發(fā)酵液中還原糖測定

1、發(fā)酵過程中的還原糖測定 實(shí)驗(yàn)?zāi)康?、學(xué)習(xí)和掌握發(fā)酵過程中的取樣操作。2、了解還原糖的各種測定方法；掌握DNS法測定的操作方法及注意事項(xiàng)。 實(shí)驗(yàn)原理（一）發(fā)酵過程中的取樣操作取樣操作是發(fā)酵過程中在線控制的重要內(nèi)容；只有通過取樣才能對發(fā)酵過程中的諸多參數(shù)進(jìn)行測定，以求進(jìn)一步的控制。操作要注意動作協(xié)調(diào)、快速，不能造成發(fā)酵罐的污染，嚴(yán)格按照相應(yīng)程序進(jìn)行。盛放樣品的器皿也要潔凈、無菌，以防止對測定結(jié)果產(chǎn)生影響。（二）發(fā)酵過程中的還原糖測定單糖和某些寡糖含有游離的醛基或酮基，有還原性，屬于還原糖。而多糖和蔗糖等屬于非還原性糖；利用多糖能被酸水解為單糖的性質(zhì)可以通過測定水解后的單糖含量對總糖進(jìn)行測定。發(fā)酵工

2、藝控制是通過一系列工藝參數(shù)來實(shí)現(xiàn)的。這些參數(shù)中包括物理參數(shù)，即溫度、壓力等。二是化學(xué)控制系數(shù)，即pH、糖的濃度等；其中糖的濃度是控制發(fā)酵過程中的重要參數(shù)之一。由于碳源對于發(fā)酵過程菌體生長及產(chǎn)物合成都有較大影響。因此，測知發(fā)酵過程中還原糖濃度變化，對發(fā)酵控制有重要的指導(dǎo)意義。還原糖的測定方法有很多，一般有菲林試劑法、酶法和DNS法。A、菲林試劑法菲林試劑由質(zhì)量濃度為0.1g/mL的NaOH溶液和質(zhì)量濃度為0.05g/mL的CuSO4溶液配制而成，二者混合后，立即生成淡藍(lán)色的Cu(OH)2沉淀。Cu(OH)2在加熱條件下與醛基反應(yīng)，被還原成磚紅色的Cu2O沉淀，醛基則被氧化為羧基。利用菲林溶液與還

3、原糖共沸，生成氧化亞銅沉淀的反應(yīng)，以次甲基藍(lán)為指示液，以樣品或經(jīng)水解后的樣品滴定煮沸的菲林溶液，達(dá)到終點(diǎn)時，稍微過量的還原糖將藍(lán)色的次甲基沉還原為無色，以示終點(diǎn)。根據(jù)樣品消耗量求得總糖或還原糖的含量。用菲林試劑鑒定可溶性還原糖時，溶液的顏色變化過程為：淺藍(lán)色棕色磚紅色(沉淀)。B、酶法又稱葡萄糖氧化酶過氧化物酶法。葡萄糖氧化酶可將葡萄糖氧化成葡萄糖酸并產(chǎn)生過氧化氫，后者與苯酚及安替比林在過氧化物酶作用下生成紅色化合物，葡萄糖的濃度與紅色深淺成一定比例。一般可采用葡萄糖測定的試劑盒，測定方法簡單、快速C、DNS法又稱3，5二硝基水楊酸法。在堿性溶液中，還原糖變?yōu)橄┒迹┒伎杀?，5二硝基水楊

4、酸氧化為糖酸。加熱進(jìn)一步產(chǎn)生一種棕紅色的氨基化合物。在一定濃度范圍內(nèi)，還原糖的量與棕紅色物質(zhì)的深淺成一定比例關(guān)系，通過此比例測定還原糖的含量。三種方法各有不同的應(yīng)用和使用范圍，應(yīng)根據(jù)具體情況選擇。例如菲林法容易受青霉素效價及其他還原性物質(zhì)的干擾且滴定終點(diǎn)不易判斷，誤差較大；酶法專一性強(qiáng)且結(jié)果準(zhǔn)確，但成本較高，適宜精確測定；而DNS法則結(jié)果準(zhǔn)確且操作相對簡單；在生產(chǎn)和研究中應(yīng)用相對更為廣泛。實(shí)驗(yàn)材料1、分析試劑DNS顯色劑 每1000mlDNS溶液含有酒石酸鉀鈉 182g，無水亞硫酸鈉 3g，氫氧化鈉 20g，3，5二硝基水楊酸 6.3g，重蒸餾酚 4g。配后過濾放置半月后使用。1%葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶

