二重實(shí)時(shí)PCR快速檢測(cè)耐甲氧西林金黃色葡萄球菌

1、二重實(shí)時(shí)PCR快速檢測(cè)耐甲氧西林金黃色葡萄球菌【摘要】 目的 建立二重實(shí)時(shí)聚合酶鏈反應(yīng)(duplex real?time PCR)快速檢測(cè)耐甲氧西林金黃色葡萄球菌(MRSA)。方法 采用二重SYBR Green實(shí)時(shí)PCR快速檢測(cè)MRSA的決定基因mecA和金葡菌的種特異性基因nuc，經(jīng)熔解曲線分析鑒定產(chǎn)物。結(jié)果 所有MRSA菌株的熔解曲線均呈現(xiàn)mecA、nuc基因特異性的峰，甲氧西林敏感的金葡菌僅有nuc峰，耐甲氧西林的表葡菌僅有mecA峰，甲氧西林敏感的表葡菌與其他菌種的菌株無(wú)特異峰出現(xiàn)；當(dāng)MRSA菌濃度達(dá)102cfu/ml時(shí)就可檢出。在131株金葡菌中，30.53%(40/131)耐藥；二

2、重實(shí)時(shí)PCR擴(kuò)增mecA基因29.01%(38/131)陽(yáng)性，nuc基因100%陽(yáng)性。單引物與二重實(shí)時(shí)PCR兩者陽(yáng)性擴(kuò)增符合率為100%。結(jié)論 對(duì)mecA、nuc基因進(jìn)行二重實(shí)時(shí)PCR能準(zhǔn)確、快速地鑒定耐甲氧西林的金葡菌和凝固酶陰性的葡萄球菌。【關(guān)鍵詞】 實(shí)時(shí)聚合酶鏈反應(yīng) 耐甲氧西林金葡菌 mecA基因 nuc基因Rapid detection of methicillin?resistant Staphylococcus aureusABSTRACT Objective To establish a duplex real?time polymerase chain reaction (PC

3、R) assay for rapid detection of methicillin?resistant Staphylococcus aureus (MRSA). Method A duplex SYBR Green real?time PCR assay targeting the mecA gene and a Staphylococcus aureus specific marker?nuc gene and identifying PCR products through melting curve analysis was used to rapidly identify MRS

4、A. Results All MRSA strains tested in the study presented mecA and nuc gene specific peaks in the melting curve analysis; methicillin?susceptible Staphylococcus aureus (MSSA) strains only had a nuc peak, methicillin?resistant Staphylococcus epidermidis (MRSE) strains only had a mecA peak, and methic

5、illin?susceptible Staphylococcus epidermidis (MSSE) strains and strains of species other than staphylococci had no peak. MRSA strains could be detected, by use of this duplex real?time PCR in an 102 cfu/ml inoculum. Positive rate of drug sensitivity test was 30.53% (40/131) among 131 S.aureus isolat

6、es tested, of which 29.01% (38/131) were positive for mecA gene and all were positive for nuc gene in the duplex real?time PCR. The agreement between simplex and duplex real?time PCR was 100% for positive results. Conclusion This study shows that the duplex real?time PCR assay with the primers for t

7、o mecA and nuc genes is a valuable tool for rapid and precise identification of MRSA and methicillin?resistant coagulase?negative staphylococci (MRCNS).KEY WORDS Real?time polymerase chain reaction (RT?PCR); Methicillin?resistant Staphylococcus aureus (MRSA); mecA gene; nuc gene收稿日期：2006?06?15修回日期：2

8、006?10?30金黃色葡萄球菌是引起醫(yī)院和社區(qū)獲得性感染的重要的人類病原菌，在整合了葡萄球菌盒式染色體mec元件(staphylococcal cassette chromosome mec element，SCCmec)并經(jīng)歷幾次突變可演化成耐甲氧西林金葡菌(methicillin?resistant Staphylococcusaureus，MRSA)，導(dǎo)致包括萬(wàn)古霉素在內(nèi)的幾乎所有抗生素治療的失敗1。因此，快速、準(zhǔn)確地鑒定MRSA是控制院內(nèi)感染的先決條件。MRSA對(duì)甲氧西林耐藥的機(jī)制主要是由青霉素結(jié)合蛋白PBP2a介導(dǎo)的，SCCmec中的mecA基因是PBP2a的編碼基因2。金葡菌的胞

