中藥材DNA條形碼分子鑒定法指導(dǎo)原則及其在《中國藥典》(20重點(diǎn)

1、中藥制劑分析課程論文中藥材DNA條形碼分子鑒定法指導(dǎo)原則及 其在中國藥典（2015年版中的應(yīng)用藥學(xué)（藥物分析方向2012級指導(dǎo)教師:高曉霞2015年11月摘要:中藥材存在多基原物種及同名異物、同物異名等問題 ，鑒于傳統(tǒng)基原鑒 定、性 狀鑒定、顯微鑒定和理化鑒定方法存在局限性，為保證中藥材臨床應(yīng)用安 全、準(zhǔn)確、有效，有必要增加中藥材DNA條形碼分子鑒定法。 如今分子生物學(xué)技 術(shù)在中藥材鑒定領(lǐng)域的應(yīng)用已 逐步深入。中國藥典2010年版收載了烏梢蛇飲 片、蘄蛇飲片、川貝母藥材的 DNA分子鑒 定方法，而中國藥典2015年版收載 了中藥材DNA條形碼分子鑒定法指導(dǎo)原則”，DNA條形碼分子鑒定法是利用公

2、認(rèn) 的相對較短的DNA序列來進(jìn)行物種假定的一種分子生物學(xué)技術(shù)，是傳統(tǒng)形態(tài)鑒別 方法的有效補(bǔ)充。這標(biāo)志著中藥材的分子鑒定由實(shí)驗(yàn)室科研層面進(jìn)入國家標(biāo)準(zhǔn)的應(yīng)用層面。關(guān)鍵詞：中藥材；DNA ;鑒定;指導(dǎo)原則一、中藥材DNA條形碼分子鑒定指導(dǎo)原則11.1定義及原理該鑒定方法主要適用于中藥材（包括藥材、藥材粉末及部分藥材飲片 及基原 物種的鑒 定。DNA條形碼分子鑒定法是利用基因組中一段公認(rèn)的、相對較短的 DNA序列來進(jìn)行物種鑒定的一種分子生物學(xué)技術(shù)，是傳統(tǒng)形態(tài)鑒別方法的有效補(bǔ) 充。由于DNA序列是由腺嘌呤（A、鳥嘌呤（G、胞嘧啶（C、胸腺嘧啶（T 4種堿 基以不同順序排列組成，因此一定長度DNA序列能夠

3、區(qū)分不同物種。中藥材DNA條形碼分子鑒定指導(dǎo)原則通過對大樣本量中藥材進(jìn)行 DNA條形 碼分子鑒定研 究,建立以ITS2為核心,psbA-trnH為輔的植物類藥材DNA條形碼鑒 定體系和以COI為主、ITS2為輔的動物類藥材DNA條形碼鑒定體系。1.2方法與步驟中藥材DNA條形碼分子鑒定法主要包括供試品處理、DNA提取、PCR擴(kuò)增、測序、序列 拼接及結(jié)果判定，以下內(nèi)容詳細(xì)說明各流程中的主要原理及注意事 項(xiàng)。1.2.1供試品處理 除特殊標(biāo)明外,藥材使用75%乙醇擦洗表面后晾干,稱取 10100 Mg 2+備用。1.2.2 DNA提取DNA的提取包括破碎細(xì)胞壁、釋放 DNA , DNA的分離和純化,

4、 DNA的濃縮、沉淀與洗滌等基本步驟，目前常用試劑盒法，包括植物基因組DNA 提取試劑盒和動物組織/細(xì)胞基因組DNA提取試劑盒。由于植物類中藥材種類繁多，可根據(jù)所研究中藥材的具體情況對提取方法加以 改進(jìn)。植物細(xì)胞內(nèi)含有大量次生代謝產(chǎn)物，如多糖、多酚等，這些物質(zhì)在提取DNA 的過程中與DNA共沉淀,形成黏稠的膠狀物難以溶解或產(chǎn)生褐變，嚴(yán)重影響DNA 提取的產(chǎn)量與質(zhì)量，以及后續(xù)的PCR擴(kuò)增實(shí)驗(yàn)。EDTA （乙二胺四乙酸螯合 Mg 2+2+或Mn 2+,抑制DNase （DNA酶活性；CTAB （十六烷基三甲基溴化銨 是一種陽離子表面活性劑，可溶 解細(xì)胞膜,與DNA形成復(fù)合 物溶于高鹽溶液，降低溶液

