固有腸內(nèi)菌對(duì)大腸粘膜特性的活化和修飾-- 微生物學(xué)

1、固有腸內(nèi)菌對(duì)大腸粘膜特性的活化和修飾- 微生物學(xué)    包括人類(lèi)在內(nèi)，在動(dòng)物腸道內(nèi)的每克內(nèi)容物中，定植著101112的腸道細(xì)菌，其種類(lèi)也是極其多樣的。如今，雖然將這些復(fù)雜的微生物統(tǒng)稱(chēng)為腸道菌群，但是，關(guān)于其構(gòu)成以及對(duì)機(jī)體的作用，仍有很多不明之處?？墒牵缤谝嫔人?jiàn)到的那樣，在世界范圍內(nèi)，正在嘗試著積極利用常居性腸道細(xì)菌，以期待著闡明腸道菌群的作用。本綜述將介紹把特定的腸道細(xì)菌種單獨(dú)或混合定植于由無(wú)菌動(dòng)物來(lái)說(shuō)的悉生動(dòng)物的試驗(yàn)成果，進(jìn)而來(lái)論述腸道菌群的作用。從比較無(wú)菌動(dòng)物和清潔動(dòng)物(主要為大鼠)的試驗(yàn)成果來(lái)說(shuō)，腸道菌群的存在，對(duì)于宿主動(dòng)物的生理，尤其對(duì)

2、腸道影響很大。這方面雖然受到了啟發(fā)，但是還有許多基本的疑點(diǎn)。例如：疑點(diǎn)1使無(wú)菌動(dòng)物腸粘膜的特征普通化所必需的細(xì)菌種是什么?如上所述，觀測(cè)腸內(nèi)容物、糞便中的100種以上的微生物，雖然形成腸道生態(tài)系，但是，腸粘膜的特征向普通動(dòng)物型變化，是否需要如此之多種多量的腸道細(xì)菌?另外，各菌種的有用率是否相同?(根據(jù)腸粘膜各自的特征，能夠充分地予測(cè)到有用的腸道細(xì)菌的菌種是不同的，所以，首先有必要特定腸粘膜的特征。)疑點(diǎn)2腸道菌群對(duì)小腸發(fā)揮著怎樣的作用機(jī)理?迄今，在比較和研究無(wú)菌動(dòng)物和普通化動(dòng)物過(guò)程中，絕大多數(shù)認(rèn)為小腸的特征有著明顯的差異。不言而喻，雖然認(rèn)為對(duì)小腸的理解較大腸有所進(jìn)展，但是，一般來(lái)說(shuō)，小腸的腸道

3、細(xì)菌的菌種、菌量都少。對(duì)小腸粘膜帶來(lái)特征變化的腸道細(xì)菌，究竟是存在于小腸內(nèi)的腸道細(xì)菌中呢?還是通過(guò)棲息在大腸內(nèi)的大量的腸道細(xì)菌，間接地誘導(dǎo)小腸粘膜的變化呢?疑點(diǎn)3腸道菌群和宿主動(dòng)物的結(jié)合有特異性嗎?各種動(dòng)物構(gòu)成了各具特征的腸道菌群，用顯微鏡觀察鼠和人類(lèi)糞便菌群的涂片標(biāo)本，能很容易地判斷其差異。一般認(rèn)為，兩者的差異主要起因于梭菌屬是否含有梭形菌型(Fusiform type)。但是，從分類(lèi)學(xué)上，多是以種的標(biāo)準(zhǔn)表示著在腸道菌群不同種動(dòng)物的構(gòu)成差異。這種情況究竟是暗示了宿主動(dòng)物和腸道菌群的密切結(jié)合呢?還是反映了食性差異等環(huán)境要因呢?腸道菌群的構(gòu)成及其宿主動(dòng)物種間是否有著必然的聯(lián)系?上述疑問(wèn)，在影響腸