9、外熱穩(wěn)定核酸酶的基因序列nuc具有種的特異性3。我們運(yùn)用二重?zé)晒鈱?shí)時(shí)聚合酶鏈反應(yīng)(real?time polymerase chain reaction)檢測(cè)金葡菌臨床分離株的nuc基因和mecA基因，在進(jìn)行菌種確認(rèn)的同時(shí)快速鑒定MRSA。1 材料與方法1.1 材料(1)菌株來(lái)源 2005年9月從安徽省35所醫(yī)院臨床標(biāo)本中無(wú)重復(fù)分離的131株金葡菌和6株凝固酶陰性的表葡菌；標(biāo)準(zhǔn)菌株金葡菌ATCC33591(MRSA)和金葡菌ATCC29213(MSSA)以及大腸埃希菌ATCC25922、肺炎克雷伯菌ATCC700603、銅綠假單胞菌ATCC27853等均由安徽醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院感染病科提供。(2

10、)主要試劑 SYBR Premix Ex TaqTM(Perfect Real Time)購(gòu)自TaKaRa公司，是一種二倍濃度的預(yù)混試劑(包含熱啟動(dòng)DNA聚合酶TaKaRa Ex Taq HS、反應(yīng)用緩沖液、dNTP、SYBR Green I等)并附帶參比染料ROX Reference Dye II(50)；Mueller?Hinton瓊脂(英國(guó)Oxoid公司)；頭孢西丁鈉(海南海藥公司海口制藥廠)。(3)主要儀器 ABI Prism 7500型熒光定量PCR儀(美國(guó)Applied Biosystems公司)，多點(diǎn)接種儀(英國(guó)AQS Manufacturing公司)。(4)實(shí)時(shí)PCR引物 nu

11、c基因的引物NUC1/NUC2，mecA基因的引物MECA1/MECA2分別擴(kuò)增MRSA的279和222bp片段35。兩種引物對(duì)均委托TaKaRa公司合成(表1)。1.2 方法(1)細(xì)菌培養(yǎng)與模板制備 將實(shí)驗(yàn)用菌種復(fù)蘇后，分別劃線接種到MH瓊脂平板上，35培養(yǎng)24h后，挑取單個(gè)菌落溶于100l滅菌蒸餾水中。菌懸液95水浴15min，7000r/min離心1min，棄沉淀、留上清液作為PCR反應(yīng)的DNA模板。表1nuc、mecA二重實(shí)時(shí)PCR的引物序列引物GenBank號(hào)序列(53)Tm()NUC1V01281GCGATTGATGGTGATACGGTT55.9 (511531)NUC2V0128

12、1AGCCAAGCCTTGACGAACTAA?60.4 AGC(766789)MECA1X52593GCAATCGCTAAAGAACTAAG51.3 (693712)MECA2X52593GGGACCAACATAACCTAATA51.3 (895914)(2)nuc或mecA基因單一引物實(shí)時(shí)PCR 25l的反應(yīng)體系中包含有12.5l的SYBR Premix Ex TaqTM(2)、0.5l的ROX Reference Dye II(50)、2l的DNA模板、上游和下游引物各0.2mol/L。在ABI Prism 7500 PCR儀上經(jīng)95、10s的模板預(yù)變性后，再進(jìn)行40個(gè)循環(huán)的PCR擴(kuò)增即9

13、5變性5s、60退火和延伸34s。最后一個(gè)循環(huán)的熔解程序?yàn)椋?5，15s；58，1min；95，15s。溫度變化率除了從58升至95這一步為0.1/s，其余均為20/s。熒光信道設(shè)置在F1(530nm)處，單點(diǎn)熒光檢測(cè)在每個(gè)循環(huán)的60、34s退火和延伸步驟。(3)nuc、mecA基因二聯(lián)引物實(shí)時(shí)PCR 反應(yīng)總體積為25l，包括：2SYBR Premix Ex TaqTM 12.5l，50ROX Reference Dye II 0.5l，DNA模板2l，引物NUC1、NUC2各0.2mol/L，引物MECA1、MECA2各1.0mol/L。擴(kuò)增程序與單一引物實(shí)時(shí)PCR相同。每次試驗(yàn)均包括陽(yáng)性對(duì)

