rBCG-IL-2對(duì)小鼠腫瘤局部和全身免疫功能的影響

1、rBCG-IL-2對(duì)小鼠腫瘤局部和全身免疫功能的影響摘要目的： 將rBCG-IL-2應(yīng)用于動(dòng)物實(shí)驗(yàn)，觀察其對(duì)腫瘤生長和免疫功能的影響。方法： 采用基因工程技術(shù)構(gòu)建rBCG-IL-2，用黑色素瘤細(xì)胞株B16接種于小鼠小腿外側(cè)皮下，再用rBCG-IL-2局部治療，2周后處死小鼠，用ELISA法檢測(cè)脾淋巴細(xì)胞培養(yǎng)上清中IL-2，IFN-和GM-CSF的含量和肉眼及鏡下觀察腫瘤生長和局部免疫效應(yīng)細(xì)胞浸潤情況。結(jié)果： rBCG-IL-2對(duì)腫瘤生長的抑制作用明顯優(yōu)于對(duì)照組，腫瘤細(xì)胞周圍有較多的巨噬細(xì)胞和淋巴細(xì)胞浸潤，腫瘤細(xì)胞減少。同時(shí)rBCG-IL-2還能誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生IL-2和IFN-。結(jié)論： rBCG-

2、IL-2能通過誘導(dǎo)局部免疫效應(yīng)細(xì)胞浸潤和機(jī)體細(xì)胞因子的產(chǎn)生，抑制腫瘤生長，甚至清除腫瘤細(xì)胞。關(guān)鍵詞重組卡介苗； 腫瘤； 免疫中國書資料分類法分類號(hào)Systemic and Local Effects of rBCG-IL-2 on Immunity in Tumor-Bearing MiceZeng Xing， Mei Yuping, Huang Yu, Zhang Guolai, Tan Min, Zhang Weibin(The Second Affiliated Hospital of Guangzhou University of TCM. Guangzhou 510120)Abstr

3、actObjective: To investigate the effects of rBCG-IL-2 on antitumor immunity of the host. Methods: Gene engineering technology was adopted to construct rBCG-IL-2. Melanoma cells line B16 was inoculated by hypodermic injection. IL-2, IFN- and GM-CSF in cultivated supernatants of lymphocytes isolated f

4、rom spleen were determined by ELISA after treatment with rBCG-IL-2 two weeks later, the extention of tumor and local immune response cells were observed by pathologic methods. Results: The speed of tumor growth of rBCG-IL-2 group was more suppressed dramatically than that of the control group, the n

5、umber of infiltrating lymphocytes and macrophages increased and the number of tumor cells decreased after treatment with rBCG-IL-2. rBCG-IL-2 could induced the host to express IL-2 and IFN-. Conclusion: rBCG-IL-2 can suppress even dispel the extension of tumor through inducing the host to express cy

6、tokine and enhance the number of immune response cells.Key wordsrecombinant BCG； tumor； immunity 近年來,BCG聯(lián)合細(xì)胞因子用于膀胱腫瘤灌注，比單用BCG療效更佳1但聯(lián)合用細(xì)胞因子存在半衰期短，用量大及毒性強(qiáng)的缺點(diǎn)。研制表達(dá)細(xì)胞因子的重組卡介苗可望提高療效是目前研究的熱點(diǎn)。本研究把IL-2基因摻入BCG得到rBCG-IL-2，這種rBCG-IL-2就可在適當(dāng)時(shí)間和部位產(chǎn)生IL-2，達(dá)到聯(lián)合治療的目的。1材料與方法11材料BCG為上海生物制品所產(chǎn)品。B16細(xì)胞株購自武漢大學(xué)ATCC中心。分枝桿菌培養(yǎng)基

7、MIDDLEBROOK7H9和ADC營養(yǎng)液購自美國DIFFICO公司。DMEM和RPMI 1640培養(yǎng)基及胎牛血清購自美國PROMEGA公司。IL-2，MG-CSF，IFN- ELISA試劑盒購自深圳晶美生物工程有限公司，美國ENDOGEN公司和法國DIACLONE RESEARCH公司。12動(dòng)物NIH小鼠，體重2832 g，購自中山醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物中心。13重組卡介苗的構(gòu)建BCG菌種接種到MIDDLEBROOK7H9培養(yǎng)基中，培養(yǎng)至OD600約0.50.8時(shí)停止培養(yǎng)，冰浴1.5 h后用10%甘油洗滌2次，再分別加入PZS和PZS質(zhì)粒DNA 15 g。在電壓2.5 KV、電流25 mA、電阻200

