段已知序列兩端的未知序列進(jìn)行擴(kuò)增分析。 這時(shí)選擇的引物雖然與核心DNA區(qū)兩末端序列互補(bǔ)，但兩引物3端是相互反向的。擴(kuò)增前先用限制性內(nèi)切酶酶切樣品DNA，然后用DNA連接酶連接成一個(gè)環(huán)狀DNA分子，通過(guò)反向PCR擴(kuò)增引物的上游片段和下游片段。（5） 不對(duì)稱PCR是用不等量的一對(duì)引物，PCR擴(kuò)增后產(chǎn)生大量的單鏈DNA(SSDN

22、A).這對(duì)引物分別稱為非限制引物與限制性引物，其比例一般為501001.在PCR反應(yīng)的最初1015個(gè)循環(huán)中，其擴(kuò)增產(chǎn)物主要是雙鏈DNA，但當(dāng)限制性引物(低濃度引物)消耗完后，非限制性引物(高濃度引物)引導(dǎo)的PCR就會(huì)產(chǎn)生大量的單鏈DNA。獲得所需數(shù)目的單鏈后，即可應(yīng)用適當(dāng)引物對(duì)這種單鏈DNA進(jìn)行測(cè)序或制備探針。（6） 巢式PCR當(dāng)一對(duì)引物介導(dǎo)，一次擴(kuò)增極微量的目的DNA片段，難于滿足實(shí)驗(yàn)需要時(shí)，可改用多對(duì)引物介導(dǎo)，進(jìn)行兩次或多次擴(kuò)增DNA片段，則能獲得良好的結(jié)果，即巢式PCR。巢式PCR是一種變異的PCR，使用兩對(duì)PCR引物擴(kuò)增完整的片段。第一對(duì)PCR引物擴(kuò)增片段和普通PCR相似。第二對(duì)引物稱

23、為巢式引物（因?yàn)樗麄冊(cè)诘谝淮蜳CR擴(kuò)增片段的內(nèi)部）結(jié)合在第一次PCR產(chǎn)物內(nèi)部，使得第二次PCR擴(kuò)增片段短于第一次擴(kuò)增。巢式PCR的好處在于，如果第一次擴(kuò)增產(chǎn)生了錯(cuò)誤片斷，則第二次能在錯(cuò)誤片段上進(jìn)行引物配對(duì)并擴(kuò)增的概率極低。因此，巢式PCR的擴(kuò)增非常特異。（7） 彩色PCR將引物5'端用熒光物質(zhì)標(biāo)記后進(jìn)行PCR，即彩色PCR。通過(guò)彩色PCR合成的DNA具有熒光標(biāo)記物，該物質(zhì)在特定條件下會(huì)產(chǎn)生有色反應(yīng)。引物可用不同色彩的熒光試劑進(jìn)行標(biāo)記，PCR擴(kuò)增后，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳或離心后，置凝膠或沉淀物與PE熒光計(jì)的特定波長(zhǎng)下激發(fā)，不同試劑將產(chǎn)生不同波長(zhǎng)的發(fā)射光譜，用肉眼即可觀察到彩色譜帶或沉淀物。2. 定量PCR與普通PCR的區(qū)別熒光定量PCR儀比普通的PCR儀多了熒光信號(hào)采集系統(tǒng)和計(jì)算機(jī)分析處理系統(tǒng)，實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀主要是用來(lái)定量分析和確定基因轉(zhuǎn)錄水平的，而普通的PCR儀是做定性分析和擴(kuò)增基因片段，定量PCR儀可以做普通PCR儀的工作。主要有以下4點(diǎn)區(qū)