兩種洗板方法在ELISA中的應(yīng)用分析

1、兩種洗板方法在ELISA中的應(yīng)用分析         【摘要】  目的：探討酶聯(lián)免疫試驗(yàn)(ELISA)中的洗板技術(shù)，試圖找到一種簡(jiǎn)單、高效、經(jīng)濟(jì)、實(shí)用、可靠的ELISA洗板方法。方法：對(duì)753例臨床體檢乙型肝炎表面抗原(HBsAg)的標(biāo)本，分別用手工法和全自動(dòng)洗板機(jī)法兩種方法進(jìn)行洗板，進(jìn)行組間對(duì)比分析；將弱陽(yáng)性標(biāo)本選出，重新檢測(cè)2次，分別用兩種方法洗板，看看弱陽(yáng)性是否因洗板方法不同引起。結(jié)果：753例用ELISA方法檢測(cè)HBsAg試驗(yàn)中，用手工法洗板和用洗板機(jī)洗板，經(jīng)2檢驗(yàn)，P0.05，兩種洗板方法差異無(wú)

2、顯著性；18例弱陽(yáng)性標(biāo)本檢測(cè)中，洗板方法的不同，不是造成假陽(yáng)性的根本原因。結(jié)論：兩種洗板方法無(wú)差別，在ELISA實(shí)驗(yàn)中，手工法可以代替洗板機(jī)法洗板。手工法簡(jiǎn)單、高效、實(shí)用，應(yīng)可規(guī)范推廣。 【關(guān)鍵詞】  ELISA洗板；洗板方法；弱陽(yáng)性Comparison between Two Cleaningmethods on ELISAAbstract: Objective To investigate the cleaningtechnology of the ELISA. Try to find a simple higheffective and utility cleaningtrou

3、ghs method. Methods To use handle method and autowashingmachine method to clean the troughs of HBsAg with ELISA in 753 healthchecking peoples, Compared between the two cleaningmethods; Meanwhile, to select weak positive samples out and test repeatedly two times, to clean the troughs with the two met

4、hods, whether does it exist difference between the two methods.whether does it cause the fake positive by the cleaning methods. Results There is not significant difference(P0.05)to clean troughs with the two cleaningmethods in testing HBsAg with ELISA in 753 cases,The cleaningmethod isnt the real ca

5、use of the fake positive in testing 18 serum samples of weakpositive. Conclusion Washing with the two cleaningmethods, the result has not difference.the washmachine method can be substituted by the handle method. the handle method is simple, higheffective and practice.Key words: ELISA Cleaningtrough

6、s; Cleaningmethods;Weakpositive在酶聯(lián)免疫試驗(yàn)中，洗板是非常重要的過(guò)程。酶聯(lián)免疫試驗(yàn)(ELISA)洗滌過(guò)程雖不是一個(gè)反應(yīng)過(guò)程，但卻也決定著實(shí)驗(yàn)的成敗1。ELISA就是通過(guò)洗滌來(lái)達(dá)到分離游離和結(jié)合的酶標(biāo)記物的目的，通過(guò)洗滌以清除殘留在微孔板中未能與固相抗原或抗體相結(jié)合的物質(zhì)，以及在反應(yīng)過(guò)程中的非特異性吸附于固相載體上的干擾物質(zhì)。聚苯乙烯對(duì)蛋白質(zhì)的吸附是普遍的，在ELISA測(cè)定的反應(yīng)過(guò)程中應(yīng)盡量避免非特異性吸附，洗滌時(shí)又應(yīng)將這些非特異性吸附的干擾物質(zhì)洗滌掉。在ELISA操作中，洗滌是非常關(guān)鍵的，應(yīng)引起操作者的高度重視。我們對(duì)753例用ELISA方法檢測(cè)乙型肝炎表面抗原

7、(HBsAg)的洗板過(guò)程進(jìn)行了檢測(cè)，采用我們自創(chuàng)的人工洗板法和全自動(dòng)洗板機(jī)洗板對(duì)比試驗(yàn)，現(xiàn)將結(jié)果報(bào)告如下。1  材料和方法1.1  材料1.1.1  標(biāo)本來(lái)源及類(lèi)型  753例標(biāo)本來(lái)源于廣東省深圳市龍崗區(qū)南嶺人民醫(yī)院2005年12月8日至2006年1月4日的工廠體檢血清標(biāo)本，其中男性121例，女性653例，年齡17歲43歲,平均年齡為30歲。1.1.2  乙型肝炎病毒表面抗原診斷試劑盒(酶聯(lián)免疫法)由上海榮盛生物技術(shù)有限公司生產(chǎn)。1.1.3  一個(gè)大的臉盆和一些棉質(zhì)毛巾。1.1.4  消毒劑  健之素(含有效氯50