5、液：準(zhǔn)確稱取100mg葡萄糖，用少量蒸餾水溶解后定容至100ml，冰箱保存?zhèn)溆?10%ZnSO4溶液. 2、器材 分光光度計(jì)，定糖管，移液管，容量瓶，燒杯，電爐等。方法步驟 （一）葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制取9只定糖管（有蓋子，且用繩子系?。?，分別按照下表1的順序加入各種試劑，沸水浴中加熱5min，后立即流動水冷卻。管內(nèi)溶液混勻， 用空白管溶液調(diào)零點(diǎn)，520nm測定光密度值(O.D.)，以葡萄糖含量為橫坐標(biāo)，光密度值為縱坐標(biāo)繪制葡萄糖溶液標(biāo)準(zhǔn)曲線。表1 制作葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線時各試劑用量項(xiàng)目CK12345678含糖總量(mg)00.20.40.60.81.01.21.41.6葡萄糖液(ml)00.20.

6、40.60.81.01.21.41.6蒸餾水(ml)2.01.81.61.41.21.00.80.60.4DNS試劑(m1)1.51.51.51.51.51.51.51.51.5加熱均在沸水浴中加熱5min冷卻立即用流動冷水冷卻蒸餾水(ml)21.521.521.521.521.521.521.521.521.5光密度(520nm)（二）發(fā)酵液的取樣按照發(fā)酵罐取樣的操作規(guī)程取樣，并用潔凈的三角瓶盛放。（三）發(fā)酵液檢測樣品的制備取一定體積的發(fā)酵液在12000rpm下離心去除產(chǎn)菌體。準(zhǔn)確量取5ml發(fā)酵上清液（視含糖量高低而定，在發(fā)酵周期內(nèi)不同時期取樣數(shù)量應(yīng)有所不同）于100ml容量瓶中，加入10m

7、l 10%ZnSO4溶液，用堿液（NaOH 3mol/L）調(diào)節(jié)顯堿性，以水稀釋至刻度、搖勻；通過干燥濾紙過濾。按照表2加入相應(yīng)試劑進(jìn)行反應(yīng)。520nm測定光密度值，最后根據(jù)葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線算出發(fā)酵液所含還原糖的量。每管測定三次，求平均值。表2 發(fā)酵液所含還原糖的測定項(xiàng)目CK123發(fā)酵液(ml)00.80.80.8蒸餾水(ml)2.01.21.21.2DNS試劑(m1)1.51.51.51.5加熱均在沸水浴中加熱5min冷卻立即用流動冷水冷卻蒸餾水(ml)21.521.521.521.5光密度(520nm)注意：1、實(shí)驗(yàn)中所有的試管要干凈，加入各種試劑量要準(zhǔn)確。2、試劑不可倒出試劑瓶，用干凈的移液

8、管吸取，用后蓋好瓶塞，防回原處。3、定糖管的管口在加熱時不可朝向人，以免糖液過度沸騰飛濺傷人。4、葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制要準(zhǔn)確，盡量符合統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（R2>97）。如果繪制時濃度過度分散需重做依次。5、分光光度計(jì)使用：溶液不要倒太多；毛邊不要對著透光處；用后用自來水沖洗干凈，防回原處。 實(shí)驗(yàn)報(bào)告1、 填寫表1，并繪制葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線圖。表1 制作葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線時各試劑用量項(xiàng)目CK12345678含糖總量(mg)00.20.40.60.81.01.21.41.6葡萄糖液(ml)00.20.40.60.81.01.21.41.6蒸餾水(ml)2.01.81.61.41.21.00.80.60.4DN

9、S試劑(m1)1.51.51.51.51.51.51.51.51.5加熱均在沸水浴中加熱5min冷卻立即用流動冷水冷卻蒸餾水(ml)21.521.521.521.521.521.521.521.521.5光密度(520nm)00.0360.0890.1150.2280.2570.3700.4040.4492、 根據(jù)葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線，算出發(fā)酵液中還原糖的濃度。表2 發(fā)酵液所含還原糖的測定項(xiàng)目CK123發(fā)酵液(ml)00.80.80.8蒸餾水(ml)2.01.21.21.2DNS試劑(m1)1.51.51.51.5加熱均在沸水浴中加熱5min冷卻立即用流動冷水冷卻蒸餾水(ml)21.521.521.521.5光密度(520nm)0由標(biāo)準(zhǔn)曲線可知發(fā)酵七天的還原糖濃度是 mg/ml發(fā)