8、 條件下進(jìn)行電穿孔轉(zhuǎn)化，在含卡那霉素培養(yǎng)基平板上篩選轉(zhuǎn)化子和鑒定，最后獲得rBCG-IL-22和rBCG菌株。14動(dòng)物接種及脾淋巴細(xì)胞上清的制備體外培養(yǎng)的黑色素瘤細(xì)胞株，經(jīng)PBS調(diào)整濃度至5105/ml，取200 l接種于小鼠左大腿外側(cè)皮下，并在同部位分別注射rBCG-IL-2，rBCG和PBS 10 l（rBCG-IL-2和rBCG分別用PBS調(diào)整濃度至0.1 mg/l)。以后每3天補(bǔ)注射1次，第2周處死小鼠，測(cè)量腫瘤的大小，按公式：（長經(jīng)+短經(jīng)）/23，同時(shí)在無菌條件下，取出小鼠脾臟，制備單細(xì)胞懸液。用含10%胎牛血清的1640培養(yǎng)基培養(yǎng)，同時(shí)每瓶加PHA 30 g，置37， 5%CO2孵

9、箱培養(yǎng)，72 h收集上清，置-70冰箱保存待測(cè)。15脾淋巴細(xì)胞培養(yǎng)上清中IL-2和IFN-含量的測(cè)定取-70保存的淋巴細(xì)胞培養(yǎng)上清，離心3 000 r/min 4 5 min。取已包被抗小鼠IL-2單抗的酶標(biāo)板，除空白孔外，每孔加入培養(yǎng)上清和不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)品（31，25， 62.5, 125, 250, 500， 1 000 pg/ml）100 l至相應(yīng)孔中,零孔加標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液100 l，對(duì)照孔加細(xì)胞培養(yǎng)基100 l，室溫2 h后洗板3次，除空白孔外，每孔加生物素化抗體100 l，室溫1h后洗板3次，除空白孔外，每孔加HRP標(biāo)記酶結(jié)合物100 l，室溫30 min后洗板3次，若測(cè)定IL-2含量

10、加底物A，B液各50 l，測(cè)定IFN-加新鮮配制TMB底物100 l，避光室溫反應(yīng)10 min后加2N H2SO4終止顯色反應(yīng)，即刻用450 nm波長測(cè)定其OD值，以標(biāo)準(zhǔn)濃度作橫坐標(biāo)，以減去空白孔的OD值為縱坐標(biāo)，用計(jì)算機(jī)四參數(shù)法擬繪出標(biāo)準(zhǔn)曲線。16脾淋巴細(xì)胞培養(yǎng)上清中GM-CSF含量的測(cè)定將反應(yīng)試劑50 l加到已包被抗小鼠GM-CSF單抗的酶標(biāo)板孔內(nèi)，加入50 l不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)品（0， 10， 50， 250 pg/ml）及培養(yǎng)上清到相應(yīng)孔內(nèi)。標(biāo)準(zhǔn)品以培養(yǎng)基稀釋，37水浴2 h，洗板5次拍干，加入100 l交聯(lián)試劑，37水浴1 h，再洗板5次，加TMB底物液100 l暗處室溫反應(yīng)30 min

11、，加入100 l終止液終止反應(yīng)，在450 nm和550 nm處讀取OD值，以標(biāo)準(zhǔn)品濃度為橫坐標(biāo)，450 nm處OD值減去550 nm處OD值為縱坐標(biāo)，以四參數(shù)法在計(jì)算機(jī)上擬繪出標(biāo)準(zhǔn)曲線。2結(jié)果21rBCG-IL-2和rBCG對(duì)小鼠腫瘤生長抑制作用處死小鼠后，分別對(duì)注射了rBCG-IL-2，rBCG和PBS組小鼠的瘤體進(jìn)行測(cè)量。發(fā)現(xiàn)rBCG-IL-2和rBCG組的腫瘤大小與PBS組比較，腫瘤生長顯然受到一定程度的抑制，特別是注射rBCG-IL-2組抑制腫瘤生長更明顯。病理切片也證明rBCG-IL-2和rBCG的癌細(xì)胞明顯少于對(duì)照組(見1)。1rBCG-IL-2和rBCG對(duì)腫瘤局部免疫細(xì)胞的誘導(dǎo)作