8、0 mg/片)。1.1.5  特建一個(gè)有開(kāi)關(guān)口的洗滌池。1.1.6  全自動(dòng)洗板機(jī)  美國(guó)Multiwash。1.2  方法1.2.1  手工法  按試劑說(shuō)明書(shū)嚴(yán)格操作，稀釋液用蒸餾水按120稀釋濃縮洗液，適量置于臉盆之中。從37 水浴溫箱中拿出溫浴到時(shí)的反應(yīng)板，到洗滌池處，放開(kāi)自來(lái)水約1 min，然后快速甩掉反應(yīng)液，即用自來(lái)水沖洗數(shù)次，甩掉水并用干凈的毛巾吸干，放入配好洗滌液的臉盆之中，浸泡5 min10 min，然后將反應(yīng)板取出，甩掉洗滌液，再用自來(lái)水沖洗數(shù)次，用干凈吸水的毛巾拍干(多次)反應(yīng)板。加顯色劑A、B后，振蕩封板，放入3

9、7 水浴溫箱10 min，取出，加終止液，振蕩，上酶標(biāo)儀讀板，觀察結(jié)果。按感染性醫(yī)療廢物處理洗滌池的液體及用過(guò)的洗滌液：加入健之素(500 mg/片)，使其濃度達(dá)到2 500 mg/L，浸泡24 h，收集起來(lái)，交醫(yī)療廢物處理公司處理。1.2.2  洗板機(jī)法  按試劑說(shuō)明書(shū)嚴(yán)格操作，稀釋液用蒸餾水按120稀釋濃縮洗液，適量置于洗板機(jī)洗液瓶里。將反應(yīng)到時(shí)的反應(yīng)板取出，用洗板機(jī)洗板5次，每次浸泡1 min，取出，用干凈的毛巾拍干(多次)反應(yīng)板。加顯色劑A、B后，振蕩封板，放入37 水浴溫箱10 min，取出，加終止液，振蕩，上酶標(biāo)儀讀板，觀察結(jié)果。  

10、0;      1.2.3  假陽(yáng)性排除  實(shí)際工作中，我們發(fā)現(xiàn)假陽(yáng)性一般顯色都較淡，即弱陽(yáng)性；為了排除假陽(yáng)性，將753例中18例弱陽(yáng)性(酶標(biāo)儀讀數(shù)0.105<OD<0.511)的標(biāo)本取出，觀察標(biāo)本的基本情況，看是否有纖維蛋白、紅細(xì)胞、溶血等情況；并做相應(yīng)處理后，重新離心5 min(2 500 r min)，重做2次，分別測(cè)定，一次用手工洗板，一次用洗板機(jī)洗板，以排除是否因洗板差異造成的弱陽(yáng)性。< p> 1.2.4  假陰性的排除  753例標(biāo)本檢測(cè)中，每板都做雙孔陰性對(duì)照和陽(yáng)性對(duì)

11、照，然后用兩種方法洗板，結(jié)果兩種洗板方法都未出現(xiàn)陽(yáng)性對(duì)照陰性結(jié)果的現(xiàn)象，而陰性對(duì)照全部陰性。1.3  統(tǒng)計(jì)方法  數(shù)據(jù)分析使用SPSS 11.5統(tǒng)計(jì)軟件統(tǒng)計(jì)處理。2  結(jié)果2.1  兩種洗板方法HBsAg檢測(cè)結(jié)果比較  753例檢測(cè)標(biāo)本中，兩種方法洗板以后，手工法陽(yáng)性52例，洗板機(jī)法陽(yáng)性53例，經(jīng)2檢驗(yàn)，2=0.01，P0.05，兩種洗板方法差異無(wú)顯著性，結(jié)果見(jiàn)表1。表1  753例HBsAg(手工法和洗板機(jī)法洗板)檢測(cè)結(jié)果（略）注：組間比較，2=0.01，P0.05。2.2  18例弱陽(yáng)性標(biāo)本的檢測(cè)  用兩種方法

