2010CB945300-胸腺與免疫細胞發(fā)育的分子調(diào)控_修正版

1、修正版項目名稱:胸腺與免疫細胞發(fā)育的分子調(diào)控首席科學(xué)家:趙勇中國科學(xué)院動物研究所起止年限:2010年1月-2014年8月依托部門:中國科學(xué)院、研究內(nèi)容本項目將緊緊抓住“免疫器官及細胞發(fā)育分化” 主題，重點圍繞上述三個基 本科學(xué)問題，應(yīng)用各種遺傳修飾的模式動物（斑馬魚、小鼠、果蠅等）及發(fā)育生物學(xué)、進化基因組學(xué)、分子細胞生物學(xué)等理論和技術(shù)手段，分以下4個課題深入 開展研究：課題1主要應(yīng)用斑馬魚、小鼠模型，研究胸腺（胸腺上皮細胞及胸腺 細胞）發(fā)育及衰老的關(guān)鍵分子機制，闡明胸腺上皮細胞與胸腺細胞相互作用的調(diào)控規(guī)律；課題2首先應(yīng)用斑馬魚報告系統(tǒng)獲得對造血干細胞發(fā)生、維持和向淋巴 系發(fā)育的重要分子，然后應(yīng)

2、用小鼠模型，深入研究其對干細胞向淋巴細胞發(fā)育調(diào) 控的分子機制；課題3主要應(yīng)用果蠅、小鼠及體外免疫細胞誘導(dǎo)體系， 研究免疫 細胞向各亞群定向發(fā)育分化的調(diào)控機制；課題 4主要應(yīng)用進化/比較基因組學(xué)方 法來研究與發(fā)現(xiàn)免疫系統(tǒng)發(fā)育相關(guān)的關(guān)鍵分子，并利用課題1-3提供的技術(shù)平臺 與體系，進行驗證和深入研究。本項目4個課題各有側(cè)重，進行深入研究，又相 互關(guān)聯(lián)與促進；作為一個研究整體，來闡明胸腺及造血干細胞向成熟免疫細胞發(fā) 育的調(diào)控規(guī)律及發(fā)生機制。二、預(yù)期目標應(yīng)用多種遺傳修飾和基因突變模式動物（斑馬魚、小鼠、果蠅等）及進化基 因組學(xué)、免疫學(xué)、分子細胞生物學(xué)、生化等方面技術(shù)手段，重點研究免疫器官胸 腺及免疫細

3、胞發(fā)育、分化和衰老過程中的重要調(diào)控因子及調(diào)控機理。 通過本項目 的實驗研究，解析免疫系統(tǒng)（特別是胸腺及其相關(guān)細胞）發(fā)育、分化與功能發(fā)揮 的關(guān)鍵分子調(diào)控線路，揭示免疫系統(tǒng)發(fā)育、分化與功能異常與人類健康的關(guān)系。獲得一批免疫系統(tǒng)進化、發(fā)育、功能相關(guān)重要基因和相關(guān)蛋白質(zhì)，闡明一些關(guān)鍵 分子的功能，為開發(fā)擁有自主知識產(chǎn)權(quán)的新型免疫制劑、 免疫相關(guān)疾病診斷與防 治提供重要理論依據(jù)。在理論上有自己獨到的創(chuàng)新性見解， 在技術(shù)上建立一系列研究免疫發(fā)育生物學(xué)基礎(chǔ)理論的現(xiàn)代生物技術(shù)平臺和先進技術(shù)體系。形成一支具 有國際影響和競爭力的研究團隊，培養(yǎng)一批從事相關(guān)科學(xué)研究的中青年學(xué)術(shù)帶頭 人與后備力量。五年預(yù)期目標：本項

