固相萃取-反相高效液相色譜法測定鮮肉中鹽酸克倫特羅殘留量的條件優(yōu)化

1、固相萃取-反相高效液相色譜法測定鮮肉中鹽酸克倫特羅殘留量的條件優(yōu)化張群,劉燁(湖南省食品測試分析中心,湖南 長沙 410125摘要:本文對固相萃取-反相高效液相色譜法測定鮮肉中的鹽酸克倫特羅的前處理方法和色譜條件進(jìn)行了優(yōu)化。超聲提取時(shí)間從20 min 延長到30 min ,采用固相萃取柱過柱凈化,過柱速度為1d/s 。其色譜條件為V 甲醇:V 0.02mol/l 磷酸二氫鈉(pH6.0=40:60,固定相ODS-C18,柱子4.6 m 150 mm ,流速0.8 mL/min ,檢測波長210 nm 。優(yōu)化試驗(yàn)條件后鹽酸克倫特羅殘留量含量回收率得到較大改善,準(zhǔn)確性高,殘留回收好,重現(xiàn)性佳。關(guān)鍵

2、詞:固相萃取-反相高效液相色譜法;測定;鹽酸克倫特羅中圖分類號:TS207.5;文獻(xiàn)標(biāo)識碼:A ;文章篇號:1673-9078(200903-0337-04Optimization of Detection of Clenbuterol Residue in Rresh Meat by Solid Phase Extraction-HPLC MethodZHANG Qun, LIU Y e(Food test and analysis center of Hunan province, Changsha 410125, China Abstract: In this paper, solid-

3、phase extraction - RP-HPLC was applied for the detection of clenbuterol residue in fresh meat and both the pre-treatment method and chromatographic conditions were optimized. For the pre-treatment of the meat samples, the best ultrasonic extraction time and elution speed of the extracts on solid pha

4、se were 20-30 min and 1d/s, respectively. Then the purified extracts was analyzed by RP-HPLC on a ODS-C18 column (4.6 m 150 mm using 0.02 mol/L of solium dihydrogen phosphate solution (pH6-methanol (40:60 as mobile phase at a flow rate of 0.8mL/min and a UV detector at 210nm. This method for clenbut

5、erol residue detection in fresh meat had high accuracy, residual recovery, and good reproducibility.Key words: solid-phase extraction; RP- HPLC detection; clenbuterol residues鹽酸克倫特羅(clenbuterol, CLB ,化學(xué)名為“2-(叔丁氨基甲基-4-氨基-3,5-二氯苯甲醇鹽酸鹽”,俗稱瘦肉精,為白色的結(jié)晶性粉末,無臭,味略苦,在水中或乙醇中溶解,熔點(diǎn)為172176 。在動物體內(nèi)殘留時(shí)間長,容易蓄積,化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定

6、,一般的烹調(diào)加熱方法不能將豬肉和臟器中殘留的“瘦肉精”毒性破壞, 以致因豬肉和臟器中殘留的鹽酸克倫特羅超量引起的食物中毒屢有發(fā)生17,18,6。目前,國際上已經(jīng)有多種技術(shù)可以對動物組織中鹽酸克倫特羅進(jìn)行較為靈敏的檢測,主要有色譜技術(shù),包括高效液相色譜、氣相色譜、凝膠滲透色譜等;質(zhì)譜與色譜聯(lián)用技術(shù),如氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù),液相質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù);電化學(xué)技術(shù),包括修飾電極技術(shù)、收稿日期:2008-10-06作者簡介:張群(1972-,女,湖南澧縣,副研究員,主要從事農(nóng)產(chǎn)品和食品檢測研究工作生物傳感器技術(shù)、高效毛細(xì)管電泳等;免疫酶技術(shù),主要是酶聯(lián)免疫技術(shù)3,5,7,16,20。目前,有關(guān)鹽酸克倫特羅殘留檢

7、測的國標(biāo)方法有3種,分別為酶聯(lián)免疫法(ELISA ,高效液相色譜法(HPLC 1,2,4,814和氣質(zhì)聯(lián)機(jī)法(GC-MS 19。在日常中普遍存在殘留含量回收率不高的問題,影響檢驗(yàn)含量15。為此,筆者通過對動物性食品中克倫特羅殘留量的測定GB/T 5009.192-2003運(yùn)用固相萃取反相高效液相色譜法測定鮮肉中鹽酸克倫特羅的殘留量的前處理?xiàng)l件與色譜條件進(jìn)行優(yōu)化。 1 材料與方法1.1 儀器與試劑LC-20A T, PDA 檢測器, Shimpack ODS-C18柱(0.46 m 150 mm,Mollecular 純水機(jī),AutoScience 超聲儀,離心機(jī),標(biāo)準(zhǔn)試劑(北京國家標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)研究