14、照(MRSA標(biāo)準(zhǔn)菌株)和陰性對(duì)照(模板DNA由無(wú)菌水取代)。(4)數(shù)據(jù)分析 反應(yīng)結(jié)束后，確認(rèn)SYBR Green I實(shí)時(shí)PCR擴(kuò)增曲線和熔解曲線，結(jié)合CT(threshold cycle，閾循環(huán))值、Tm(melting temperature，熔解溫度)值判定結(jié)果。樣本菌的擴(kuò)增CT值35且熒光曲線呈對(duì)數(shù)增長(zhǎng)；Tm值在MRSA標(biāo)準(zhǔn)株的Tm(mecA)0.3范圍之內(nèi)的菌株被認(rèn)為mecA基因陽(yáng)性，Tm值在標(biāo)準(zhǔn)株的Tm(nuc)0.5范圍之內(nèi)的菌株被認(rèn)為nuc基因陽(yáng)性。隨機(jī)選取部分野生株的PCR產(chǎn)物進(jìn)行3%瓊脂糖凝膠電泳鑒定。(5)特異性試驗(yàn) 用于檢測(cè)該二重實(shí)時(shí)PCR體系特異性的相關(guān)菌株如前所述。(

15、6)靈敏度試驗(yàn) MRSA標(biāo)準(zhǔn)菌純培養(yǎng)增菌后，將上述增菌液各稀釋成100、10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6和10-7等八個(gè)梯度。取一份稀釋液用煮沸法提取核酸作為模板上熒光PCR儀；另取一份用來(lái)涂布三個(gè)平板，進(jìn)行平板計(jì)數(shù)。(7)抗生素敏感性試驗(yàn) 以ATCC29213為標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)控菌株，按照2005年美國(guó)臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化研究所(CLSI)推薦的標(biāo)準(zhǔn)，采用瓊脂平皿對(duì)倍稀釋法測(cè)定頭孢西丁對(duì)金葡菌的最低抑菌濃度(MIC)。結(jié)果判讀標(biāo)準(zhǔn)6：頭孢西丁的MIC8g/ml為敏感，等于16g/ml為中介，32g/ml為耐藥。2 結(jié)果2.1 nuc基因、mecA基因的檢測(cè)熔解曲線分析表明，所有金

16、葡菌在nuc基因單一引物實(shí)時(shí)PCR中均呈現(xiàn)了Tm值在80.2081.20之間特異性的峰；所有含mecA基因的菌株在mecA基因單一引物實(shí)時(shí)PCR中均呈現(xiàn)了該基因特異性的峰(Tm值，78.4078.90)。二重SYBR Green實(shí)時(shí)PCR的熔解曲線分析中所有MRSA菌株均呈現(xiàn)了兩個(gè)峰，一個(gè)是mecA基因特異性的，另一個(gè)是nuc基因特異性的，Tm值范圍同前；MSSA僅有一個(gè)nuc基因特異性的峰，MRSE僅出現(xiàn)mecA基因特異性的峰，MSSE沒(méi)有任何特異性的峰出現(xiàn)，與陰性對(duì)照的結(jié)果相同(圖1)。幾株菌的PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳鑒定片段大小與預(yù)期的一致。2.2 二重實(shí)時(shí)PCR的特異性與敏感性應(yīng)用N

17、UC1/NUC2、MECA1/MECA2兩對(duì)引物檢測(cè)大腸埃希菌ATCC25922、肺炎克雷伯菌ATCC700603、銅綠假單胞菌ATCC27853，結(jié)果顯示非葡萄球菌菌株無(wú)任何特異擴(kuò)增峰，而陽(yáng)性對(duì)照出現(xiàn)了兩個(gè)特異擴(kuò)增峰。將MRSA標(biāo)準(zhǔn)菌株的菌懸液配制成108，107，.，10cfu/ml濃度，提取DNA后進(jìn)行二重實(shí)時(shí)PCR， 熔解曲線結(jié)果顯示，mecA和nuc基因在菌濃2.3 MRSA的鑒定二重?zé)晒鈱?shí)時(shí)PCR對(duì)131株臨床金葡菌野生株的檢測(cè)結(jié)果：nuc、mecA基因雙陽(yáng)性者為MRSA株，僅nuc基因陽(yáng)性為MSSA株；mecA基因有38株陽(yáng)性，陽(yáng)性率為29.01%；nuc基因100%陽(yáng)性。6株凝

