環(huán)境毒理學(xué)試驗(yàn)

1、環(huán)境毒理學(xué)實(shí)驗(yàn)環(huán)境毒理學(xué)實(shí)驗(yàn)姓名:吳天真班級(jí)：生物1501學(xué)號(hào)：201547005聯(lián)系方式友：高秋遠(yuǎn)梁旭實(shí)驗(yàn)一污染物對(duì)藻類的生長(zhǎng)抑制作用一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康?.了解藻類的生長(zhǎng)規(guī)律；2.掌握藻類的培養(yǎng)方法；3.掌握化學(xué)物質(zhì)對(duì)單細(xì)胞綠藻生長(zhǎng)影響的評(píng)價(jià)方法。二、實(shí)驗(yàn)內(nèi)容1.運(yùn)用毒理學(xué)實(shí)驗(yàn)方法，觀察藻類在含有化學(xué)污染物的水環(huán)境中的生長(zhǎng)抑制情 況；2.求出受試化合物對(duì)藻類生長(zhǎng)抑制的EC503闡明受試化合物的劑量一效應(yīng)關(guān)系與生長(zhǎng)抑制特征。三、實(shí)驗(yàn)原理單細(xì)胞藻類個(gè)體小、世代時(shí)間短，是水體中的初級(jí)生產(chǎn)者。因?yàn)榭稍诙唐?內(nèi)獲得化學(xué)物質(zhì)對(duì)其許多世代及種群水平上的影響， 所以利用污染物對(duì)藻類生 長(zhǎng)

2、的抑制作用，能反映污染物水平對(duì)水體中的初級(jí)生產(chǎn)者的作用情況。通過將 不同濃度的受試物加到屬于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的藻類中，在規(guī)定的實(shí)驗(yàn)條件下繼續(xù)培 養(yǎng)，每隔24 h測(cè)定藻類種群的濃度或生物量，以觀察受試物對(duì)藻類生長(zhǎng)的抑制 作用。經(jīng)方差分析或t檢驗(yàn)，顯著低于對(duì)照(p 0.05)的生長(zhǎng)率表明藻類生長(zhǎng) 受到抑制。四、實(shí)驗(yàn)儀器和試劑1.受試物研究藻類生長(zhǎng)抑制實(shí)驗(yàn)的受試物應(yīng)當(dāng)是揮發(fā)性低、環(huán)境穩(wěn)定性好且可溶于 水的物質(zhì)。如果需要助溶劑，它在水中的濃度不能超過0.1 mL/L。2.藻種斜生柵藻(Seenedesmus obliquus)或蛋白核小球藻(Chlorella pyre no idosa)。Q嚴(yán)并甘3.培養(yǎng)

3、基藻類的培養(yǎng)基很多，其成分和濃度各不相同，小球藻和柵藻可用“水生4號(hào)” 培養(yǎng)基培養(yǎng)。配制培養(yǎng)基時(shí)可將營(yíng)養(yǎng)鹽類按所需濃度直接加入無(wú)菌蒸餾水或去 離子水中。應(yīng)按順序逐個(gè)加入，待一種鹽類完全溶解后再加另一種。亦可先配 制各種營(yíng)養(yǎng)鹽類的濃度儲(chǔ)液，經(jīng)滅菌后避光冷藏保存。當(dāng)需要配制營(yíng)養(yǎng)基時(shí)，將一定量的濃儲(chǔ)備液搖勻，依次加入到蒸餾水或去離子水中即可。I 水生4號(hào)小球漠刖昭滝培揮甚含,B我養(yǎng)鹽0 200FeClj(l%)00150 030土壊湼出0.5000100水1000KC10 025uisa-HjO0 0S0*取少量菜園土，加2-3倍自來(lái)水，煮沸10余分鐘，冷卻后用濾紙過濾即 可使用。4.實(shí)驗(yàn)器材電子天

