《基因工程的基本操作程序》導(dǎo)學(xué)案

1、基因工程的基本操作程序（共2課時(shí)）【學(xué)習(xí)目標(biāo)】1、簡(jiǎn)述基因工程原理及基本操作程序。2、嘗試設(shè)計(jì)某一轉(zhuǎn)基因生物的研制過程?！緦W(xué)習(xí)重點(diǎn)】 基因工程基本操作程序的四個(gè)步驟?！緦W(xué)習(xí)難點(diǎn)】（1）從基因文庫中獲取目的基因。（2）利用PCR技術(shù)擴(kuò)增目的基因。自主研習(xí)（理知識(shí)，固基礎(chǔ)）一、目的基因的獲?。?、目的基因：符合人們需要的，編碼蛋白質(zhì)的。2 .獲取目的基因的方法（1）從基因文庫中獲取目的基因 基因文庫：將含有某種生物不同基因的許多，導(dǎo)人受體菌的群體中，各個(gè)受體菌分別 含有這種生物的不同基因，稱為基因文庫?；蚪M文庫：含有一種生物的基因 種類JL cDNA文庫：含有一種生物的基因 目的基因的獲取mRN

2、A基因的產(chǎn)物蛋根據(jù)基因的有關(guān)信息：基因的序列、基因在上的位置、基因的產(chǎn)物 白質(zhì)等特性獲取目的基因。（2）利用PCR技術(shù)擴(kuò)增目的基因。 PCR:是一項(xiàng)在生物體外特定 DNA片段的核酸合成技術(shù)。已知目的基因的序列。目的基因 DNA受熱形成，與結(jié)合，然后在 條件：的作用下進(jìn)行延伸形成 過程：DNA方式:指數(shù)擴(kuò)增=2n （n為擴(kuò)增循環(huán)的次數(shù)）（3）人工合成法：基因較小，核苷酸序列已知，可以人工合成。二、基因表達(dá)載體的構(gòu)建1、表達(dá)載體的組成：目的基因 +標(biāo)記基因等。mRNA2、啟動(dòng)子：位于基因的，它是結(jié)合的部位，驅(qū)動(dòng)基因轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生3、終止子：位于基因的，終止。4、表達(dá)載體的功能：使目的基因在受體細(xì)胞中穩(wěn)定

3、存在，并且給下一代；使目的基因 和發(fā)揮作用。5、標(biāo)記基因：受體細(xì)胞是否含有目的基因。6、不同的受體細(xì)胞及目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞的方法不同，基因表達(dá)載體的構(gòu)建上也會(huì) 有所差別。三、將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞(一) 轉(zhuǎn)化：目的基因進(jìn)人受體細(xì)胞內(nèi)，并在受體細(xì)胞內(nèi)維持穩(wěn)定和的過程。(二) 方法1、將目的基因?qū)胫参锛?xì)胞(1)農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法農(nóng)桿菌特點(diǎn)：易感染植物和裸子植物，對(duì) _ 轉(zhuǎn)移至受體細(xì)胞，并整合到受體細(xì)胞的染色體上。轉(zhuǎn)化：目的基因插人植物沒有感染力；Ti質(zhì)粒的可進(jìn)入 農(nóng)桿菌7導(dǎo)入植物細(xì)胞7目的基因整合到植物細(xì)胞染色體上7目的基因的遺傳特性得以穩(wěn)定維持和表達(dá)。(2) 基因槍法基因槍法：是單子葉植物中常用的

4、一種基因轉(zhuǎn)化方法，但是成本較高。(3) 花粉管通道法花粉管通道法：這是我國(guó)科學(xué)家獨(dú)創(chuàng)的一種方法，是一種十分簡(jiǎn)便經(jīng)濟(jì)的方法。 的轉(zhuǎn)基因抗蟲棉就是用此種方法獲得的)2 將目的基因?qū)雱?dòng)物細(xì)胞(1) 方法：注射技術(shù)。(2) 操作程序：目的基因表達(dá)載體7取卵(受精卵)(我國(guó)7顯微注射7注射了目的基因的受精卵移植到性動(dòng)物的內(nèi)發(fā)育7新性狀動(dòng)物。3 .將目的基因?qū)宋⑸锛?xì)胞(1) 原核生物特點(diǎn)：繁殖快、多為單細(xì)胞、遺傳物質(zhì)相對(duì)較少等。(2) 轉(zhuǎn)化：處理細(xì)胞7細(xì)胞7表達(dá)載體與感受態(tài)細(xì)胞混合7四、目的基因的檢測(cè)與鑒定細(xì)胞吸收DNA分子。1 .檢測(cè)(1) 方法：標(biāo)記了的、抗原抗體雜交。(2) 內(nèi)容檢測(cè)轉(zhuǎn)基因生物