18、固酶陰性的表葡菌野生株nuc基因均為陰性，其中5株mecA基因單陽(yáng)性者為MRSE，另1株雙陰性者為MSSE。nuc/mecA基因單一引物實(shí)時(shí)PCR與二重?zé)晒鈱?shí)時(shí)PCR的檢測(cè)結(jié)果一致(表2)。采用瓊脂稀釋法測(cè)定131株臨床分離的金葡菌對(duì)頭孢西丁的耐藥性，其中耐藥40株，中介3株，敏感88株，耐藥率為30.53%(表2)。表2131株金葡菌二重實(shí)時(shí)PCR與頭孢西丁MIC結(jié)果比較(株數(shù))頭孢西丁MIC(g/ml)32168合計(jì)mecA基因陽(yáng)性361138陰性428793合計(jì)403881313 討論近年來(lái)，世界范圍內(nèi)MRSA感染率不斷上升和其具有的多重耐藥性，使之成為現(xiàn)有抗生素難以控制的醫(yī)院感染菌。M

19、RSA的mecA基因大量表達(dá)與?內(nèi)酰胺類抗生素有著極低親和力的PBP2a，以替代高親和力PBPs行使功能是其主要的耐藥機(jī)制。mecA基因的表達(dá)某些輔助基因和調(diào)控基因的影響而導(dǎo)致異質(zhì)性耐藥(heterogeneity of resistance)。另外，中度耐藥的金葡菌(moderately resistant S.aureus，MODSA)、邊緣耐藥的金葡菌(borderline oxacillin?resistant S.aureus，BORSAs)通過(guò)非mecA介導(dǎo)的途徑也可表現(xiàn)出一定的低水平耐藥7。因此，需要綜合表型和基因型兩方面的結(jié)果鑒定MRSA。瓊脂稀釋法是CLSI/NCCLS推薦的

20、檢測(cè)MRSA的經(jīng)典方法。葡萄球菌對(duì)頭孢西丁耐藥表明它對(duì)所有?內(nèi)酰胺類抗生素耐藥8。我們測(cè)定了頭孢西丁對(duì)131個(gè)金葡菌臨床分離株的MIC，耐藥率為30.53%。MIC法費(fèi)力、耗時(shí)，成本較高，臨床上不宜作為常規(guī)方法開(kāi)展。目前，mecA基因的分子檢測(cè)已取代了該法成為鑒定MRSA的“金標(biāo)準(zhǔn)”7。傳統(tǒng)遺傳學(xué)方法基于MRSA的兩個(gè)靶：金葡菌種特異性的基因和編碼PBP2a的mecA基因；再結(jié)合PBP2a的免疫學(xué)檢測(cè)被作為標(biāo)準(zhǔn)的MRSA確證試驗(yàn)9。但常規(guī)PCR操作復(fù)雜、耗時(shí)，后期操作有污染(如電泳、探針雜交、RFLP等來(lái)評(píng)價(jià)擴(kuò)增產(chǎn)物)。熒光實(shí)時(shí)PCR在同一密閉的反應(yīng)管中進(jìn)行擴(kuò)增和檢測(cè)，無(wú)污染、速度快，靈敏度高

21、、特異性強(qiáng)，是替代培養(yǎng)或免疫試驗(yàn)診斷感染性疾病的一個(gè)最佳選擇10。國(guó)外報(bào)道實(shí)時(shí)PCR檢測(cè)MRSA所用產(chǎn)生熒光的化學(xué)方法有兩種，一種是序列非特異性的，如DNA結(jié)合熒光團(tuán)SYBR Green5；另一種使用了特異性熒光標(biāo)記的探針，如雜交雙探針11、核酸酶探針12、分子信標(biāo)13。它們除了產(chǎn)生熒光信號(hào)的機(jī)制不同外，檢測(cè)和分析的基本原理相似：即重復(fù)的PCR循環(huán)產(chǎn)生了以指數(shù)方式擴(kuò)增的產(chǎn)物以及熒光強(qiáng)度上的一個(gè)相應(yīng)的增加，熒光計(jì)監(jiān)測(cè)報(bào)告熒光信號(hào)的全程變化并由軟件分析結(jié)果。以PCR反應(yīng)的前315個(gè)循環(huán)的熒光信號(hào)作為基線信號(hào)，熒光閾值定義為基線信號(hào)的標(biāo)準(zhǔn)偏差的10倍。擴(kuò)增產(chǎn)物的熒光信號(hào)達(dá)到設(shè)定的閾值時(shí)所經(jīng)過(guò)的擴(kuò)增循