4、平（2臺(tái)）、立式壓力蒸汽滅菌器（2臺(tái)）、無(wú)菌操作臺(tái)（4臺(tái)）、顯微 鏡（4臺(tái)）、生化培養(yǎng)箱（2臺(tái)）、pH計(jì)（4套）、氣浴恒溫?fù)u床（4臺(tái)）、可見分光 光度計(jì)（4臺(tái)）、數(shù)字照度計(jì)（2臺(tái)）、血球計(jì)（4套）、血小球記數(shù)板（200塊）、4到7只30W的普通白色熒光燈、巾60漏斗（4個(gè)）、錐形瓶、溫度計(jì)、濾紙和 紗布等若干。5.實(shí)驗(yàn)藥品硫酸銨、磷酸二氫鈣、碳酸氫鈉、氯化鉀、硫酸鎂、氯化鐵均為分析純， 土壤浸出液。五、實(shí)驗(yàn)步驟1.藻類培養(yǎng)培養(yǎng)溫度為：242C；白色熒光燈均勻光照，光照強(qiáng)度為4000土400 lux， 連續(xù)光照或以12:12或14:10光暗比光照；機(jī)械震蕩（10010次/min）;培 養(yǎng)容器用棉

5、塞、濾紙、紗布（2-3層）或錫箔紙等封閉，對(duì)揮發(fā)性化學(xué)物質(zhì)采用 磨口玻璃瓶塞完全封閉?？筛鶕?jù)實(shí)驗(yàn)需要選擇容量不同的實(shí)驗(yàn)容器，125 mL錐形瓶中測(cè)試液的體積為40-60 mL;250 mL錐形瓶中測(cè)試液體積為70-100 mL;500 mL錐形瓶中測(cè)試液的體積為100-150 mL。2.藻試液的配制從儲(chǔ)備液中取出一定的藻液，接種到新鮮的無(wú)菌培養(yǎng)液中，接種濃度約為105個(gè)/mL。在與試驗(yàn)要求相同的條件下進(jìn)行預(yù)培養(yǎng)，要求在2-3天內(nèi)藻類能達(dá)到對(duì)數(shù)生長(zhǎng)，然后再次轉(zhuǎn)移到新鮮的培養(yǎng)液中。如此反復(fù)轉(zhuǎn)接培養(yǎng)2-3次，藻類生長(zhǎng)健壯并開始處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期時(shí)即可用來(lái)制備實(shí)驗(yàn)中需要的藻類試驗(yàn)液。3.受試物試驗(yàn)液的配制

6、根據(jù)初步試驗(yàn)確定產(chǎn)生效應(yīng)的濃度范圍，至少設(shè)置五個(gè)構(gòu)成對(duì)數(shù)間距系列 的濃度，濃度比不超過2.2。較佳的濃度范圍為，最低測(cè)定的濃度必須對(duì)藻類生 長(zhǎng)影響較?。ㄈ缟L(zhǎng)抑制率10%）,最高測(cè)定濃度對(duì)藻類生長(zhǎng)的抑制率接近100%至少設(shè)置3個(gè)平行樣，每一系列設(shè)一個(gè)對(duì)照。實(shí)驗(yàn)前應(yīng)測(cè)定受試液的pH,必要 時(shí)用鹽酸或氫氧化鈉溶液將pH調(diào)到7.50.2。試驗(yàn)結(jié)束時(shí)應(yīng)測(cè)定被測(cè)物質(zhì)的實(shí) 際濃度。4.測(cè)試液的配制先在每個(gè)試驗(yàn)錐形瓶中加入10 mL藻液， 再加10 mL受試物溶液。 對(duì)照組 只加10 mL培養(yǎng)液。將各瓶搖動(dòng)混勻后，放入光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。實(shí)驗(yàn)開始后，每隔24h（即在24,48h）測(cè)定各組藻類的細(xì)胞密度。六、實(shí)