5、染色體的 DNA是否插入。檢測(cè)目的基因是否轉(zhuǎn)錄。檢測(cè)目的基因是否翻譯成。2 .鑒定：鑒定、抗病鑒定等。DNA重 組黏性末端 平末端DNA片 段核苷酸 尾端T-DNA轉(zhuǎn)基因技術(shù) DNA分子 DNA重組技術(shù) 平末端平末端儲(chǔ)存 單鏈限制性核酸內(nèi)切酶T4 噬菌體 動(dòng)植物病毒 轉(zhuǎn)錄限制酶 黏性末端 結(jié)構(gòu)基因 復(fù)制 聚合酶識(shí)別雙鏈DNA片段互補(bǔ)的黏性末端之間 質(zhì)粒 自我入噬菌體的衍生物核苷酸 染色體啟動(dòng)子鑒別提純“探針”與基因組 DNA雜交自我 所有 部分 引物DNA聚合酶 轉(zhuǎn)錄可以遺傳能夠表達(dá)Ti質(zhì)粒的T-DNA上顯微終止子 首端 表達(dá) 雙子葉 雌輸卵管或子宮(在一定的溫度下促進(jìn))感受態(tài)翻譯RNA大多數(shù)

6、單子葉2+C a 感受態(tài)是否插入了目的基因是否轉(zhuǎn)錄出了 mRNA蛋白質(zhì) 抗蟲鑒定（抗蟲、抗病鑒定屬于個(gè)體生物學(xué)水平鑒定） 互動(dòng)探究（釋疑惑，升能力）基因工程圖解：抗蟲棉的培育過程蘇云金芬抱 桿菊B1 最白 斟因5A（Q）Ti質(zhì)粒構(gòu)建基LM 表達(dá)観休轉(zhuǎn)人衣桿諧桃蟲怖紐事1棉侏細(xì)胞n的城因J色體DNA屮探究一目的基因的獲取問題1:什么是目的基因？目的基因主要是指編碼蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)基因，如抗蟲基因，抗旱基因。問題2:獲取目的基因的途徑有哪些 ？獲取目的基因的常用方法有哪些 獲取方式（途徑）：從已有物種中分離和人工合成獲取目的基因的常用方法：從基因文庫中獲取目的基因 （未知序列）利用PCR技術(shù)擴(kuò)增目的基

7、因（已知序列）.用化學(xué)方法直接人工合成（基因比較小，已知序列）注：1.基因文庫構(gòu)建方法直接分離法某種生物的全部DNA 限制酶反轉(zhuǎn)錄 一定大小的DNA片段 與載體連接DNA聚合酶 導(dǎo)入受體菌中儲(chǔ)存 基因組文庫反轉(zhuǎn)錄法某種生物某時(shí)期的 mRNA單鏈互補(bǔ)DNA+雙鏈cDNA片段連接導(dǎo)入受體菌中儲(chǔ)存cDNA文庫基因文庫中不是直接保管相應(yīng)基因，而是保存受體菌，菌中含基因2. PCR技術(shù)原理：DNA復(fù)制前提：一段已知目的基因的核苷酸序列，以便根據(jù)這一序列合成引物條件：模板DNA（需含有目的基因）、四種脫氧核苷酸（dNTP）、熱穩(wěn)定DNA聚合酶（Taq酶）、一對(duì)引物、溫度控制過程：a、 DNA變性（90C

8、-95 C）:雙鏈DNA模板在熱作用下，氫鍵斷裂，形成單鏈 DNADNA 鏈。b、 退火（復(fù)性55C -65 C）:系統(tǒng)溫度降低，引物與 DNA模板結(jié)合，形成局部雙鏈c、延伸（70C -75C）:在Taq酶的作用下，合成與模板互補(bǔ)的d、重復(fù)a.b.c步驟：每重復(fù)一次，目的基因增加一倍結(jié)果：使目的基因的片段在短時(shí)間內(nèi)成百萬倍地?cái)U(kuò)增3. PCR擴(kuò)增技術(shù)與 DNA復(fù)制的比較PCR技術(shù)DNA復(fù)制相 同 點(diǎn)原理DNA復(fù)制（堿基互補(bǔ)配對(duì)）原料四種游離的脫氧核苷酸條件模板、ATP、酶、原料、引物不 同 點(diǎn)解旋方式DNA在高溫下變性解旋解旋酶催化場(chǎng)所體外復(fù)制（PCR擴(kuò)增儀）主要在細(xì)胞核內(nèi)酶熱穩(wěn)定的DNA聚合酶