4、目將建立多種遺傳修飾的斑馬魚和小鼠、移植動物模型、體外免疫細胞 發(fā)育分化誘導(dǎo)系統(tǒng)、果蠅天然免疫應(yīng)答遺傳篩選系統(tǒng)、免疫系統(tǒng)進化發(fā)育生物學(xué) 數(shù)據(jù)庫等技術(shù)平臺，形成一個先進而完整的免疫發(fā)育生物學(xué)研究體系。揭示胸腺 發(fā)育與衰老、造血干細胞形成及其向免疫前體細胞發(fā)育分化、 免疫細胞定向發(fā)育分化的幾個重要分子調(diào)控路線，獲得一批重要的免疫發(fā)育相關(guān)的新基因/蛋白質(zhì) 及細胞亞型，并對其功能和調(diào)節(jié)機理進行系統(tǒng)研究， 形成重要學(xué)術(shù)假說。力爭在 理論上有突破，在技術(shù)上有創(chuàng)新。具體指標如下:1. 建立一個先進的免疫發(fā)育生物學(xué)研究體系與技術(shù)平臺，包括多種用于研究 免疫系統(tǒng)發(fā)育的遺傳修飾和基因突變的果蠅、斑馬魚和小鼠，實驗

5、方法，技 術(shù)手段等。2. 闡明調(diào)控胸腺上皮細胞干細胞向胸腺上皮細胞發(fā)育分化及胸腺上皮細胞與 胸腺細胞發(fā)育分化中相互作用的2-3個重要路線。3. 篩選一批參與胸腺和造血干細胞發(fā)育、分化、衰老與功能調(diào)控的重要基因, 并對其中5-6個關(guān)鍵基因進行調(diào)控機理研究，為發(fā)展新的免疫藥物靶分子和 防治免疫相關(guān)疾病提供新思路。4. 解析免疫細胞不同亞群發(fā)育分化的1-2個主要分子通路，為有效調(diào)控免疫 應(yīng)答提供重要依據(jù)。5.在國際主流學(xué)術(shù)雜志上發(fā)表論文80-90篇，其中IF>10的論文12-16篇; 申請國家/國外發(fā)明專利5-10項。6.培養(yǎng)博士后15-20名，博士、碩士研究生120名左右。三、研究方案1）學(xué)

6、術(shù)思路:免疫系統(tǒng)發(fā)育與免疫應(yīng)答是一個極為復(fù)雜的生命過程之一。根據(jù)目前國際發(fā) 展趨勢和國內(nèi)現(xiàn)有研究基礎(chǔ)，本項目的總體思路是：應(yīng)用發(fā)育生物學(xué)、進化基因 組學(xué)、蛋白質(zhì)組學(xué)、系統(tǒng)生物學(xué)以及其他最新的理論與技術(shù)， 憑借各種模式動物 等研究手段與平臺，以重要免疫器官胸腺及免疫細胞發(fā)育為核心， 主要深入探討胸腺上皮細胞干細胞向胸腺上皮細胞發(fā)育分化的重要調(diào)控通路，胸腺上皮細胞與 胸腺細胞發(fā)育中相互作用主要機理。 同時，圍繞胸腺這一免疫器官，我們將進行淋巴細胞前體細胞及免疫細胞亞群發(fā)育調(diào)控的實驗研究，從而系統(tǒng)理解免疫細胞 發(fā)育的整個過程?？傊?，本項目將在基因進化和功能研究的基礎(chǔ)上， 通過研究基 因及蛋白質(zhì)在分子

7、、細胞和整體水平上的相互作用，揭示正常與異常免疫系統(tǒng)發(fā)育過程的調(diào)控機理。具體課題設(shè)置見下圖（圖 1）。發(fā)育相關(guān)的重要基E蛋白質(zhì)課題4:應(yīng)用進化比較基因組學(xué)方法研 究免疫系統(tǒng)發(fā)育關(guān)鍵分子回答科學(xué)問題：胸腺與免疫細胞發(fā)育的重要分子調(diào)控機制? 意義：為免疫相關(guān)疾病的防治提供重要理論與技術(shù)基礎(chǔ)。圖1.胸腺與免疫細胞發(fā)育的分子調(diào)控研究課題設(shè)置主要科研流程見下圖（圖2）?；締栴}：免疫系統(tǒng)發(fā)育的關(guān)鍵因素與調(diào)控機制未知免疫系統(tǒng)發(fā)育關(guān)鍵分子已知免疫系統(tǒng)發(fā)育重 要基因/蛋白質(zhì)課題1-3課題4課題1-4*遺傳修飾和突變果蠅、!斑馬魚研究系統(tǒng)比較基因I組學(xué)手段確定免疫系統(tǒng)發(fā)育重要基因干細胞胸腺-免疫細胞-亞群發(fā)育（