7、驗(yàn)結(jié)果1.藻類生長(zhǎng)的測(cè)定藻類生長(zhǎng)是指在試驗(yàn)期間每毫升溶液中藻類細(xì)胞數(shù)目的增加量。 一般用以 下三種方法測(cè)定藻類的生長(zhǎng)：細(xì)胞計(jì)數(shù)；測(cè)光密度；測(cè)葉綠素含量。推 薦使用方法和。2.數(shù)據(jù)處理將不同濃度試驗(yàn)培養(yǎng)液和對(duì)照培養(yǎng)液的藻細(xì)胞濃度與測(cè)試時(shí)間繪制成曲線 圖， 再用下面方法確定濃度效應(yīng)關(guān)系。生長(zhǎng)率是單位時(shí)間內(nèi)（tn-t1）藻類細(xì)胞增長(zhǎng)的量（Nn-Nt）。對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的藻 類平均特定生長(zhǎng)率可用下式計(jì)算：（1）式中：卩一一藻類平均生長(zhǎng)率；t-培養(yǎng)時(shí)間，t1為起始時(shí)間，tn為終了時(shí)間；N藻類細(xì)胞生長(zhǎng)量，N1為起始細(xì)胞數(shù)，Nn為最終細(xì)胞數(shù)。以不同濃度組中藻類生長(zhǎng)率的下降比例與對(duì)數(shù)濃度作圖，可直接從圖上讀 出EC

8、5Q再標(biāo)明測(cè)定時(shí)間，如24 h EC50也可求出回歸關(guān)系式，再算出EC50表2實(shí)驗(yàn)記錄表格根據(jù)直線內(nèi)插法或概率單位圖解法估算24 h、48 h和72 h藻類生長(zhǎng)受到抑制的EC50測(cè)得的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)如下：4313.62745.31272.6627.63440.88B943 9897.91840.3584.63177.88187988985.31003.5131.63 37.75458.25160.1313844 183461265.6 65.7535平均值 3730.72722.13057.2B21.503306.630104.33131.9477.4586.79341.08671629191554

9、.977.493333.6728.125生物量2.22322.6185461910217702?888023.0476.66390.871243368(7.6)694521.7642.9172)4571206)65002)01675生物量單位：10A5個(gè)/mL時(shí)間受試物濃度020508011024生物量2.223221.618540.6191720.4177020.288802 1生長(zhǎng)率0.0545740.0413480.001311-0.01509-0.0304748生物量18.04746.663980.871240.336876 0.069452生長(zhǎng)率0.0872520.0589660.0

10、14231-0.00896-0.0593872生物量9.7642r6.917240.5712960.0650020.001675生長(zhǎng)率-0.025590.001554-0.01758-0.06855-0.1552浹捱主物示變化情況瑕耐i -璋列2 -安.可3 -案見4 -薪就5時(shí)間24h 時(shí)48h 時(shí)72h 時(shí)濃度 020508011002050801100205080110熒光強(qiáng) 094.52858.5904.38691.38602.140968 1271271037842564.9994.88 845.54720402 10786 1881.9717.585.25162557330.966

11、3.38203.6311.625七、注意事項(xiàng)1.在正式試驗(yàn)前必須進(jìn)行必要的預(yù)試驗(yàn)。2.實(shí)驗(yàn)藻種的選擇和預(yù)培養(yǎng)應(yīng)注意：藻細(xì)胞大小均勻，顏色鮮綠，處于對(duì) 數(shù)生長(zhǎng)期。試驗(yàn)開始3天內(nèi)，對(duì)照組藻細(xì)胞濃度至少應(yīng)增加16倍。3.需要明確受試化合物的理化特性，有針對(duì)性的進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。八、討論與思考1.干擾藻類EC50正常測(cè)定的因素有哪些？（1） 各錐形瓶在培養(yǎng)箱內(nèi)的位置不同，受光程度不同，導(dǎo)致藻類生長(zhǎng)情況 受影響。（2） 在藻類培養(yǎng)過程中，部分藻類沉淀，影響受光（3） 測(cè)定吸光度時(shí)，藻液未混合均勻，導(dǎo)致測(cè)得的數(shù)據(jù)與實(shí)際不符、2.受試物質(zhì)對(duì)藻類的生長(zhǎng)在不同時(shí)期起的作用有何不同？有無(wú)促進(jìn)作用？ 隨著時(shí)間增加，高濃度抑