4、道細(xì)菌種及其腸道細(xì)菌的宿主動(dòng)物方面，特定其特征，如果能夠正確了解其對(duì)應(yīng)關(guān)系的話(huà)，則都能夠很明確地搞清楚。1分節(jié)絲狀體細(xì)菌的存在及其細(xì)菌學(xué)方面的性質(zhì)如在疑問(wèn)2所提及的那樣，與大腸相比，小腸中的腸道細(xì)菌非常少。既使在內(nèi)容物開(kāi)始滯留的回腸部?jī)?nèi)，也僅是大腸中的千分之一的程度。但是，我們了解在多數(shù)動(dòng)物種中，結(jié)合并棲息在小腸上皮細(xì)胞管腔內(nèi)的腸道細(xì)菌種。在顯微鏡下觀察到的用福爾馬林固定小鼠回腸絨毛的標(biāo)本，有竟達(dá)到數(shù)百微米的分節(jié)絲狀細(xì)菌。這就是分節(jié)絲狀菌(segmented filamentous bacteria)。如果提高倍數(shù)，可以看到裂殖體進(jìn)入菌體中的現(xiàn)象。如后所述，我們制作并解析了裂殖體細(xì)菌單獨(dú)定植小

5、鼠和大白鼠，明確了該細(xì)菌引起宿主方面的的特征、尤其修飾和活化小腸粘膜的特征。于是，首先決定該細(xì)菌的16SrRNA的堿基配列，為了劃定細(xì)菌學(xué)上的應(yīng)有位置，進(jìn)行了系統(tǒng)分類(lèi)。迄今，在我們的研究組和Snell的研究組中，決定了小鼠、大白鼠、猴、雞的4種6系統(tǒng)動(dòng)物的裂殖體細(xì)菌的16SrRNA堿基配列。一般認(rèn)為裂殖體細(xì)菌間的相同性極高，形成一種自然群。雖然認(rèn)為在已知的細(xì)菌種中，分節(jié)絲狀菌是從梭菌屬的某個(gè)種中分岔出來(lái)的，但是，從堿基置換率來(lái)看，其距離相距很遠(yuǎn)，分節(jié)絲狀菌以其自身形成一個(gè)獨(dú)立群的想法大概是事實(shí)。Tannock等和Koopman等報(bào)答了分節(jié)絲狀菌在小鼠和大白鼠之間也不能互相交叉定植，證實(shí)了系統(tǒng)分

6、類(lèi)的結(jié)果。其他普通細(xì)菌學(xué)性質(zhì)，因不能在試管內(nèi)培養(yǎng)，是今后待研究的課題。2無(wú)菌動(dòng)物和普通化動(dòng)物為了解腸道細(xì)菌的作用，比較無(wú)菌動(dòng)物和普通化動(dòng)物是最合適的手段。試驗(yàn)成果指出，二者之間，不僅在消化道，而且在全身都存在著明顯的差異。本文的焦點(diǎn)放在腸粘膜免疫系統(tǒng)、尤其放在最近被重視的腸上皮細(xì)胞淋巴細(xì)胞(IEL)上，試圖解析腸道菌群的成分。首先，將小鼠自身的糞便菌群強(qiáng)制地定植地?zé)o菌小鼠內(nèi)，追蹤腸道菌群形成時(shí)IEL的行跡。無(wú)菌小鼠的rTCR陽(yáng)性細(xì)胞(rIEL)比TCR陽(yáng)性細(xì)胞(IEL)多3倍，但普通化后，IEL和rIEL的比率發(fā)生逆轉(zhuǎn)，清潔化2周以后，IEL則處于優(yōu)勢(shì)。如果用細(xì)胞數(shù)進(jìn)行比較的話(huà)，rIEL的細(xì)胞

7、數(shù)僅有少量增加，而IEL則增加10倍以上。另外，Thy-1陽(yáng)性IEL也明顯增加。大約rIEL的全部和IEL的大部分為CD8陽(yáng)性，其中，在IEL中有特征性的CD8的同型二聚體占50%以上。上述結(jié)果從給無(wú)菌、普通及清潔小鼠注射胸腺嘧啶核甙的類(lèi)似體溴脫氧尿核甙(BrdU)，并進(jìn)行連續(xù)標(biāo)記時(shí)，從IEL的各亞群的BrdU標(biāo)記率的變化中也能夠得到證實(shí)。以上試驗(yàn)顯示了，把握IEL和rIEL兩個(gè)亞群的動(dòng)態(tài)，在解析腸道菌群的效果方面，能夠形成有效的參數(shù)。因此，作為解析腸道菌群的第1階段，將IEL的兩個(gè)亞群的比率作為指標(biāo)，來(lái)劃分腸道菌群分離源的不同影響和腸道菌群。3修飾、活化小腸粘膜特征的腸道菌群分離源的影響和腸