22、環(huán)次數(shù)為閾循環(huán)(threshold cycle，CT)。模板DNA量越少，CT值越大；若CT值超出一定的范圍時(shí)，即有可能產(chǎn)生污染，所以觀察設(shè)定在35個(gè)循環(huán)內(nèi)。SYBR Green I是一種結(jié)合于所有dsDNA雙螺旋小溝區(qū)域的具有綠色激發(fā)波長(zhǎng)的染料。PCR反應(yīng)完成后，當(dāng)體系溫度從58均勻升至95，PCR產(chǎn)物逐漸解鏈，檢測(cè)的熒光值逐步下降。當(dāng)溫度接近Tm值時(shí)，雙鏈DNA解鏈速度急劇變化，熔解曲線會(huì)在該溫度出現(xiàn)一個(gè)相應(yīng)波峰。DNA分子的Tm值通常與它的序列組成、GC含量、鏈長(zhǎng)度有關(guān)，反應(yīng)體系中的離子強(qiáng)度、SYBR Green I濃度等因素也會(huì)影響Tm值。根據(jù)熔解曲線波峰的多少和狹窄程度，峰頂對(duì)應(yīng)的溫

23、度是否與預(yù)期Tm一致，確定產(chǎn)物的特異性。在二重實(shí)時(shí)PCR體系中，兩種終產(chǎn)物具有不同的Tm值，分析同一反應(yīng)物的熒光熔解曲線可區(qū)分nuc基因(Tm，80.2081.20)和mecA基因(Tm，78.4078.90)。該法的檢測(cè)限為102cfu/ml，特異性試驗(yàn)未見(jiàn)有交叉反應(yīng)。本研究中131株臨床金葡菌野生株29.01% mecA基因陽(yáng)性，與藥敏法結(jié)果(30.53%)近似。38株mecA陽(yáng)性的金葡菌中藥敏法耐甲氧西林的有36株，另有1株中介、1株敏感。后兩者中所含mecA基因在多種內(nèi)、外因素影響下有潛在表達(dá)的可能，應(yīng)予重視，治療過(guò)程中應(yīng)避免使用?內(nèi)酰胺類抗生素。吳本權(quán)等14研究發(fā)現(xiàn)不同溫度、pH、鹽

24、濃度通過(guò)誘導(dǎo)耐藥蛋白PBP2a的表達(dá)明顯影響MRSA對(duì)苯唑西林、頭孢唑林和頭孢他啶耐藥水平，而其mecA基因卻不受培養(yǎng)條件的影響，可以快速檢測(cè)MRSA感染。mecA基因陰性的金葡菌中有4株表現(xiàn)為耐藥，2株中介，其原因可能為?內(nèi)酰胺酶的大量產(chǎn)生和其它PBPs與抗生素的親和力降低。這些菌對(duì)大劑量?內(nèi)酰胺類抗生素或?內(nèi)酰胺類抗生素與?內(nèi)酰胺酶抑制劑的聯(lián)合制劑仍然敏感，應(yīng)避免糖肽類抗生素的濫用。鄭波等15用常規(guī)多重PCR檢測(cè)MRSA和MRCNS，也發(fā)現(xiàn)通過(guò)mecA基因的鑒別法與藥敏法不是完全吻合，但有助于判斷其耐藥類型，為臨床診斷和治療提供依據(jù)。從臨床樣本中直接檢測(cè)MRSA是一個(gè)非常值得關(guān)注的課題。由

25、于SCCmec元件在葡萄球菌屬中分布廣泛(如本次試驗(yàn)中鑒定的5株MRSE)，因此從臨床標(biāo)本中直接檢測(cè)MRSA很困難。Fang等5組合肉湯增菌和SYBR Green實(shí)時(shí)PCR法建立了一種快速篩檢臨床樣本中MRSA的程序，減少了剔除陰性結(jié)果的時(shí)間和精力，這對(duì)MRSA流行率低的國(guó)家(如北歐)來(lái)說(shuō)特別有意義。實(shí)時(shí)PCR擴(kuò)增MRSA中連接SSCmec和染色體插入位點(diǎn)間的序列，對(duì)于從臨床樣本的直接檢測(cè)是很有希望的一個(gè)概念13。當(dāng)然，這種方法需要額外的確認(rèn)程序，并須考慮當(dāng)?shù)刂饕餍械腗RSA型，且對(duì)于新現(xiàn)的SSCmec型仍無(wú)法識(shí)別9?；趯?shí)時(shí)PCR中最簡(jiǎn)單實(shí)用的一種模式，我們建立了成本低、操作便捷、結(jié)果準(zhǔn)確可靠的二重?zé)晒鈱?shí)時(shí)PCR體系，適于常規(guī)微生物實(shí)驗(yàn)室對(duì)臨床可疑的葡萄球菌分離株進(jìn)行MRSA的