12、制作用加強(qiáng)，低濃度促進(jìn)作用加強(qiáng)。3.根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，提示進(jìn)一步開展哪方面的研究？可進(jìn)行以下幾個(gè)方面的研究：（1）探究受試物影響藻類生長(zhǎng)的具體原因；（2）探究該受試物是否對(duì)其他植物有類似的左右；（3）實(shí)驗(yàn)成果的具體應(yīng)用。生長(zhǎng)率變化情況生長(zhǎng)率變化情況0094樂 0019WW嶠根據(jù)直線內(nèi)插法或概率單位圖解法估算24 h、48 h和72 h藻類生長(zhǎng)受到抑制的EC50:24h EC50=3.3548h EC50=3.3972h EC50=3.47實(shí)驗(yàn)二污染物對(duì)發(fā)光細(xì)菌的急性毒性測(cè)試發(fā)光菌毒性測(cè)試是20世紀(jì)70年代后興起的一種微生物監(jiān)測(cè)環(huán)境污染及 檢測(cè)污染物毒性的新方法。1978年美國(guó)Beckman公司即推

13、出功能完備的生物 發(fā)光光度計(jì)“Microtox”，自此，這一急性毒性測(cè)試技術(shù)在世界范圍內(nèi)迅速推廣。因此人們也將發(fā)光菌毒性測(cè)試稱為Microtox測(cè)試。采用現(xiàn)代光電檢測(cè)手段(生物發(fā)光光度計(jì))的發(fā)光菌生物毒性實(shí)驗(yàn)是毒理學(xué)中生物測(cè)定的方法之一。該方法快速、簡(jiǎn)便、靈敏、廉價(jià)，在有毒物質(zhì)的篩選，環(huán)境污染生物學(xué)評(píng)價(jià)等方面有 重要的意義，因而備受各國(guó)有關(guān)研究者的關(guān)注。1995年3月，國(guó)家環(huán)境保護(hù)局、國(guó)家技術(shù)監(jiān)督局將發(fā)光菌毒性測(cè)試定為水質(zhì)監(jiān)測(cè)標(biāo)準(zhǔn)方法(GB/T 15441-1995)。一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康?.掌握發(fā)光細(xì)菌毒性測(cè)試的標(biāo)準(zhǔn)方法；2.根據(jù)發(fā)光細(xì)菌發(fā)光強(qiáng)度的變化判斷受試化合物的毒性；3.初步了解發(fā)光細(xì)菌毒性測(cè)

14、試的影響因素。二、實(shí)驗(yàn)內(nèi)容1.發(fā)光細(xì)菌的復(fù)蘇；2.發(fā)光細(xì)菌發(fā)光強(qiáng)度的測(cè)定；3.受試化合物毒性的計(jì)算。三、實(shí)驗(yàn)原理發(fā)光細(xì)菌是一種非致病性的普通細(xì)菌， 具有發(fā)光能力，在正常條件下經(jīng)培 養(yǎng)后能發(fā)出肉眼可見的蘭綠色光，這種發(fā)光過程是細(xì)菌體內(nèi)一種新陳代謝反應(yīng)， 是氧化呼吸鏈上的一個(gè)側(cè)支。發(fā)光細(xì)菌的發(fā)光反應(yīng)模式圖(1)所示。發(fā)光細(xì)菌發(fā)光反應(yīng)途徑可簡(jiǎn)單概述為：FMNHOH RCHO 熒光+FMNk H2O+RCOOH (1)這個(gè)發(fā)光現(xiàn)象是呼吸代謝耦合，作為光能被散發(fā)。當(dāng)細(xì)菌體內(nèi)合成螢光酶、螢光素、長(zhǎng)鏈脂肪醛時(shí)，在氧的參與下發(fā)生生化反應(yīng)，反應(yīng)的結(jié)果便產(chǎn)生光。發(fā)光菌的發(fā)光現(xiàn)象是其正常的代謝活動(dòng)，在一定條件下發(fā)光