8、337 稱取搗碎的鮮肉10 g (精確到0.01 g 于研缽中,加0.1 moL/L 高氯酸20mL ,研磨至肉中蛋白質(zhì)變性,溶液變混濁,然后置于磨口玻璃離心管中,超聲處理30 min ,取出置于80 水浴中加熱30 min ,取出冷卻后4500 r/min 離心15 min ,傾出上清液,沉淀用5 mL 0.1 mol/L 高氯酸溶液洗滌,再離心,將兩次的上清液合并。用1 mol/L NaOH 溶液調(diào)節(jié)pH 值至9.50.1,若有沉淀產(chǎn)生,再4500 r/min 下離心10 min ,將上清液轉(zhuǎn)移到磨口玻璃管中,加入8 g NaCl ,混勻,加入25mL 異丙醇-乙酸乙酯混合液(V 異丙醇:

9、V 乙酸乙酯=40:60,置于震蕩器上震蕩提取20 min 。提取完畢,放置5 min 。用吸管小心將上層有機(jī)相移至旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)瓶中,用20mL 異丙醇-乙酸乙酯混合液(V 異丙醇:V 乙酸乙酯=40:60,再重復(fù)萃取1次,合并有機(jī)相,于60 在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器上濃縮至近干。用1 mL 0.1 mol/L 磷酸二氫鈉緩沖液(pH 6.0充分溶解殘留物,經(jīng)針筒式微孔過濾膜過濾,洗滌三次后完全轉(zhuǎn)移至5 mL 玻璃離心管中,并用0.1 mol/L 磷酸二氫鈉緩沖液(pH 6.0定容至刻度。 Cleanert PC 60mg/3mL (P/N:PC 0603,Agela Technologies (a.活化:2

10、 mL 甲醇,2 mL 水,2 mL 30 mM HCl ; (b.上樣:20 mM 的乙酸胺溶液; (c.淋洗:水,甲醇; (d.洗脫:4%氨化甲醇。色譜條件:色譜柱 Shimpack ODS-C18,0.46 m 150 mm流動相:0.02 mol/L 磷酸二氫鈉緩沖液(pH6.0-甲醇(V /V =40/60,流速0.8 mL/min ,進(jìn)樣量10 L ,二極管陣列檢測器,檢測波長210 nm, 利用峰面積進(jìn)行多點(diǎn)標(biāo)準(zhǔn)法定量。 2 結(jié)果與討論2.1 檢測波長的選擇取適當(dāng)濃度的鹽酸克倫特羅標(biāo)準(zhǔn)溶液,在日本島津SPD-M20A 二極管陣列紫外可見分光光度計(jì)于190400 nm 處對所檢測的

11、物質(zhì)進(jìn)行波長掃描,鹽酸克倫特羅標(biāo)準(zhǔn)品的掃描特征吸收光譜在210、241和269nm 有3個(gè)峰值依次變低的吸收峰。見圖1所示?？紤]方法的靈敏度,線性范圍和光譜干擾等因素,因此確定檢測波長為210 nm 。 2.2 提取時(shí)間將提取時(shí)間延長,用研缽處理,搗碎,超聲時(shí)間從20 min 到30 min ,高氯酸將肉中的鹽酸克倫特羅鹽徹底溶出。 圖1 鹽酸克倫特羅標(biāo)樣的光譜圖Fig.1 Spectrophotometry of clenbuterol standard2.3 pH 值的準(zhǔn)確調(diào)節(jié)將分離出來的鹽酸克倫特羅用1 mol/L NaOH 轉(zhuǎn)化成克倫特羅進(jìn)入有機(jī)相提純時(shí),pH 值定位要非常準(zhǔn)確,即調(diào)節(jié)

12、pH 值至9.50.1。pH 值低時(shí)鹽酸克倫特羅轉(zhuǎn)化成克倫特羅的反應(yīng)不夠徹底;pH 值高時(shí)會將不溶于有機(jī)相的其他雜質(zhì)轉(zhuǎn)化成為溶于有機(jī)相的物質(zhì),從而極大干擾有機(jī)相的提純。有機(jī)相比例和流動相pH 值對保留時(shí)間和檢測靈敏度均有較大的影響。pH 值偏大會造成峰拖尾,pH 值太小又會影響柱壽命。按照GB/T 5009中測定克倫特羅中流動相采用水-甲醇(V /V =55/45,結(jié)果沒有標(biāo)樣峰?？紤]到鹽酸克倫特羅是鹽,不能在非極性柱上保留,隨著水一起被帶走,沒有峰出現(xiàn),將流動相中水相改為緩沖鹽,用0.02 mol/L 磷酸二氫鈉(pH6.0。采用三種有機(jī)相比例30%,40%,50%進(jìn)行試驗(yàn),選取流動相合適的

13、比例。甲醇-緩沖鹽的體積比為30/70時(shí)沒有樣品峰;調(diào)整流動相比例,調(diào)整到40/60出了兩個(gè)峰,但需要進(jìn)行樣品峰的確認(rèn)。當(dāng)進(jìn)樣量為10 L, 保留時(shí)間Rt 為5.574 min ,峰面積A 為17896;進(jìn)樣量為20 L 時(shí), 保留時(shí)間Rt 為5.574 min ,峰面積A 為35539,可見進(jìn)樣量增大1倍,保留時(shí)間Rt 為5.574 min 的峰面積增大將近1倍,可見保留時(shí)間Rt 為5.574 min 的峰就是鹽酸克倫特羅的峰;當(dāng)比例調(diào)整到50/50338時(shí),峰出現(xiàn)拖尾,出峰時(shí)間不太合適。結(jié)果表明:有機(jī)相體積分?jǐn)?shù)為40%時(shí),標(biāo)樣峰和溶劑峰能夠很好分開、鹽酸克倫特羅出峰時(shí)間、峰形令人滿意。 3