12、洗板，結(jié)果陽(yáng)性15例，陰性3例為假陽(yáng)性；弱陽(yáng)性率占753例樣本的2.39%(18/753)，假陽(yáng)性占0.39%(3/753)。2.3  3例弱陽(yáng)性標(biāo)本  經(jīng)重新處理標(biāo)本，重新檢驗(yàn)，用兩種方法進(jìn)行洗板檢測(cè)，結(jié)果3例都為陰性，而未出現(xiàn)1例陽(yáng)性，確定3例為假陽(yáng)性，應(yīng)排除。3  討論根據(jù)ELISA方法檢測(cè)原理可知洗滌是為了去除未結(jié)合的多余的酶標(biāo)物質(zhì)，但又不能把結(jié)合的酶標(biāo)物質(zhì)洗脫，它即簡(jiǎn)單又重要，即可用手工法也可用機(jī)械法。筆者用ELISA法檢測(cè)了753例體檢血清標(biāo)本的HBsAg，分別用我們自創(chuàng)的手工法洗板和全自動(dòng)洗板機(jī)法洗板，進(jìn)行組間比較，P0.05，結(jié)果差異無(wú)顯著性。也就

13、是說(shuō)可用手工法代替洗板機(jī)法洗板，兩種洗板法得出的結(jié)果都可靠，我們認(rèn)為用手工法洗板更加簡(jiǎn)單、高效，可提高工作效率。筆者對(duì)18例弱陽(yáng)性標(biāo)本進(jìn)行了重復(fù)檢測(cè)，并用手工法和洗板機(jī)法兩種方法洗板測(cè)定，其中有3例弱陽(yáng)性標(biāo)本經(jīng)重復(fù)檢測(cè)后為陰性，確定為假陽(yáng)性，假陽(yáng)性占753例樣本中的0.39%，假陽(yáng)性往往顯色都較弱，表現(xiàn)為弱陽(yáng)性。弱陽(yáng)性的出現(xiàn)，主要是由于標(biāo)本沒(méi)有處理好造成，伴有溶血或其他因素引起血清渾濁較為常見(jiàn)，而這些樣品在HBsAg的ELISA檢測(cè)中常出現(xiàn)假陽(yáng)性2，纖維蛋白、紅細(xì)胞、標(biāo)本溶血是弱陽(yáng)性發(fā)生的主要原因。尤其是纖維蛋白可非特異性地吸附在載體上，并吸附酶標(biāo)抗體，難于徹底洗脫，因此，標(biāo)本要充分凝固，離心

14、要充分，使血清分離良好，吸樣時(shí)不要吸到紅細(xì)胞。如標(biāo)本溶血較嚴(yán)重，建議重新取樣，因?yàn)檠t蛋白中含有血紅素基團(tuán)，其有類(lèi)似過(guò)氧化物酶的活性，在以辣根過(guò)氧化物酶(HRP)為標(biāo)記酶的ELISA測(cè)定中，如血清標(biāo)本中血紅蛋白濃度過(guò)高，則其很容易在溫育過(guò)程中吸附于固相上，從而與隨后加入的HRP底物反應(yīng)顯色3。在假陰性方面，753例檢測(cè)中，都做雙孔陽(yáng)性對(duì)照，結(jié)果兩種洗板方法都未出現(xiàn)陽(yáng)性對(duì)照陰性結(jié)果的現(xiàn)象，可見(jiàn)手工洗板法不會(huì)出現(xiàn)假陰性的現(xiàn)象。用手工法洗板經(jīng)濟(jì)、實(shí)用，只需一個(gè)臉盆，一個(gè)特建的洗滌池，成本非常低，并可長(zhǎng)期使用，其經(jīng)濟(jì)實(shí)用不言而喻；而全自動(dòng)洗板機(jī)，價(jià)格昂貴，對(duì)于基層醫(yī)院是個(gè)不小的負(fù)擔(dān)；對(duì)于大醫(yī)院或繁忙的醫(yī)院，則要多臺(tái)同時(shí)使用，且容易堵塞、出故障，給工作帶來(lái)不便，其維護(hù)、保養(yǎng)、維修也是一個(gè)不小的負(fù)擔(dān)。在控制感染性醫(yī)療廢物方面，只要嚴(yán)格要求，將使用后的洗滌液也倒入洗滌池之中，按2 500 mg/L的濃度，加入健之素，浸泡24 h，然后收集，交醫(yī)療廢物處理公司處理，則完全可以控制感染。沖板用的自來(lái)水，只要符合國(guó)家自來(lái)水供水標(biāo)準(zhǔn)，便可使用，但洗板開(kāi)始前，應(yīng)打開(kāi)自來(lái)水開(kāi)關(guān)，讓自來(lái)水空流1 min2 min，以使沉積的臟水流去。遇自來(lái)水混濁時(shí)，不可使用。綜上所述，在ELISA方