15、強(qiáng)度是恒定的，與 外來(lái)受試物(無(wú)機(jī)、有機(jī)毒物，抑菌、殺菌物等)接觸后，其發(fā)光強(qiáng)度即有所改 變。變化的大小與受試物的濃度呈相關(guān)關(guān)系，同時(shí)與該物質(zhì)的毒性大小有關(guān)。通常認(rèn)為外來(lái)受試物通過下面兩個(gè)途徑抑制細(xì)菌發(fā)光：(1)直接抑制參與發(fā)光反應(yīng)的酶類活性；(2)抑制細(xì)胞內(nèi)與發(fā)光反應(yīng)有關(guān)的代謝過程(如細(xì)胞呼吸等)。 毒物的毒性可以用EC50表示,即發(fā)光菌發(fā)光強(qiáng)度降低50%時(shí)毒物的濃度。實(shí) 驗(yàn)結(jié)果顯示，毒物濃度與菌體發(fā)光強(qiáng)度呈線性負(fù)相關(guān)關(guān)系。因而可以根據(jù)發(fā)光圖(1)發(fā)光細(xì)菌的發(fā)光反應(yīng)模式。E1:細(xì)菌熒光素酶，由 a、B2個(gè)亞 基組成，a 為40000-42000D,B 為37000-39000D。單獨(dú) a、B

16、 亞基均無(wú)發(fā) 光活性，只有 a、B 共存時(shí)才有活性。E2: NADH FMN氧化還原酶，分子量為3000D,對(duì)FMN有高度特異性。E3:脂肪酸還原酶。四、實(shí)驗(yàn)儀器與材料1.試劑：氯化汞（分析純）；氯化鈉（化學(xué)純）；蒸餾水。氯化鈉溶液，2.0 g/100 ml （3.0 g/100 ml），稱取2.0 g （3.0 g）氯化鈉 溶于100ml蒸餾水中，置于2-5C 冰箱備用。氯化汞母液，2 000 mg/L，萬(wàn)分之一分析天平精稱密封保存良好的無(wú)結(jié)晶 水氯化汞0.1000 g于50 ml容量瓶中，用3.0 g/100ml氯化鈉溶液稀釋至刻 度，置于2-5C 冰箱備用，保存期6個(gè)月。氯化汞工作液，2

17、.0 mg/L，用移液管吸取氯化汞母液10 ml入1000 ml容 量瓶，用3.0g/100ml氯化鈉溶液定容。再用移液管吸取氯化汞20 mg/L液25 ml入250 ml容量瓶，用3.0 g/100 ml氯化鈉溶液定容，將此液倒入配有半微量 滴定管的試液瓶，然后，用3.0 g/100 ml氯化鈉溶液將氯化汞2.0 mg/L溶液 按表1稀釋成系列濃度（稀釋至50 ml容量瓶中）。配制的稀釋液保存期不超過24小時(shí)。胞（凍干粉）密度不低于每克800萬(wàn)個(gè)細(xì)胞；凍干粉復(fù)蘇2 min后即發(fā)光，可在 暗室內(nèi)檢驗(yàn)，肉眼可見微光，稀釋成工作液后，經(jīng)稀釋平板法測(cè)定，每毫升菌 液不低于1.6萬(wàn)個(gè)細(xì)胞（5毫升測(cè)試管

18、）或2萬(wàn)個(gè)細(xì)胞（2毫升測(cè)試管）。 在DXY-2型毒性測(cè)試儀上測(cè)出的初始發(fā)光量應(yīng)在600-1900 mV之間，低于600 mV允許將 倍率調(diào)至“X2檔，高于1900 mV允許將倍率調(diào)至“X0.5”檔。仍達(dá)不到標(biāo)準(zhǔn) 者，更換凍干粉。發(fā)光細(xì)菌的毒性實(shí)驗(yàn)在美國(guó)Maxwell（MSI.）LuminMax-C冷 光儀完成。發(fā)光細(xì)菌的復(fù)蘇：從冰箱內(nèi)取出含有0.5 g發(fā)光細(xì)菌凍干粉和氯化鈉溶液， 置于含有冰塊的小號(hào)保溫瓶，用1 ml注射器吸取0.5 ml冷的氯化鈉2.0 g/100 ml溶液（適用于5ml的測(cè)試管）或1 ml冷的氯化鈉2.5%溶液（適用于2 ml的 測(cè)試管）注入凍干粉中，充分混勻。2 min后