5、鹽濃度至一定程度，則從溶 液中沉淀,經(jīng)離心即可將CTAB與DNA復(fù)合物同蛋白質(zhì)、多糖類物質(zhì)分開。三羥 甲基氨基甲烷（Tris-HCI （pH 8.0提供一個緩沖環(huán)境，防止DNA被破壞。&巰基乙醇 是抗氧化劑，在提取DNA過程中加入&巰基乙醇,可以抑制氧化反應(yīng)，避免褐化。 PVP （聚乙烯吡咯烷酮是酚的絡(luò)合物,能與多酚形成一種不溶的絡(luò)合物質(zhì),有效去除 多酚，減少DNA提取過程中多酚的污染；同時它也能和多糖 結(jié)合，有效去除多糖。 因此將PVP和3巰基乙醇配合使用，能夠有效地防止DNA提取過程中多酚及多糖 的污染。在提取根、根莖、莖木類、皮類的 DNA時，一定要注意多糖、多酚的去除；

6、提 取葉、花、全 草的DNA時要適當(dāng)增加水浴時間，并可將水浴溫度降低；對于果實(shí)、 種子類以及動物藥材類 的DNA提取可以參考中國藥典。1.2.3 PCR擴(kuò)增植物類中藥材及其基原物種擴(kuò)增ITS2或psbA-trnH序列，動物 類中藥材及其基原物種擴(kuò)增COI序列，通用引物及擴(kuò)增條件如下，具體如有改變見各 藥材項(xiàng)下。ITS2序列擴(kuò)增正向引物ITS2F :5 -ATGCGATACTTGGTGTGAAT- 3'反 向弓I物 ITS3R : 5 -GACGCTTCTCCAGACTACAAT- 3'。psbA-trnH 序列擴(kuò)增正向 引物psbAF :5'-GTTATGCATGAAC

7、GTAATGCTC- 3'反向引物 trnHR :5 -' CGCGCATGGTGGATTCACAATCC- 3' COI 序列擴(kuò)增正向弓I物 HCO2198:5'- TAAACTTTCAGGGTGACCAAAAAATCA- 3'反向引物 LCO1490: 5。 GGTCAACAAATCATAAAGATATTGG- 3。PCR反應(yīng)體系以25卩為參照，包括1滬CR緩沖液（不含Mg 2+Cl 2,2.0 mmolL-1Mg 2+Cl 2, 0.2 mmol L-1 dNTPs,0.1 mmol L-彳引物對,模板 DNA , 1.0 U Taq DNA聚合酶

8、，加滅菌雙 蒸水至25卩L設(shè)置未加模板DNA的PCR反應(yīng)為陰性 對照。ITS2 序列擴(kuò)增程序：94 C 5 min ; 94 C 30 s , 56 C 30 s , 72 C 45 s , 40個循環(huán)； 72 C 10 min。 psbA-trnH 序列擴(kuò)增程序:94 C 5 min ; 94 C 1 min , 55 C 1 min , 72 C 1.5 min , 30 個循環(huán)；72 C 7 min。COI 序列擴(kuò)增程序:94 C 1 min ; 94 C 1 min , 45 C 1.5 min, 72 C 1.5 min, 5 個循環(huán);94 C 1 min, 50 C 1.5 min

9、, 72 C 1 min, 35個循環(huán);72 C 5 min。1.2.4 PCR產(chǎn)物檢測采取瓊脂糖凝膠電泳方法檢測 PCR產(chǎn)物。電泳后，PCR產(chǎn) 物應(yīng)在相 應(yīng)的DNA條形碼序列長度位置出現(xiàn)一條目的條帶，陰性對照應(yīng)無條帶。1.2.5測序有PCR擴(kuò)增條帶的樣品送測序公司進(jìn)行 DNA序列測定。使用DNA 測序儀對目的條帶進(jìn)行雙向測序，PCR擴(kuò)增引物作為測序引物，測序原理同Sanger測序 法。1.2.6中藥材DNA條形碼序列獲得 主要包括序列拼接和序列質(zhì)量與方向2個方面的內(nèi)容。對雙向測序峰圖應(yīng)用專業(yè)軟件進(jìn)行序列拼接，去除引物區(qū)，獲得相應(yīng)的 DNA序列。為確保DNA條形碼序列的可靠性，需對測序質(zhì)量進(jìn)行