8、道菌群成分的劃分為了評(píng)價(jià)腸道菌群對(duì)機(jī)體的作用，如前所述，以IEL特征作為指標(biāo)，調(diào)查了宿主方面的應(yīng)答。尤其著眼于迄今已知的將無(wú)菌鼠的盲腸尺寸縮小到清潔小鼠的大小的厭氧性有芽胞菌，將各種動(dòng)物的糞便和用氯仿處理的糞便投入到無(wú)菌小鼠內(nèi)。如前所述，將小鼠的IELT細(xì)胞的構(gòu)成比變成清潔小鼠型，僅限于小鼠糞便菌群或用氯仿處理的糞便菌群。人和大白鼠的糞全未見(jiàn)效果。另外，搞清楚了該結(jié)果不單單是IEL的構(gòu)成比，關(guān)于IEL的細(xì)胞障礙活性和腸上皮細(xì)胞的各種特征、盲腸大小也得出同樣的結(jié)果。因此，雖然是在所限定的種的范圍內(nèi)，但是，使小鼠腸粘膜的特征變成清潔小鼠型，暗示出是需要來(lái)源于小鼠的腸道菌群。這種情況可以推測(cè)出以前所

9、提倡的原藉菌群的通用結(jié)果。將耐氯仿的腸道菌群在試管內(nèi)用EG瓊脂培養(yǎng)基作厭氧培養(yǎng)，無(wú)選擇地收集100個(gè)菌落，將它們投到無(wú)菌小鼠，但其劃分未發(fā)現(xiàn)效果，使腸粘膜特征變成普通型的腸道細(xì)菌是耐氯仿的，至少可以推測(cè)是用EG培養(yǎng)基不能培養(yǎng)的腸道細(xì)菌種。尤其在鼠的腸內(nèi)容物中，所觀察到的菌數(shù)和能夠培養(yǎng)的菌數(shù)的差距是極大的，這種耐氯仿的腸道細(xì)菌，不能培養(yǎng)的居多，極難于進(jìn)一步劃分，目前尚未著手。然而，先前所介紹的粘附于小腸上皮細(xì)胞的分節(jié)絲狀菌因耐氯仿(具有形成芽胞的性能)，目前也尚未培養(yǎng)成功，是無(wú)菌小鼠普通化所必需的腸道細(xì)菌的一個(gè)侯補(bǔ)。從迄今的結(jié)果來(lái)看，任這種分節(jié)絲狀菌單獨(dú)定植的悉生動(dòng)物中，除了盲腸尺寸外，我們所解

10、析的小腸粘膜特征都變成普通化小鼠型，分節(jié)絲狀菌不是單一侯補(bǔ)，正在成為極為有力的候補(bǔ)。4用悉生動(dòng)物解釋動(dòng)物腸道菌群和宿主動(dòng)物相互作用采用已經(jīng)單獨(dú)定植分節(jié)絲狀菌的小鼠，將其糞便用生理鹽水制成懸液，經(jīng)口投入無(wú)菌小鼠(BALB/C)，在無(wú)菌隔離室內(nèi)飼養(yǎng)。其后，逐時(shí)殺死，測(cè)定腸上皮細(xì)胞間淋巴細(xì)胞(IEL)的細(xì)胞數(shù)、表現(xiàn)型、細(xì)胞障礙活性、腸內(nèi)容物的IgA量、以及小腸上皮細(xì)胞(IEC)的分裂指數(shù)、組織相容性復(fù)合體組分子的發(fā)現(xiàn)、糖脂質(zhì)GM1 fucosy1化、吸收細(xì)胞/杯狀細(xì)胞的比率、二糖類(lèi)分解酶活性。4.1對(duì)腸粘膜免疫系統(tǒng)的效果在裂殖體細(xì)菌投入前和投入后，在腸粘膜的機(jī)體防御系統(tǒng)中，逐時(shí)地調(diào)查了發(fā)揮重要作用的

11、IEL細(xì)胞數(shù)、表現(xiàn)型、細(xì)胞障礙活性。從投入分節(jié)絲狀菌之后的第14日起，IEL細(xì)胞數(shù)明顯增加。明確了具有T細(xì)胞受體的T細(xì)胞、有Thy-1抗原的成熟T細(xì)胞的比例增加的現(xiàn)象。這些IEL顯示出以癌細(xì)胞P815細(xì)胞作為標(biāo)靶的細(xì)胞障礙活性。還進(jìn)一步促進(jìn)分泌型lgA的產(chǎn)生。4.2對(duì)腸上皮細(xì)胞的機(jī)體防御因子及其他因子的效果認(rèn)為是病原細(xì)菌受體的GM1糖脂質(zhì)，通過(guò)投入裂殖體細(xì)菌，呈現(xiàn)出能引起Fucosyl化。進(jìn)而，為了提示對(duì)T細(xì)胞的腸道抗原，必要的級(jí)組分子是在投入裂殖體細(xì)菌之后的714日，在腸上皮細(xì)胞上發(fā)現(xiàn)的。其他，作為腸上皮細(xì)胞分裂指數(shù)的促進(jìn)指標(biāo)、腸粘膜上皮細(xì)胞的成熟指標(biāo)所用的吸收細(xì)胞杯/狀細(xì)胞的比率也增加，二