19、菌即復(fù)蘇發(fā)光，可在暗室觀察，肉眼可見微光。備用。發(fā)光細(xì)菌的培養(yǎng)：（1）培養(yǎng)液：酵母浸出汁5.0g，胰蛋白胨5.0g，NaCl 30.0g，NaHPO4.0g，KH2PO4.0g，甘油3.0g，加蒸餾水至1000ml,pH調(diào)至70.5，趁熱分裝于150ml三角瓶中，每瓶約50ml，塞上棉球，用牛皮紙包扎好，經(jīng)115C、20-30min高 壓蒸汽火菌后置于4C 左右冰箱中備用。（2）固體培養(yǎng)基：取上述培養(yǎng)液100ml，加入1.5-2g瓊脂粉，電爐加熱使 溶解至透明，調(diào)節(jié)pH值為70.5，趁熱用漏斗分裝于試管中，每支試管各約10ml，塞上棉球，用牛皮紙包扎好，經(jīng)121C 高壓滅菌20-30min后，

20、取出制成 斜面。(3)斜面菌種培養(yǎng)：將發(fā)光菌凍干粉用0.5ml 3%NaCI溶解，迅速轉(zhuǎn)入50ml培養(yǎng)液中，20C 恒溫培養(yǎng)，每24h后轉(zhuǎn)接一次斜面，將培養(yǎng)好的第三代斜面置4C 冰箱中備用。(4)搖瓶菌液培養(yǎng)：將培養(yǎng)好的第三代新鮮斜面菌種T3接入裝有50ml培 養(yǎng)液的150ml錐形瓶中，接種量不得超過一接種環(huán)，于20C 振蕩(180r/min)培 養(yǎng)12h(即對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期)后備用。(5)工作菌液培養(yǎng)： 吸取一定量剛培養(yǎng)好的搖瓶菌液， 用3%勺NaCl溶液 稀釋并磁力攪拌均勻?？刂茖?duì)照(2.0ml 3%NaCl溶液+0.1ml工作菌液)發(fā)光強(qiáng) 度300mv-900mv3.儀器：生物發(fā)光光度計(jì)，配制

21、2或5 ml測(cè)試管，當(dāng)氯化汞標(biāo)準(zhǔn)液濃度 為0.10 mg/L時(shí)，發(fā)光細(xì)菌的相對(duì)發(fā)光度為50%，其誤差不超過10%。2或5 ml測(cè)試樣品管，具標(biāo)準(zhǔn)磨口塞，為制造比色管的玻璃料制作，由專 業(yè)玻璃儀器廠制造，分別適用于相應(yīng)型號(hào)的生物放光光度計(jì)。注射器(1 ml)、微量注射器(10卩I)、定量加液瓶(5 ml)、吸管(2、10、25 ml)、試劑瓶(100 ml)、量桶(100、500 ml)、棕色容量瓶(50、250、1000 ml)、半微量滴定管(配 磨口試液瓶，全套儀器均為棕色，10 ml)等若干。五、測(cè)定在預(yù)實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，將待測(cè)物配成5-7個(gè)濃度梯度，各取不同濃度梯度溶 液2ml加入具塞磨口比

22、色管中， 取0.2ml工作菌液與各比色管中， 加塞上下振 蕩搖勻， 去塞， 暴露15min,以2ml3%勺NaCl溶液做空白對(duì)照。測(cè)發(fā)光強(qiáng)度。 每個(gè)濃度梯度設(shè)3組平行。六、實(shí)驗(yàn)結(jié)果受試化合物的毒性作用用發(fā)光細(xì)菌的發(fā)光強(qiáng)度相對(duì)抑制率表示。計(jì)算公式 如下：對(duì)腔發(fā)光晉曳-樣品發(fā)光強(qiáng)度對(duì)風(fēng)發(fā)比強(qiáng)哎光強(qiáng)的相對(duì)抑制率與毒物毒性的大小成正比。通常用發(fā)光細(xì)菌光抑制50%的受試化合物濃度來(lái)表征其毒性效應(yīng)(EC50)。將計(jì)算的光相對(duì)抑制率與受試化 合物的濃度進(jìn)行回歸分析，根據(jù)所得回歸方程可求出相應(yīng)的EC值濃度吸光度相對(duì)抑制率相對(duì)抑制率0912227949707925759929231000.05836978913