10、評估，去除測序 結(jié)果兩端的低質(zhì)量序列。序列方向應(yīng)與PCR擴(kuò)增正向引物方向一致。1.2.7結(jié)果判定將獲得的序列在中藥材 DNA條形碼鑒定系統(tǒng)（http :/ 或 GenBank 數(shù)據(jù)庫中應(yīng)用 BLAST （basic local alignment search tool方法進(jìn)行結(jié)果判定，結(jié)果中相似性最高的序列對應(yīng)物種為查詢序列最接 近的物種。如果植物類藥材ITS2序列比對后最接近的物種為真菌，則需采用 psbA-trnH序列重復(fù)上述方法流程。中藥材DNA條形碼鑒定數(shù)據(jù)庫系統(tǒng)及GenBank數(shù)據(jù)庫BLAST鑒定系統(tǒng)操作流程見下。登錄中藥材DNA條形碼鑒定數(shù)據(jù)庫系統(tǒng)網(wǎng)站，在主頁點(diǎn)擊物種鑒定”根據(jù)

11、需鑒定物種的種類，選擇對應(yīng)的鑒定數(shù)據(jù)庫，如點(diǎn)擊植物類藥材鑒定（ITS/ITS2。將 需要鑒定的物種序列復(fù)制后粘貼到 植物類藥材鑒定（ITS/ITS2 的序列輸入欄，點(diǎn)擊提交”按鈕，進(jìn)行BLAST鑒定。在BLAST比對結(jié)果中,在序列比對信息”欄查看 相關(guān)比對信息，在物種鑒定結(jié)果”欄顯示與所查詢序列最接近的物種。登錄 Ge nBa nk 數(shù)據(jù)庫 BLAST 鑒定系統(tǒng)（http :/blast, ncbi. nlm. /Blast.cgi , 在 Basic BLAST 中選擇 nucleotide blast在 Enter Query Sequence粘貼需要鑒定的 序列（Query

12、 （建議用 fasta 格式。在 Choose Search Se中選 others （nr etc.數(shù)據(jù)庫，點(diǎn) 擊左下角BLAST。在BLAST結(jié)果中查看序列相似性最高（max ide nt的物種，一般 為與查詢序列最接近的物種。1.3方法學(xué)驗(yàn)證1.3.1方法適用性考察 采用DNA條形碼分子鑒定法對20批次以上藥材或基原 物種進(jìn)行測定,積累數(shù)據(jù)，確定種內(nèi)序列變異大小，保證該測定方法的適用性。1.3.2精密度考察 主要分為重復(fù)性考察、中間精密度考察及重現(xiàn)性考察。重復(fù)性,至少用3批供試品，每批3次或同批供試品進(jìn)行6次測定試驗(yàn)后對結(jié)果 進(jìn)行評價。實(shí)驗(yàn)結(jié)果判定應(yīng)基本一致。中間精密度，考察實(shí)驗(yàn)室內(nèi)部條

13、件改變（如不同人員、不同儀器、不同工作日 和實(shí)驗(yàn)時間對測定結(jié)果的影響，至少應(yīng)對同實(shí)驗(yàn)室不同操作人員的結(jié)果進(jìn)行考察。重現(xiàn)性，實(shí)驗(yàn)結(jié)果在3家以上實(shí)驗(yàn)室能夠重現(xiàn)，相同樣品在不同實(shí)驗(yàn)室獲得DNA 條形碼序列應(yīng)相同。1.3.3影響因素考察 考察DNA條形碼分子鑒定法的影響因素,包括DNA提取 （樣品量、水浴溫度和水浴時間、PCR條件（變性時間、退火溫度與時間及延伸 時間及產(chǎn)物純化（考察不同純化試劑盒，保證實(shí)驗(yàn)方法的準(zhǔn)確性。1.3.4基原物種對比驗(yàn)證 以分類學(xué)家確認(rèn)的基原物種葉片為對象，采用該方法獲 得DNA條形碼數(shù)據(jù)，與相應(yīng)藥材產(chǎn)生的DNA條形碼數(shù)據(jù)進(jìn)行對比，避免內(nèi)生真菌等 污染，保證結(jié)果準(zhǔn)確性。1.4