9、（Taq酶）細(xì)胞內(nèi)含有的DNA聚合酶結(jié)果在短時(shí)間內(nèi)形成大量的 DNA片段形成整個(gè)DNA分子4.人工合成 .反轉(zhuǎn)錄法：以目的基因轉(zhuǎn)錄成的信使 RNA為模板，反轉(zhuǎn)錄成互補(bǔ)的單鏈DNA （ cDNA ）,然后在酶的作用下合成雙鏈 DNA，從而獲取所需的基因。.根據(jù)已知的氨基酸序列合成 DNA法：根據(jù)已知蛋白質(zhì)的氨基酸序列，推測(cè)出相應(yīng)的信使RNA序列，然后按照堿基互補(bǔ)配對(duì)原則，推測(cè)出它的結(jié)構(gòu)基因的核苷酸序列， 再通過化學(xué)方法，以單核苷酸為原料合成目的基因。 探究二 基因表達(dá)載體的構(gòu)建問題1:為什么要構(gòu)建基因表達(dá)載體？單獨(dú)的DNA片段能不能穩(wěn)定遺傳？構(gòu)建表達(dá)載體的目的：（1 ）使目的基因在受體細(xì)胞中穩(wěn)定

10、存在并可以遺傳給下一代；（2）使目的基因能夠表達(dá)和發(fā)揮作用。 問題2:基因表達(dá)載體的構(gòu)成包括哪些元件？（繪制基因表達(dá)載體的模式圖）基因表達(dá)載體的組成：復(fù)制原點(diǎn)+目的基因+啟動(dòng)子+終止子+標(biāo)記基因 模式圖：*啟請(qǐng)r搞人戛因£出豪達(dá)式n問題3:什么是啟動(dòng)子、終止子？各有什么作用？ 啟動(dòng)子：位于基因的首端的一段特殊的DNA片斷，它是RNA聚合酶識(shí)別和結(jié)合的部位，有了它才能驅(qū)動(dòng)基因轉(zhuǎn)錄出 mRNA，最終獲得蛋白質(zhì)終止子位于基因尾端的一段特殊的 DNA片斷，能終止 mRNA的轉(zhuǎn)錄。問題4:基因工程的運(yùn)載體是否必須要有標(biāo)記基因？黏性末端。用 相同的黏性末端。_DNA連接酶，形一定需要！是為了鑒別

11、受體細(xì)胞中是否含有目的基因，從而將有目的基因的細(xì)胞篩選出 來。（注意!標(biāo)記基因的作用不是目的基因的檢測(cè)和鑒定，而是鑒別和篩選含有目的基因的細(xì) 胞。） 問題5:怎樣才構(gòu)建基因表達(dá)載體 ？（填空 用一定的 限制酶切割質(zhì)粒，使其出現(xiàn)一個(gè)切口，露出同一種限制酶 切斷目的基因，使其產(chǎn)生 將切下的目的基因片段插入質(zhì)粒的 切口處，再加入適量成了一個(gè)重組 DNA分子（重組質(zhì)粒）附圖戟體（質(zhì)粒）D砒介子（肯冃的曙因）同一種隔制耀切割帶冇黏性 末端切n帶冇樣I同點(diǎn)性末 端的冃的It因片段LI.I DNA蠱接卿<mnNA（tb狀審組質(zhì)粒）目的基因與運(yùn)載體的結(jié)合過程，實(shí)際上是不同來源的基因重組的過程 探究三目的