23、5578969388824910.05030.0992790.0168680.0347520.05030.15648049654304677558659970.30.2897670.3025960.2958650.270840.2897670.3117640973441084191078010.8839890.8734010.8952420.883324 0.8839890.4556261564365782056839 0.9388320.9394540.9392660.937777 0.938832七、注意事項(xiàng)1、實(shí)驗(yàn)前判斷發(fā)光細(xì)菌是否符合測(cè)試要求。2、平行或批處理樣品的處理與測(cè)試應(yīng)注意操作

24、時(shí)間的一致性。八、討論與思考1.測(cè)試結(jié)果誤差的主要來(lái)源？加液時(shí)間差導(dǎo)致各組暴露時(shí)間不同。2.測(cè)試過程中，暴露時(shí)間、溫度以及體系的pH等對(duì)發(fā)光細(xì)菌的發(fā)光特性是否有影響，及影響如何？暴露時(shí)間過長(zhǎng)，溫度過高，pH過酸過堿均會(huì)抑制發(fā)光菌發(fā)光特性3.與藻類生長(zhǎng)抑制實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行比較討論。FH-53B在某濃度范圍對(duì)藻類生長(zhǎng)有促進(jìn)作用，氯化汞只對(duì)發(fā)光菌有抑制作 用。實(shí)驗(yàn)三 小鼠骨髓細(xì)胞微核試驗(yàn)一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康闹饕ㄟ^檢測(cè)哺乳動(dòng)物骨髓細(xì)胞中嗜多染紅細(xì)胞（PCE的微核出現(xiàn)率，間 接反映骨髓細(xì)胞染色體畸變發(fā)生率的高低，從而判斷受試動(dòng)物是否具有致突變 作用。主要用于測(cè)試干擾細(xì)胞有絲分裂的物質(zhì)。二、實(shí)驗(yàn)內(nèi)容1. PCE的涂

25、片制作及觀察；2.計(jì)算PCE的微核發(fā)生率；3.受試化合物毒性的判定。三、實(shí)驗(yàn)原理微核試驗(yàn)是用于染色體損傷和干擾細(xì)胞有絲分裂的化學(xué)毒物的快速檢測(cè)方 法。微核是指存在于細(xì)胞中主核之外的一種顆粒，大小相當(dāng)于細(xì)胞直徑的1/20-1/5，呈圓形或杏仁狀，其染色與細(xì)胞核一致在間期細(xì)胞中可以出現(xiàn)一個(gè) 或多個(gè)。一般認(rèn)為微核是細(xì)胞內(nèi)染色體斷裂或紡錘絲受影響而在細(xì)胞有絲分裂 后期滯留在細(xì)胞核外的遺傳物質(zhì)。 所以微核試驗(yàn)?zāi)軝z測(cè)化學(xué)毒物或物理因素誘 導(dǎo)產(chǎn)生的染色體完整性改變和染色體分離改變這兩種遺傳學(xué)終點(diǎn)。微核可以出現(xiàn)在多種細(xì)胞中，但在有核細(xì)胞中較難與正常核的分葉及核突出物相區(qū)別。 紅細(xì)胞在成熟之前最后一次分離后數(shù)小