8、上皮細胞、胸腺細胞）課題1-41 ；J十亠*分子生物"遺傳修飾體外誘X分子生物;,生物化沢比較基% '、的小鼠等，芒體系;學(xué)手段_二學(xué)手段？因組學(xué)/闡明5-6個免疫系統(tǒng)發(fā)育相關(guān)重要基因調(diào)控線路干細胞-胸腺-免疫細胞-亞群發(fā)育 （上皮細胞、胸腺細胞）回答科學(xué)問題疾病發(fā)生、發(fā)展機制建立免疫系統(tǒng)發(fā)育研究平臺圖2.主要實驗流程框架2）技術(shù)途徑:本項目執(zhí)行將主要依據(jù)已建立和將要建立的模式動物、體外細胞和組織培養(yǎng)模型，通過下述方法或途徑分別在幾個層次上闡明免疫器官（胸腺）和免疫細胞發(fā)生、分化成熟的分子機理。1.基因水平的研究：應(yīng)用 Northern blot 、原位雜交、real-tim

9、e PCR、CHIP、RNA干擾和過表達、基因報告系統(tǒng)等技術(shù)，檢測基因在所研究細胞和組織中 的轉(zhuǎn)錄表達、定位及調(diào)控。2. 蛋白質(zhì)水平的研究：利用雙向電泳、酵母雙雜交、免疫共沉淀以及快速定點突變和結(jié)構(gòu)生物學(xué)技術(shù)研究蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系以及蛋白-蛋白相互作 用的分子機制。3. 細胞與組織水平的研究：利用建立的各種細胞和組織培養(yǎng)體系和流式細胞儀、 激光共聚焦顯微鏡、顯微注射等技術(shù)，深入研究基因 /蛋白質(zhì)的功能及調(diào)控網(wǎng) 絡(luò)。4. 整體水平的研究：涉及的多種模式動物包括果蠅、斑馬魚、小鼠。通過基因誘變、轉(zhuǎn)基因動物、基因敲除及轉(zhuǎn)基因干細胞移植等技術(shù)建立實驗?zāi)Ｐ?，觀察靶 基因的功能。5. 免疫分子的進化生

10、物學(xué)研究：該研究主要用于篩選人類及相關(guān)模式動物的胸 腺及免疫細胞發(fā)育分化相關(guān)的基因和基因家族，研究其進化起源和功能分化的歷 史和動力學(xué)過程。3）創(chuàng)新點與特色:立題新穎、前沿:項目十分重視基礎(chǔ)理論中的源頭創(chuàng)新， 對具有應(yīng)用潛能的研究 將有自主知識產(chǎn)權(quán)；以發(fā)育生物學(xué)的獨特視角，研究免疫系統(tǒng)特別是胸腺相關(guān)細 胞發(fā)育的重要調(diào)控分子基礎(chǔ)，闡明免疫系統(tǒng)發(fā)育分化的重要機制及相關(guān)疾病的發(fā) 病機理，處于當(dāng)代生命科學(xué)研究前沿，具體研究內(nèi)容國內(nèi)外均未見詳細的報道。實驗?zāi)Ｐ图把芯渴侄蜗冗M：選用的多種研究動物模型,包括條件性或細胞特異性 基因敲除和基因報告技術(shù)如（Aire, FoxN1, MAVS, MyD88, P