12、基因?qū)胧荏w細(xì)胞-轉(zhuǎn)化問題1:什么是轉(zhuǎn)化？目的基因進(jìn)入受體細(xì)胞內(nèi)，并且在受體細(xì)胞內(nèi)維持穩(wěn)定和表達(dá)的過程。問題2:比較將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞方法?細(xì)胞類型常用方法受體細(xì)胞轉(zhuǎn)化過程植物細(xì)胞農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法體細(xì)胞、受精卵將目的基因插入 Ti質(zhì)粒的T-DNA上7 轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌7導(dǎo)入植物細(xì)胞7整合 到受體細(xì)胞的DNA上7表達(dá)動(dòng)物細(xì)胞顯微注射技術(shù)受精卵將含有目的基因的表達(dá)載體提純7 取卵（受精卵）7顯微注射7早 期胚胎培養(yǎng)7胚胎移植7發(fā)育成為具有新性狀的動(dòng)物微生物Ca2+處理增大細(xì)胞壁通透性原核細(xì)胞細(xì)胞 或酵母菌用Ca2+處理細(xì)胞7感受態(tài)細(xì)胞7重組 表達(dá)載體DNA分子與感受態(tài)細(xì)胞混合 7感受態(tài)細(xì)胞吸收 DNA分

13、子探究四 步驟四：目的基因的檢測(cè)與鑒定一一檢查是否成功問題1:受體細(xì)胞攝入DNA分子后就說明目的基因完成了表達(dá)嗎？ 不能，受體細(xì)胞必須表現(xiàn)出特定的性狀，才能說明目的基因完成了表達(dá)。問題2.目的基因的檢測(cè)內(nèi)容和方法的比較類型步驟檢測(cè)內(nèi)容方法結(jié)果顯示分子檢測(cè)第一步目的基因是否進(jìn) 入受體細(xì)胞DNA分子雜交（DNA 和 DNA之間）是否成功顯示出雜交帶第二步目的基因是否轉(zhuǎn)錄出mRNA分子雜交技術(shù)（DNA和mRNA之間）是否成功顯示出雜交帶第三步目的基因是否翻 譯出蛋白質(zhì)抗原一抗體雜交是否成功顯示出雜交帶個(gè)體水平鑒定包括抗蟲、抗病的接種實(shí)驗(yàn)，以確定是否有抗性以及抗性的程度；基因工程產(chǎn)品與天然產(chǎn)品的活性比

14、較，以確定功能是否相同等。問題3.試分析真核生物的基因?qū)爰?xì)菌細(xì)胞后，不能正常發(fā)揮功效的可能原因有哪些?被細(xì)菌體內(nèi)的限制性內(nèi)切酶破壞。 該基因指導(dǎo)合成的蛋白質(zhì)不能在細(xì)菌體內(nèi)正確修飾和表達(dá)。細(xì)菌的RNA聚合酶不能識(shí)別真核基因的位點(diǎn)，致使不能啟動(dòng)轉(zhuǎn)錄。 細(xì)菌細(xì)胞中沒有切除內(nèi)含子轉(zhuǎn)錄部分的酶。3-珠蛋白是動(dòng)物血紅蛋白的重要組成成分。當(dāng)它的成分異常時(shí)，動(dòng)物有可能患某-珠問題4.種疾病，如鐮刀形細(xì)胞貧血癥。假如讓你用基因工程的方法，使大腸桿菌生產(chǎn)出鼠的B 蛋白，想一想，應(yīng)如何進(jìn)行設(shè)計(jì)？(1 )從小鼠中克隆出B -珠蛋白基因的編碼序列(CDNA)。(2)將cDNA前接上在大腸桿菌中可以適用的啟動(dòng)子，另外加

15、上抗四環(huán)素的基因，構(gòu)建成一 個(gè)表達(dá)載體。(3 )將表達(dá)載體導(dǎo)入無四環(huán)素抗性的大腸桿菌中，然后在含有四環(huán)素的培養(yǎng)基上培養(yǎng)大腸 桿菌。如果表達(dá)載體未進(jìn)入大腸桿菌中，大腸桿菌會(huì)因不含有抗四環(huán)素基因而死掉；如果培 養(yǎng)基上長(zhǎng)出大腸桿菌菌落，則表明B -珠蛋白基因已進(jìn)入其中。-珠蛋白。(4)培養(yǎng)進(jìn)入了B -珠蛋白基因的大腸桿菌，收集菌體，破碎后從中提取B拓展延伸分子雜交技術(shù)DNA分子雜交技術(shù)又稱 DNA探針技術(shù)，是利用 DNA分子的變性、復(fù)性以及堿基互補(bǔ)配對(duì) 的高度精確性，對(duì)某一特異性 DNA序列進(jìn)行探查的新技術(shù)?；蛱结樆蛱结?，即核酸探針，是一段帶有檢測(cè)標(biāo)記，且順序已知的，與目的基因互補(bǔ)的核酸序列 (