14、中藥材DNA條形碼分子鑒定核心序列選擇依據(jù)1.4.1植物類中藥材ITS2和psbA-trnH條形碼的選擇依據(jù)DNA條形碼研究的首要任務(wù)是確定通用DNA條形碼序列。在植物界，研究者主要從葉綠體基因組和 核基因組中尋找理想 的DNA條形碼，曾提出諸多候選條形碼序列或組合。2009年,國際條形碼協(xié)會植物工作組 對來自550個物種907個樣品的7個序列（rbcL , matK , rpoCI, ropB , psbA-trnH , psbK-psbI , atpF-atpH 進(jìn)行了分析比較，建議將 rbcL+matK 組合作為植物通用條形碼10。然而,植物工作組認(rèn)為該組合還遠(yuǎn)不夠完美，尋找植 物DNA

15、條形碼的工作還沒有結(jié)束2。同年,在墨西哥召開的第三屆國際條形碼大 會上與會代表一致認(rèn)為應(yīng)對ITS/ITS2和psbA-trnH序列進(jìn)行進(jìn)一步評估。2010年,陳士林等3分析比較了 7個候選DNA條形碼（psbA-trnH , matK, rbcL, rpoC1, ycf5, ITS2, ITS。研究對象為藥用植物及其密切相關(guān)物種。研究結(jié)果表明ITS2表現(xiàn)突出,在物種水平的鑒定效率高達(dá) 92.7%。因此，陳士林等建議將ITS2作 為藥用植物標(biāo)準(zhǔn)DNA條形碼。鑒于研究中psbA-trnH僅次于ITS2序列，也具有較 好鑒定能力，因而推薦其作為ITS2的輔助條形碼。Yao等4基于大樣本量分析證 實(shí)I

16、TS2序列可以作為植物物種鑒別的通 用條形碼，并以ITS2序列為基礎(chǔ)初步建立 了藥用植物 DNA條形碼數(shù)據(jù)庫網(wǎng)絡(luò)查詢系統(tǒng) （http : /。2011年,中國植物條形碼工作組（Chinese Plant BOL Group對來自42目75科141屬 1 757物種的6 286樣本的rbcL , matK , psbA-trnH , ITS序列進(jìn)行研究,其結(jié)果進(jìn)一 步驗(yàn)證了 ITS2的鑒定能力,建議ITS/ITS2應(yīng)成為種子植物的核 心條形碼,當(dāng)ITS難 以擴(kuò)增和測序時，ITS2可以有效地彌補(bǔ)該缺陷。陳士林等提出建立以ITS2 為核心、psb

17、A-trnH為補(bǔ)充序列的植物類藥材 DNA條形碼鑒定體系。1.4.2動物類中藥材COI和ITS2條形碼的選擇依據(jù) 在動物界,Herbert等于 2003年首次提出將一段長度約為650 bp的COI基因序列作為動物條形碼鑒定的基 礎(chǔ)片段7。同年,Herbert等8對11門13 320個物種的線粒體細(xì)胞色素c氧化酶 亞基I （cytochrome c oxidase sub unit I , COI基因序列進(jìn)行比較分析，結(jié)果表明所研究 物種的種間遺傳距離在0.0%53.7%，物種種間遺傳距離平均可達(dá)到 11.3%, 79%的物種種間遺傳距離均大 于8%。以上研究結(jié)果進(jìn)一步支撐了前期的結(jié)論。隨后，C