12、糖類(lèi)分解酶活性也因投入分節(jié)絲狀菌而與普通的SPF小鼠相同。4.3裂殖體細(xì)菌和梭型細(xì)菌對(duì)大腸特征的影響當(dāng)觀察裂殖體細(xì)菌對(duì)單獨(dú)定植小鼠結(jié)腸IEL的影響時(shí)，盡管分節(jié)絲狀菌單獨(dú)定植，IEL的表現(xiàn)型雖然與無(wú)菌小鼠不同，卻顯示出與小腸不同而清潔小鼠型的變化小。這可以認(rèn)為在大腸內(nèi)裂殖體細(xì)菌定植性不良的起因，嘗試著將構(gòu)成鼠大腸的主要菌種梭型菌單獨(dú)定植(實(shí)際上是梭型菌厭氧菌的混合)或者與絲狀體細(xì)菌混合定植。其結(jié)果，發(fā)現(xiàn)梭型菌定植小鼠，比分節(jié)絲狀菌單獨(dú)定植小鼠能向普通化型變化。觀察到裂殖體細(xì)菌和梭型菌細(xì)菌混合定植小鼠，向普通化型變化更強(qiáng)。尤其是這種變化，發(fā)現(xiàn)IEL中的 cD4和CD8的T細(xì)胞的構(gòu)成比CD8的同型二

13、聚體和異型二聚體的構(gòu)成比都是明顯的。在盲腸的IEL中，也都顯示出同樣的傾向。另外，迄今關(guān)于采用普通化指標(biāo)的盲腸重量，未發(fā)現(xiàn)裂殖體細(xì)菌單獨(dú)定植使盲腸縮小，與無(wú)菌小鼠幾乎相同，觀察到可培養(yǎng)的梭型菌群(主要的)的定植開(kāi)始增加，盲腸變小。盲腸縮小的現(xiàn)象，從前述的人菌群小鼠和大白鼠菌群小鼠也能發(fā)現(xiàn)的情況以及裂殖體細(xì)菌單獨(dú)定植小鼠的盲腸縮小的很小的情況，可以推測(cè)出盲腸大小縮小的機(jī)理和迄今所述的小腸各種特征、大腸IEL的變化機(jī)理是不同的。分節(jié)絲狀體菌和梭形菌的混合、定植小鼠的裂殖體細(xì)菌糞便中的菌數(shù)比單獨(dú)定植的抑制低，在小腸(回腸)內(nèi)容物中，梭形菌也定植，大約能確認(rèn)105個(gè)/g分節(jié)絲狀體菌。4.4小結(jié)通過(guò)對(duì)無(wú)

14、菌小鼠投入裂殖體細(xì)菌，顯示出對(duì)消化道粘膜的機(jī)體防御發(fā)揮很大作用的IEL的增加和活性化，在小腸上皮細(xì)胞中，為了提示對(duì)T細(xì)胞的腸道內(nèi)抗原，必要的級(jí)組分子被腸上皮細(xì)胞所誘導(dǎo)。進(jìn)而，作為銅綠假單胞菌)(Pseudomonas aeruginosa)的細(xì)胞粘附受體而發(fā)揮作用的GM1糖脂質(zhì)也被腸上皮細(xì)胞所fucosy1化，顯示出病原菌和病毒受體活性被阻滯的可能性。其他，作為小腸上皮細(xì)胞分裂指數(shù)的促進(jìn)指標(biāo)和小腸粘膜上皮細(xì)胞的成熟指標(biāo)而采用的吸收細(xì)胞/杯狀細(xì)菌比率、二糖類(lèi)分解酶活性都通過(guò)投入裂殖體細(xì)菌，與普通的SPF小鼠相同。一般認(rèn)為，這些情況暗示為了功能性地消化吸收而增加潛在的能力。以上的結(jié)果都是通過(guò)不含病