16、DNA或RNA?；蛱结樛ㄟ^分子雜交與目的基因結(jié)合，產(chǎn)生雜交信號(hào)，能從浩翰的基因組 中把目的基因顯示出來。根據(jù)雜交原理，作為探針的核酸序列至少必須具備以下兩個(gè)條件： 應(yīng)是單鏈，若為雙鏈，必須先行變性處理。應(yīng)帶有容易被檢測(cè)的標(biāo)記。它可以包括整個(gè) 基因，也可以僅僅是基因的一部分；可以是DNA本身，也可以是由之轉(zhuǎn)錄而來的RNA附：目的基因的檢測(cè)和表達(dá)提示： DNA分子雜交技術(shù)首先提取受體細(xì)胞中的DNA，然后高溫解成單鏈，再與同位素標(biāo)記的DNA探針雜交； 抗原-抗體雜交所用到的抗體是用表達(dá)出的蛋白質(zhì)注射動(dòng)物進(jìn)行免疫，產(chǎn)生相應(yīng)的抗體， 并提取出而來的。反饋平臺(tái)(勤練習(xí)，學(xué)方法)1、基因工程的操作步驟：

17、制備重組DNA分子 轉(zhuǎn)化受體細(xì)胞 篩選出獲得目的基因的受體細(xì)胞，培養(yǎng)受體細(xì)胞并誘導(dǎo)目的基因的表達(dá) 獲取目的基因 正確的操作順序是A.B .2、下列獲取目的基因的方法中需要模板鏈的是 從基因文庫中獲取目的基因反轉(zhuǎn)錄法A、B、C(利用通過C、(C )D.D )PCR技術(shù)擴(kuò)增目的基因DNA合成儀利用化學(xué)方法人工合成D、3、下列屬于獲取目的基因的方法的是利用mRNA反轉(zhuǎn)錄形成從受體細(xì)胞中提取利用DNA轉(zhuǎn)錄A.C.(D)從基因組文庫中提取利用PCR技術(shù)人工合成B. D. D4、 有關(guān)基因工程的敘述正確的是(D )A、限制酶只在獲得目的基因時(shí)才用B、重組質(zhì)粒的形成在細(xì)胞內(nèi)完成C、質(zhì)粒都可作為運(yùn)載體D、蛋白

18、質(zhì)的結(jié)構(gòu)可為合成目的基因提供資料5、 下列關(guān)于限制酶的說法正確的是（B ）A、限制酶廣泛存在于各種生物中，但微生物中很少B、一種限制酶只能識(shí)別一種特定的核苷酸序列C、不同的限制酶切割 DNA后都會(huì)形成黏性末端D、限制酶的作用部位是特定核苷酸形成的氫鍵6、 已知某種限制酶在一線性DNA分子上有3個(gè)酶切位點(diǎn)，如圖中箭頭所指。如果該線性a、b、c、DNA分子在3個(gè)酶切位點(diǎn)上都被該酶切斷，則會(huì)產(chǎn)生a、b、c、d四種不同長(zhǎng)度的 DNA片段?，F(xiàn)有多個(gè)上述線性 DNA分子，若在每個(gè)DNA分子上至少有1個(gè)酶切位點(diǎn)被該酶切斷， 則從理論上講，經(jīng)該酶切割后，這些線性DNA分子最多能產(chǎn)生長(zhǎng)度不同的DNA片段種類數(shù)是（C ）A、 3B、 4C、 9 D、 127、基因工程是在 DNA分子水平上進(jìn)行設(shè)計(jì)施工的?；パa(bǔ)配對(duì)的步驟是（A、人工合成目的基因C、將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞8、下列關(guān)于基因工程的敘述，錯(cuò)誤的是在基因操作的基本步驟中，不進(jìn)行堿基B、目的基因與運(yùn)載體結(jié)合D、目的基因的檢測(cè)和表達(dá)(D)A .目的基因和受體細(xì)胞均可來自動(dòng)、植物或微生物B .限制性核酸內(nèi)切酶和 DNA連接酶是兩類常用的工具酶C .人胰島素原基因在大腸桿菌中表達(dá)的胰島素原無