11、TEN, TLRs 等）基 因缺失小鼠，scl:GFP、rag1:GFP、FoxN1:GFP轉(zhuǎn)基因斑馬魚等，著重在體內(nèi)研應(yīng)用究重要調(diào)控基因在胸腺發(fā)育、胸腺上皮細胞和淋巴細胞互作中的分子機理。進化基因組學(xué)及生物信息學(xué)預(yù)測及分析相關(guān)重要基因及蛋白功能域。實驗技術(shù)及 分析手段有特色。學(xué)科交叉與優(yōu)勢團隊：研究團隊由不同研究特色和學(xué)科研究人員（發(fā)育、免疫、 進化等）組成，學(xué)科之間交叉明顯。同一位研究骨干可參與2個或多個課題研究 內(nèi)容，各研究組之間將進行密切科研合作， 共享實驗技術(shù)平臺和實驗?zāi)Ｐ?，將團 隊優(yōu)勢挖掘出來，此為本項目的組織特色。4）可行性分析:本研究團隊集結(jié)了國內(nèi)在“分子-細胞-組織-動物模型

12、”各層次以及免疫學(xué)、 細胞分子生物學(xué)及發(fā)育生物學(xué)等相關(guān)領(lǐng)域中具有較好積累和特色實力的研究人 員。參與本項目的學(xué)術(shù)骨干在 Immunity. Nature Medicine, Proc Natl Acad Sci USAJ Exp Med, Current Biology, Blood, Trends Microbiol, FASEB J, J of Immunology.Hep atology, J of Biological Chemistry, Genome Research, Nucleic Acids Research,Circulati on Research, Mecha ni s

13、ms of Develo pment等國際主流學(xué)術(shù)雜志上發(fā)表SCI論文200余篇。參與本項目的科學(xué)家一直活躍在本領(lǐng)域的科研前沿及積累了 大量前期工作的基礎(chǔ)（請見工作基礎(chǔ)部分）。我們相信，通過學(xué)科交叉、優(yōu)勢互 補、平臺共享、協(xié)力攻關(guān)，在以下幾方面取得重大進展是可行的。1）通過FoxN1:GFP轉(zhuǎn)基因斑馬魚報告系統(tǒng)及實驗室已建立的其它研究體系，在 發(fā)現(xiàn)重要調(diào)控胸腺上皮細胞干細胞和其發(fā)育的基因及理解其發(fā)育機制方面取得 突破的可能性大。2）利用業(yè)已建立的髓質(zhì)區(qū)T細胞發(fā)育研究體系，探索Aire對胸腺上皮細胞功能 的影響，并揭示Aire缺陷導(dǎo)致胸腺細胞發(fā)育異常的機理和病理生理意義。工作 基礎(chǔ)堅實、推論合理

14、、研究方案切實可行，取得突破的可能性大。scl:GFP、3）項目所需關(guān)鍵造血干細胞及淋巴細胞轉(zhuǎn)基因斑馬魚報告系（ rag1:GFP）已制備并獲得一些初步結(jié)果。因此，在確定造血干細胞發(fā)生及向淋巴 細胞系發(fā)育中重要調(diào)控基因方面取得重大突破的可能性大。4）通過酵母雙雜交和RNAi技術(shù)，已發(fā)現(xiàn)一些參與免疫細胞活化的重要因子，因 此在探討天然免疫細胞成熟及功能分化方面取得突破性進展的可能性大。5）運用進化基因組學(xué)分子手段發(fā)現(xiàn)新基因功能，以結(jié)構(gòu)和功能進化為導(dǎo)向確立 免疫系統(tǒng)發(fā)育關(guān)鍵蛋白/多肽的功能表位方面取得重要進展的可能性大，獲得免 疫發(fā)育相關(guān)藥物先導(dǎo)的可能性大。四、年度計劃研究內(nèi)容1）建立FoxNI:

15、 GFP或 Rag1:GFP綠色熒光轉(zhuǎn)基因斑馬魚報告系統(tǒng)；應(yīng)用此系統(tǒng)初步篩選對胸腺發(fā)育起重要作用的部分基因。2）應(yīng)用生物工程技術(shù)改造小鼠、移植動物模型及細胞分子生物學(xué)研究手段，研究候選基因（如 EP2/4）、Smads FoxNI 通路、AIRE等在胸腺上皮細胞干細胞及胸腺上皮細胞發(fā)育的作用及初步調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。3）通過基因芯片等分子生化技術(shù)，初步篩選FoxN1在胸腺上皮細胞中作用的下游基因/靶基因譜。4）初步確定Aire對胸腺髓質(zhì)上皮細胞分化和功能的影響并確定其分子機制。5）證實端粒DNA相關(guān)蛋白P28在胸腺及免疫細胞衰老過程中的作用及其與端粒動力學(xué)相關(guān)性。6）建立胸腺上皮細胞及其干細胞分離、鑒定