18、OI基因特定片段的鑒定能力在鳥類、魚類、節(jié)肢動 物、哺乳動物等具體動物類群的鑒定研究中均獲得了 印證，因此研究者一致建議將COI序列作為動物的通用條形碼?；诖罅壳捌谘芯拷Y(jié)果，中藥材DNA條形碼分子鑒定法選用ITS2和psbA-trnH作為植物類藥材 的核心條形碼，COI和ITS2作為動物類中藥材的核心條形碼。1.5中藥材DNA提取方法的確定1.5.1植物基因組DNA提取方法的確定依據(jù) 植物基因組DNA提取 方法較多，常用基于CTAB原理的試劑盒法和改良的 CTAB法。應(yīng)用不同公司植 物基因組DNA提取試劑盒等提取 中藥材基因組DNA，結(jié)果表明試劑盒法適用于 中藥材基因組DNA的提取。由于中藥

19、材所含成 分復(fù)雜，可針對不同入藥部位改進(jìn) DNA提取試劑盒方法10 9。針對根及根莖、花、果實(shí)、種子和皮類等藥材質(zhì) 地，確定各自合適的樣品量。通過對 2 373份藥材樣品的DNA提取實(shí)驗(yàn)，葉類、 花類藥材取樣量約1020 Mg，根類、果實(shí)類、種子類、皮類藥材約2040 Mg。某些藥材需要增加樣品量，如沉香藥材DNA提取時取樣量為80 Mg。因此，通過對大量樣品DNA提取的研究，確定中藥材 DNA條形碼鑒定法取樣量 為 10100 Mg。通過對不同入藥部位實(shí)驗(yàn)不同水浴時間梯度（20，30，40，50，60 min，3 h及水浴過夜），發(fā)現(xiàn)葉類藥材水浴時間一般在 2040 min，根類藥材在 60

20、 min3 h, 些質(zhì)地堅(jiān)硬 的藥材可56 C水浴過夜。1.5.2動物類藥材DNA提取 方法的確定依據(jù) 動物基因組DNA的提取采用血液/細(xì)胞、組 織基因組DNA提取 試劑盒。采用天根生化科技（北京）有限公司的血液 /細(xì)胞、組織基因組DNA提取 試劑盒（基于SDS法原理）提取動物藥材的 DNA，結(jié)果表明試劑盒法適用于動物 基因組DNA的提取，根據(jù)動物藥材藥用部位的不同（肌肉、角甲、殼類），選用不用的DNA提取試劑盒。動物類藥材DNA提取前，應(yīng)針對不同取樣部位對 樣品進(jìn)行不同的前期處理。 肌肉類動物 藥材需進(jìn)行紫外殺菌處理并充分搗碎；骨 甲類藥材由于DNA含量稍少，應(yīng)適量增加取樣量，并充分研磨粉碎

21、； 含有脂類較多的動物內(nèi)臟器官可先用不含蛋白酶 K和SDS的緩沖液浸泡藥 材，并試劑盒消 化緩沖液中適量增加SDS，以利于脫去脂類；分泌物類動物藥材（如膽汁），在消化前同樣需進(jìn)行必要的處理。如干蛇膽用雙蒸水浸泡6 h,其間更換水?dāng)?shù)次，使其軟化 并洗去表面污染物；乙醇浸泡蛇膽，用流水浸泡1 d,以除去乙醇及表面污染物11 2+ 2+ 2+ 2+。目前多選用試劑盒法提取DNA，方法相對簡潔、易控，而且在大多數(shù)動物藥材中都 獲得了較為理想 的結(jié)果。1.6確定可靠的DNA條形碼鑒定數(shù)據(jù)庫DNA條形碼數(shù) 據(jù)庫的可靠性是中藥材DNA條形碼鑒定的關(guān)鍵。目前已有的公共數(shù)據(jù)庫，如Gen Ba nk, EMBL等