14、39流動相比例與流速的優(yōu)化調(diào)節(jié)對試驗(yàn)分離影響極大,適宜的流動相比例和恰當(dāng)?shù)牧魉倌軌蚝芎玫貙㈦s質(zhì)峰與鹽酸克倫特羅峰完全分離出來。當(dāng)流動相甲醇-0.02 mol/L 磷酸二氫鈉(pH6.0的體積比為40/60,流速為0.8 mL/min ,雜質(zhì)峰與鹽酸克倫特羅完全分離,保留值也最適宜,不受雜質(zhì)和溶劑等干擾。流動相的流速選擇實(shí)驗(yàn)表明,當(dāng)流速為 1.0 mL/min 時(shí),出峰快,但分離不好;流速為0.8 mL/min固相萃取是近年來用得較廣泛的樣品前處理技術(shù),它具有操作簡單,試劑用量少等特點(diǎn),能有效的對樣品進(jìn)行分離、凈化和濃縮,故本文采用C18固相萃取小柱,避免了液-液萃取或水浴濃縮的繁瑣,同時(shí)也降低

15、了蛋白質(zhì)等雜質(zhì)的干擾。C18小柱先用甲醇、水活化,使填料能充分溶脹,濕潤,便于待測物質(zhì)的吸附。然后上樣,加樣時(shí)流速也直接影響回收率,提取液過柱速度一定要控制準(zhǔn)確。速度過快提取凈化就不夠完全,弱陽離子交換柱上還會殘留鹽酸克倫特羅;速度過慢,雜質(zhì)大分子陽離子會被洗下來造成雜質(zhì)過多。加樣太快會導(dǎo)致待測定物質(zhì)的流失,在本實(shí)驗(yàn)中控制1 d/s 的流速。 3 結(jié)果與討論3.1 線性范圍及檢測限配置一系列不同稀釋度的系列標(biāo)準(zhǔn)溶液,在擬定的色譜條件下進(jìn)樣測定,以含量C (g/mL 為橫坐標(biāo),峰面積A 為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,結(jié)果表明線性良好,回歸方程,相關(guān)性和檢測限,檢測限以信號為3倍噪聲為準(zhǔn)。具體方程及檢測限

16、,見表1。表1 標(biāo)準(zhǔn)曲線和檢測限Table 1 Calibration curve of clenbuterol content and the detection limit化合物 回歸方程濃度范圍/(g/mL相關(guān)系數(shù)(R檢測限/(g/mL鹽酸克倫特羅標(biāo)準(zhǔn)曲線Y=ax+b, a=6.041415e-007, b= -9.530763e-0040.01-1.0 0.9989122 0.01 表2 鹽酸克倫特羅樣品加標(biāo)回收率及精密度 注:表1所有實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)是三次重復(fù)實(shí)驗(yàn)的平均值。Table 2 Recovery rate and precision of the method本底值/(g/mL加標(biāo)

17、量/g測定均值 /(g/mL回收率/%日內(nèi)RSD (%, n=61 0 0. 1 0.075 75 1.52 0 0. 5 0.402 80.4 1.83 0 1 0.825 82.5 1.4 圖2 標(biāo)樣圖譜注:表2所有實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)是三次重復(fù)實(shí)驗(yàn)的平均值。Fig.2 HPLC chromatogram of the clenbuterol standard3.2 方法的精密度和回收率標(biāo)樣圖譜及樣品圖譜見圖2圖3。加標(biāo)回收率和精密度見表2。結(jié)果表明:優(yōu)化試驗(yàn)條件后鹽酸克倫特羅殘留量含量回收率得到較大改善,準(zhǔn)確性高,殘留回收好,重現(xiàn)性佳。 圖3 加標(biāo)樣品圖譜4 小結(jié)Fig.3 HPLC chromat

18、ogram of the sample added withclenbuterol standard本方法與國標(biāo)相比,對測定鮮肉中鹽酸克倫特羅殘留量的優(yōu)化條件為:超聲提取時(shí)間由20 min 延長到30 min ,采用固相萃取柱過柱凈化,采用0.02 mol/L 磷酸二氫鈉(pH6.0緩沖鹽代替純水作流動相,采用V/V(甲醇/磷酸二氫鈉比例為(40/60,樣品流速為0.8 mL/min,凈化過柱速度1 d/s 。 參考文獻(xiàn)1 蔡玉枝,羅曉燕,蘇文周. 高效液相色譜法測定豬組織中鹽酸克倫特羅殘留量J.中國衛(wèi)生檢驗(yàn)雜志,2002,4(12: 193-1942 戴華,袁智能,黃志強(qiáng)等.飼料中鹽酸克倫特

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