16、及定量分析的方法技術(shù)。7）利用已有的不同基因缺陷小鼠（Smad3P TEN,IL-2R, MAVSMyD88,TLRs 等易 9除小鼠）及疾病模型（感染、移植、肝炎等），初步研究T細胞亞群（Th17、調(diào)節(jié)性T細胞等）分化的重要調(diào)節(jié)分子及其機制。預(yù)期目標初步確定Aire對胸腺髓質(zhì)上皮細胞分化和功能的影響并確定其分子機制。初步篩選FoxNI在胸腺上皮細胞中作用的下游基因/靶基因譜。證實端粒DNA相關(guān)蛋白P28在胸腺及免疫細胞衰老過程中的作用初步研究免疫細胞亞群（特別是Th17、調(diào)節(jié)性T細胞等）分化的重要調(diào)節(jié)分子。確立三種模式動物免疫發(fā)育相關(guān)的候選基因，并完成相關(guān)的進化研究。完成ETS轉(zhuǎn)錄因子Fev

17、,Ets2, Gab pa, Elf2,和,Elk4在野生型和三種不同血細胞突變體斑馬魚（cloche, spadetail 和etsrp ）胚胎發(fā)育不同時期中的時空表達圖譜。8） 培 育 出 IL-2Ra-/-IL-17A-/- 和 IL-2R&TL-17F-/-的小鼠。在主流雜志上發(fā)表論文至少9）運用人的cDNA和RNAi文庫，通過人的研究內(nèi)容預(yù)期目標IFN- P啟動子基因報告系統(tǒng)篩選參與天然免疫細胞分化和應(yīng)答的重要調(diào)控因子。10）參與果蠅天然免疫調(diào)控相關(guān)新基因的遺傳和生化篩選。11)完成 ETS 轉(zhuǎn)錄因子 Fev, Ets2, Gab pa.Elf2,和Elk4在野生型和三種不同

18、血細胞突變體斑馬魚(cloche , spadetail和 etsrp )胚胎發(fā)育不同時期中的時空表達圖譜。12）構(gòu)建新ETS轉(zhuǎn)錄因子相應(yīng)的PCS2+表達載體；設(shè)計并開展相關(guān)基因的反義寡聚核苷酸 Morpholinos 實驗。13）開展小規(guī)模的ENU化學(xué)誘變，初步篩選批影響胸腺和T細胞發(fā)生的突變體。14）進行相關(guān)基因進化分析。確立三種模式動物免疫發(fā)育相關(guān)的候選基因，并完成相關(guān)的進化研究。建立和完善本課題相關(guān)的各種技術(shù)平臺。1）進一步憑借 FoxN1: GFP或 Rag1:GFP綠色熒光轉(zhuǎn)基因斑馬魚報告系篩選對胸腺發(fā)育發(fā)育起重要作用的部分基因。2）應(yīng)用生物工程技術(shù)改造小鼠、移植動物模型及細胞分子

19、生物學(xué)研究手段，較深入研究候選基因（如EP2/4）、AIRE及FoxN1通路等在胸腺上皮細胞干細胞及胸腺上皮細胞發(fā)育、衰老的作用及調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。3）確定Aire對胸腺髓質(zhì)上皮細胞分化和功能的影響并確定其分子機制。獲得一批對造血、胸腺、免疫細胞發(fā)育有影響的基因。初步構(gòu)建較系統(tǒng)的造血干細胞基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)模式圖。分析端粒DNA相關(guān)蛋白P28在胸腺及免疫細胞衰老過程中與端粒動力學(xué)相關(guān)性。獲得相關(guān)基因進化表位的基礎(chǔ)數(shù)據(jù)，得到初步結(jié)論。在主流雜志上發(fā)表論文至少研究內(nèi)容4）系統(tǒng)分析端粒DNA相關(guān)蛋白P28在胸腺及免疫細胞衰老過程中的生物作用及其與端粒動力學(xué)相關(guān)性。5）進一步利用不同基因缺陷小鼠，研究這些基因在T細