22、，由世界各地的研究者進(jìn)行獨(dú)立提交，缺乏相互之間的驗(yàn)證， 數(shù)據(jù)質(zhì)量參差不齊，中藥材DNA序列數(shù)據(jù)的系統(tǒng)性和代表性尚顯不足。為保證 中藥材DNA條形碼數(shù)據(jù)庫的可靠性，首先需要在基原上保證物種鑒定的可靠性， 然后采用嚴(yán)格的序列校對機(jī)制確保獲得序列和基原樣品的一致性，最后規(guī)范管理數(shù)據(jù)庫，確保數(shù)據(jù)庫的安全維護(hù)和有序增減。二中藥材DNA條形碼分子鑒定法指導(dǎo)原則在中國藥典 （2015年版）中的應(yīng)用2.1蘄蛇飲片的鑒別（聚合酶 鏈?zhǔn)椒磻?yīng)法）2.1.1模板DNA提取取本品0.5g,置乳缽中，加液氮適量，充分 研磨使成粉末，取O. lg，置1.5ml離心管中，加人消化液275m1細(xì)胞核裂解液 200卩l(xiāng),0.5m

23、ol/L乙二胺四醋酸二鈉 溶液50ml，蛋白酶K（20mg/ml20卩，1 RNA酶溶 液5卩l(xiāng)在55°水浴保溫1小時，加人裂解緩沖液250卩1混勻，加到D N A 純化柱中，離心（轉(zhuǎn)速為每分鐘 10000轉(zhuǎn)）3分鐘；棄去過濾液，加入洗脫液 8OO l5mol/l 醋酸鉀溶液 26 卩 I, 1mol/LTris-鹽酸溶液（pH7.518ml,0.5mol/L 乙二 胺四醋酸二鈉溶液（pH8.030,無水乙醇480卩1滅菌雙蒸水273卩I,離心（轉(zhuǎn)速 為每分鐘10000轉(zhuǎn)）1分鐘；棄去過濾液，用上述洗脫液反復(fù)洗脫3次，每次離 心（轉(zhuǎn)速為每分鐘10000轉(zhuǎn)）1分鐘;棄去過濾液，再離心2

24、分鐘，將DN A純化柱 轉(zhuǎn)移人另一離心管中，加入無菌雙蒸水 100卩l(xiāng)室溫放置2分鐘后，離心（轉(zhuǎn)速 為每分鐘10 000轉(zhuǎn)）2分鐘，取上清液，作為供試品溶液，置零下 20°保存?zhèn)?用。另取蘄蛇對照藥材0.5g,同法制成對照藥材模板 DNA溶液.2.1.2 PCR反應(yīng)鑒 別弓I物：5' GGCAATTCACTACACAGCCAA- CACAACT',和 5' CCATA GTCAGGTGGTTAGTGATAC 3 。PCR反應(yīng)體系：在200卩離心管中進(jìn)行，反應(yīng) 總體積為25m1,反應(yīng)體系包括10*PCR緩沖液2.5卩，1 dNTP（2. 5mmol/L2卩1鑒

25、別引物（10卩mol/L各 0. 5卩，1高保真TaqDNA聚合酶（5U/卩10.2卩模板0.5 士 無菌雙蒸水18.8卩。將離心管 置PCR儀，PCR反應(yīng)參數(shù)：95°預(yù)變性5分鐘， 循環(huán)反應(yīng)3 0次（95 °30秒，63°45秒）,延伸（72°C5分鐘。2.1.3電泳檢測 照瓊脂糖凝膠電泳法方法2（通則0541，膠濃度為1 %，膠中加入核酸凝膠染色劑 GelRed;供試品與對照藥材PCR反應(yīng)溶液的上樣量分別為8卩1 DNA分子量標(biāo)記上樣量為2卩l(xiāng)（0. 5卩g/電泳結(jié)束后，取凝膠片在凝膠成像儀上或紫外透 射儀上檢 視。供試品凝膠電泳圖譜中，在與對照藥材

26、凝膠電泳圖譜相應(yīng)的位置 上，在300? 400bp應(yīng)有單一 D N A條帶。2.2川貝母藥材的鑒別（聚合酶鏈?zhǔn)椒?應(yīng)-限制性內(nèi)切酶長度多態(tài)性方法）2.2.1模板D N A提取取本品0.lg,依次用75 %乙醉1ml、滅菌超純水1ml淸洗，吸干表 面水分，置乳缽中研磨成極細(xì)粉。取 20mg,置1.5ml離心管中，用新型廣譜植物基因組 D N A快速提取試劑盒提取 DNA 加人緩沖液API 400卩和RNA酶溶液（10mg/ml4卩渦漩振蕩，65 C水浴加熱 10分鐘，加入緩沖液AP2 130卩，充分混勻，冰浴冷卻5分鐘，離心（轉(zhuǎn) 速為每 分鐘14000轉(zhuǎn)）1 0分鐘；吸取上淸液轉(zhuǎn)移入另一離心管中