26、時(shí)可將主核排出， 而仍保 留微核于PCE細(xì)胞中，因此通常計(jì)數(shù)PCE細(xì)胞中微核。四、實(shí)驗(yàn)儀器和試劑1.儀器手術(shù)刀、手術(shù)剪、無(wú)齒鑷、小型彎止血鉗、干凈紗布，帶橡皮頭吸管、臺(tái) 式離心機(jī)、刻度離心管、晾片架、電吹風(fēng)機(jī)、玻璃染色缸、2ml注射器及針頭、載玻片及推片、定時(shí)鐘、帶油鏡頭顯微鏡細(xì)胞計(jì)數(shù)器。2試劑甲醇（分析純）、甘油（分析純）、小牛血清、生理鹽水、吉姆薩（Giemsa）儲(chǔ)備液、pH6.8的磷酸鹽緩沖液。1Giemsa儲(chǔ)備液的制備取Giemsa染料1g，甘油66ml，甲醇60ml。先將染料置于研缽內(nèi)，加入小 量甘油混合研細(xì)，置60。C水浴2h，取出待冷卻后加入甲醇，混合靜置2周后，過濾于棕色瓶?jī)?nèi)，

27、存放陰涼處。該貯備液存放的時(shí)間越長(zhǎng)，染色效果越好。臨 用時(shí)用Ph6.4的磷酸鹽緩沖液配置為10%勺使用液。2pH6.8的磷酸鹽緩沖液a.甲液1/15mol/L磷酸二氫鉀（KH2PO）稱取9.06g KH2PO4分析純）， 用蒸餾水溶解后定容至1000ml。b.乙液1/15mol/L磷酸氫二鈉（Na2HPC） 稱取9.45g Na2HPO4分析 純）（含2、7和12份結(jié)晶水時(shí)，則分別稱取11.89g、17.87 g和23.88g），用 蒸餾水溶解后定容至1000ml。c. pH6.8的磷酸鹽緩沖液。分別取50.40mL的甲液和49.60mL的乙液，將 兩者混合均勻。3陽(yáng)性對(duì)照物環(huán)磷酰胺或絲裂霉素

28、C五、實(shí)驗(yàn)步驟1.實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及處理1動(dòng)物選擇一般情況下，選擇大鼠或小鼠作為微核實(shí)驗(yàn)的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物。本實(shí)驗(yàn)選擇小鼠。 小鼠體重18-20g。每組小鼠數(shù)量為10只，雌雄各半。2染毒途徑根據(jù)實(shí)驗(yàn)?zāi)康暮褪茉嚮衔锏男再|(zhì)，可選擇經(jīng)口、經(jīng)皮、經(jīng)呼吸道及注射 等染毒方式。原則上微核實(shí)驗(yàn)盡可能采用與人類實(shí)際接觸受試環(huán)境毒物相同的 染毒途徑。3染毒次數(shù)及取樣時(shí)間不同的環(huán)境毒物誘發(fā)微核出現(xiàn)的高峰時(shí)間差異很大。一般采用4次連續(xù)染毒比較方便、合理。最后一次染毒后，經(jīng)過24h，取小鼠骨髓樣品，制作骨髓涂 片。4劑量選擇最高劑量組受試環(huán)境毒物的劑量一般采用該毒物的而最大耐受量。也可根 據(jù)受試化合物的1/2LD50作為最高劑量。在此以下再設(shè)3-5個(gè)劑量組。同時(shí)，還應(yīng)該設(shè)立陽(yáng)性對(duì)照組和陰性對(duì)照組。陽(yáng)性對(duì)照組腹腔注射一次或二次環(huán)磷酰胺(50-100mg)或絲裂霉素C(100mg/kg)。陰性對(duì)照組使用等體積的溶劑。2.骨髓液的制備和涂片最后一次染毒后，經(jīng)過24h,用頸椎脫臼或乙醚麻醉的方法處死動(dòng)物，迅速 取下胸骨，剔去肌肉，剪去每節(jié)骨骺端，用小型彎止血鉗擠出骨髓，點(diǎn)在清潔 載玻片一端事先滴好的一滴小牛血清上，混合均勻后推片。陽(yáng)性及陰性對(duì)照組 按上述方法同時(shí)進(jìn)行處理。3.固定將推好晾干的骨髓涂片放入玻璃染色缸中，用甲醇溶液固定15min,取出晾干。4.染色將固定晾干后的骨髓涂片，用新鮮配制