20、胞亞群（Th17、調(diào)節(jié)性T細胞等）分化的可能作用及其調(diào)控機制。6）對候選基因進行初步的功能分析。7）利用MAVS MyD88單基因和雙基因剔除小鼠，初步探討RLRs和TLRs途徑在免疫細胞發(fā)育中的作用以及它們的協(xié)同作用機制。8）開展功能缺失和過量表達實驗，確定 ETS轉(zhuǎn)錄因子在造血干細胞發(fā)育分化及遷移中的作用；并闡明其與其它相關(guān)主控基因的上位關(guān)系。9）完成中小規(guī)模的ENU化學(xué)誘變，確定一批影響胸腺和T細胞發(fā)育的重要斑馬魚突變體。10）預(yù)測重要相關(guān)蛋白的進化表位；基因克隆，表達載體構(gòu)建和重組蛋白的生產(chǎn)方案的優(yōu)化。11）獲得進化表位的基礎(chǔ)數(shù)據(jù)?？寺∠嚓P(guān)的基因并選擇不同的表達載體優(yōu)化表達和純化方法。

21、1）建立1-2個生物工程技術(shù)改造小鼠，確定1-2個對胸腺上皮細胞及胸腺細胞分化和功能具有重要影響的新功能基因。2）較深入研究幾個候選基因在胸腺上皮細胞10篇。預(yù)期目標確定1-2個對胸腺髓質(zhì)上皮細胞發(fā)育和功能具有重要影響的新功能基因。確定造血干細胞在斑馬魚胚預(yù)期目標干細胞及胸腺上皮細胞發(fā)育的作用及調(diào)控分胎時期的起源、發(fā)育分化和子網(wǎng)絡(luò)。遷移路線。3）完成利用不同基因基因缺陷小鼠，研究這完成構(gòu)建較系統(tǒng)的造血干細些基因在T細胞亞群（Th17、調(diào)節(jié)性T細胞胞基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)模式圖。等）分化的可能作用及其調(diào)控機制。明確1-3個對免疫細胞亞群研究內(nèi)容發(fā)育有重要作用的調(diào)節(jié)通路。亞群，炎性因子的變化及組織病理變化。

22、明確1-3個對免疫細胞亞群5）深入探討RLRs和TLRs兩條途徑在免疫發(fā)育有重要作用的分子表位細胞發(fā)育中的作用以及它們的協(xié)同作用機制特征及進化特點。6）主要利用敲除、干擾或過量表達等方法初在主流雜志上發(fā)表論文至少步分析目的microRNAs在免疫細胞發(fā)育過程15篇。4) 檢測 IL-2Ra-/-IL-17A-/- 和IL-2R a-/-IL-17F-/-雙基因敲除小鼠的細胞中的調(diào)控作用。7）確定造血干細胞在斑馬魚胚胎時期的起 源、發(fā)育分化和遷移路線。8）完成構(gòu)建較系統(tǒng)的造血干細胞基因調(diào)控網(wǎng) 絡(luò)模式圖，并闡明ETS轉(zhuǎn)錄因子在血液發(fā)生、 保持和淋系分化中的分子機制。9）開展定位克隆影響造血干細胞、T淋巴細 胞及胸腺發(fā)育的重要突變體/基因。10）運用反向PCR方法完成丙氨酸突變體重 組表達載體的構(gòu)建，確定相關(guān)蛋白的重要功 能位點。預(yù)期目標1）建立目的基因缺失小鼠，證實1-2個對胸證實1-2個對胸腺發(fā)育具有腺發(fā)育具有重要影響的新功能基因。重要影響的新功能基因。2）較深入研究候選基因在胸腺上皮細胞干細確定目的 micro