27、，加人1.5倍體積的緩沖液A P 3 / E,混勻，加到吸附柱上，離心（轉(zhuǎn)速為每分鐘13000轉(zhuǎn)）1分鐘，棄去過濾液，加入漂洗液700卩1離心（轉(zhuǎn)速為每分鐘12000轉(zhuǎn)）30秒，棄去過濾 液;再加入溧洗液500卩，1離心（轉(zhuǎn)速為每分鐘12000轉(zhuǎn)30秒，棄去過濾液；再離 心（轉(zhuǎn)速為每分鐘13000轉(zhuǎn)）2分鐘，取出吸附柱，放入另一離心管中，加入 50卩 1洗脫緩沖液，室溫放置3? 5分鐘，離心（轉(zhuǎn)速為每分鐘12000轉(zhuǎn)）1分鐘，將洗 脫液再加入吸附柱中，室溫放置 2分鐘，離心（轉(zhuǎn)速為每分鐘12000轉(zhuǎn)）1分鐘, 取洗脫液，作為供試品溶液，置 4C冰箱中備用。另 取川貝母對照藥材O.lg，同 法制

28、成對照藥材模板 DNA溶液。2.2.2 PCR-RFLP反應(yīng)鑒別引物：5'CGTAACAAGGTTT- CCGTAGGTGAA ' 和 5' GCTA CGTTCTTCATCGAT 3PCR反應(yīng)體系：在200卩離心管中進(jìn)行，反應(yīng)總體積為 30卩1反應(yīng)體系包括10* P C R緩沖液3卩1二氧化鎂（25mmol/L2.4卩l(xiāng), dNTP（10mmol/L0.6鑒別引物（30卩mol/L各 0.5卩,I髙保真Taq DAN聚合酶（5U/y l0.2 模板1卩J無菌超純 水21.8m1。將離心管置PCR儀，P C R反應(yīng)參數(shù)：95°C預(yù)變性4分鐘，循環(huán)反 應(yīng) 3 0

29、 次（95°C 3 0 秒, 5 5? 58°C3 0 秒, 72°C 3 0 秒） ，72C延伸 5 分鐘。取 PCR 反應(yīng)液，置500卩離心管中，進(jìn)行酶切反應(yīng)，反應(yīng)總體積為20卩J反應(yīng)體系包括10*酶切緩 沖液2卩1,PC阪應(yīng)液6卩J Smal（10U/卩10.5,卩無菌超純水11.5卩I,酶切反應(yīng)在30 °C水浴反應(yīng)2小時。另取無菌超純水，同法上述P C R - R F L P反應(yīng)操作，作為空白對照。223電泳檢測 照瓊脂糖凝膠電泳法(通則0541，膠濃度 為1.5 %，膠中加入核酸凝膠染色劑GelRed;供試品與對照藥材酶切反應(yīng)溶液的上 樣量分別

30、為8卩1 ,DNA分子量標(biāo)記上樣量為l卩1(0.5卩g/電泳結(jié)束后，取凝膠 片在凝膠成像儀上或紫外透射儀上檢視。供試品凝膠電泳圖譜中，在與對照藥材凝膠電泳圖譜相應(yīng)的位置上，在100? 250bp應(yīng)有兩 條DNA條帶，空白對照無條帶。參考文獻(xiàn)1中國中藥雜志2013年第02期.2 Thomas C. Plant bar code soon to become realityJ. Scienee 2009, 325: 526. 3 Chen S L， Yao H， Han J P， et al. Validation of the ITS2 region as a novel DNA barcode for identifying medici nal pla nt speciesJ. PLoS ONE 2010, 5: e8613. 4