15、原性細(xì)菌的常居性腸道菌群所引起的效果。即明確了在腸道菌群中，裂殖體細(xì)菌至少是擔(dān)當(dāng)這些生理作用的腸道細(xì)菌的一種。裂殖體細(xì)菌的效果在小腸中尤其明顯，通過(guò)分節(jié)絲狀體細(xì)菌，大腸的IEL表現(xiàn)特征雖然接近于普通化，但沒(méi)有發(fā)現(xiàn)用普通化小鼠、耐氯仿細(xì)菌群觀察的盲腸尺寸的縮小、結(jié)腸上皮細(xì)胞的分裂指數(shù)的增加的情況。用分節(jié)絲狀體菌和小鼠大腸的主要構(gòu)成菌種梭形菌菌群的混合定植小鼠，首先看到盲腸尺寸的縮小的情況，一般認(rèn)為，當(dāng)IEL的表現(xiàn)特征更接近清潔型時(shí)，對(duì)大腸特征的普通化來(lái)說(shuō)，梭形菌的存在是必要的。分節(jié)絲狀體細(xì)菌和梭形菌群混合定植小鼠中，確認(rèn)了分節(jié)絲狀體菌在小腸、梭形菌在大腸都有更多的分布。另外，這次所用的梭形菌群以

16、耐氯仿性用EG瓊脂培養(yǎng)基在厭氧條件下可增殖，大部分細(xì)菌是梭形菌集團(tuán)的狀態(tài)，一般認(rèn)為今后這些菌群進(jìn)一步純化是可能的。在評(píng)價(jià)腸道細(xì)菌方面，腸粘膜的各種特征對(duì)宿主的生理機(jī)能來(lái)說(shuō)，是極為重要的。因此，如上所示，可推測(cè)出以分節(jié)絲狀體細(xì)菌為中心的常住性腸道細(xì)菌對(duì)消化道產(chǎn)生特異作用，并與宿主動(dòng)物很好的共存著。5關(guān)于腸道菌群在腸粘膜中的作用機(jī)理的假諮關(guān)于腸道菌群的作用機(jī)理，一般理解為腸道細(xì)菌產(chǎn)生的代謝產(chǎn)物、通過(guò)腸道細(xì)菌引起的代謝、被修飾的來(lái)自宿主的物質(zhì)、腸道細(xì)菌的細(xì)胞壁等菌體成分直接地影響腸粘膜，或者由消化道吸收后影響機(jī)體。雖然考慮到裂殖體細(xì)菌的場(chǎng)合也相當(dāng)于任何一種場(chǎng)合，但是，普通的腸內(nèi)容物的分析與無(wú)菌動(dòng)物的

17、內(nèi)容物幾乎無(wú)變化。另外，還觀察到分節(jié)絲狀細(xì)菌跟腸上皮細(xì)菌有很強(qiáng)的接合像，但尚未見(jiàn)到在機(jī)體內(nèi)易位的報(bào)告。當(dāng)考慮到這種情況時(shí)，一般認(rèn)為分節(jié)絲狀體細(xì)菌的作用機(jī)理與前述的機(jī)理有可能不同。這時(shí)，特別應(yīng)該注意的是裂殖體細(xì)菌在腸內(nèi)存在的形式。現(xiàn)在，我們就其結(jié)合機(jī)理進(jìn)行解析，假定在與腸上皮細(xì)胞的某種成分之間，存在受體配體的相互作用。設(shè)想分節(jié)絲狀體細(xì)菌的菌體的一部分跟腸上皮細(xì)胞受體結(jié)合，誘引某種信號(hào)傳導(dǎo)變異，可能導(dǎo)致向腸上皮細(xì)胞、IEL的一系列變化。從Regnault等的報(bào)告中，明確了比較無(wú)菌小鼠和清潔小鼠的IEL的T細(xì)胞抗原受體(TCR)，兩者使用鏈的頻率相同，在各克隆大小上存在不同。該結(jié)果暗示著與其說(shuō)IEL不是認(rèn)識(shí)腸道細(xì)菌的多樣性，不如說(shuō)腸道細(xì)菌的定植促進(jìn)調(diào)節(jié)著IEL增殖的應(yīng)答機(jī)理。分節(jié)絲狀菌單獨(dú)定植小鼠的鏈雖然未解析，卻予想到盡管分節(jié)絲狀菌單獨(dú)定植，鏈的使用