12、用(HE染色1025)Fig.1Effect of rBCG-IL-2 and rBCG on local infiltrating immune response cells of tumorA： rBCG-IL-2; B: rBCG; C: Control22rBCG-IL-2，rBCG對(duì)腫瘤局部免疫細(xì)胞的誘導(dǎo)作用腫瘤局部病理切片觀察發(fā)現(xiàn)，rBCG-IL-2組的腫瘤細(xì)胞周圍有明顯的吞噬細(xì)胞和大量淋巴細(xì)胞浸潤，形成淋巴細(xì)胞巢，腫瘤細(xì)胞減少，甚致消失，并在其周圍形成多層的長梭形細(xì)胞（1A），rBCG組吞噬細(xì)胞浸潤不明顯，但有大量淋巴細(xì)胞浸潤，腫瘤細(xì)胞存在，也有長梭形細(xì)胞形成（1B），對(duì)照組以腫

13、瘤細(xì)胞為主，有少量淋巴細(xì)胞浸潤，沒有長梭形細(xì)胞形成（1C）。23rBCG-IL-2和rBCG對(duì)小鼠脾細(xì)胞培養(yǎng)上清中IL-2，IFN-和GM-CSF產(chǎn)生的影響處死小鼠后，無菌條件下取脾細(xì)胞培養(yǎng)，并檢測(cè)培養(yǎng)上清中IL-2，IFN-和GM-CSF的含量，分別對(duì)每個(gè)檢測(cè)指標(biāo)中的3組比較及兩兩比較，采用多組資料的秩和檢驗(yàn)及q檢驗(yàn)，當(dāng)不同檢測(cè)指標(biāo)的各實(shí)驗(yàn)組的秩和檢驗(yàn)差異有顯著性，經(jīng)兩兩比較，結(jié)果見表1。表1rBCG-IL-2和rBCG對(duì)小鼠脾細(xì)胞培養(yǎng)上清中IL-2，IFN-和GM-CSF產(chǎn)生的影響Tab.1Effect of rBCG-IL-2 and rBCG on the production of

14、IL-2, IFN- and GM-CSFin supernatants of cultured lymphocytes separated from spleens of the miceCytokinesControlrBCGrBCG-IL-2HCPnminmaxnminmaxnminmaxmIL-2(A)9108279541 21294121 103mIFN-(B)9313539311 0009451 000mMG-CSF(C)90902509250 P0.05 q=4.0106, A1 with A3 compared； P0.01 q=4.1522, A2 with A3 compa

15、red； P0.01 q=4.8702, B1 with B2 compared； P0.01 q=4.1576, B1 with B3 compared； P0.01 q=3.8712, C1 with C2 compared. 3討論BCG治療膀胱癌可能的主要機(jī)制是誘導(dǎo)TH1型應(yīng)答，產(chǎn)生IL-2和IFN-。研究發(fā)現(xiàn)，BCG聯(lián)合IL-2或IFN-治療淺表型膀胱癌，可提高療效4。若能把這些細(xì)胞因子基因摻入到BCG，構(gòu)建成重組BCG，作為一種免疫治療的新工具5，就能保證這些細(xì)胞因子在適當(dāng)?shù)牟课划a(chǎn)生，從而誘導(dǎo)機(jī)體的體液免疫和細(xì)胞免疫，已有研究證實(shí)此法的可行性6。本研究應(yīng)用基因工程技術(shù)獲得能表達(dá)IL

16、-2和不含IL-2基因片段的兩株重組BCG即rBCG-IL-2和rBCG。并用這兩株重組BCG局部治療荷瘤小鼠，從局部免疫效應(yīng)細(xì)胞浸潤分析，rBCG-IL-2和rBCG組均較對(duì)照組有大量的淋巴細(xì)胞浸潤。rBCG-IL-2組的腫瘤細(xì)胞周圍有較多巨噬細(xì)胞浸潤，而rBCG組較少。推測(cè)其機(jī)理是被巨噬細(xì)胞吞噬處理重組BCG抗原后，釋放TNF，IL-6，IL-1等，刺激輔助性TH，釋放IL-2和IFN-，刺激殺傷性T細(xì)胞即BAK細(xì)胞7。起到抗腫瘤的作用，而能表達(dá)IL-2的rBCG-IL-2，除上述激活途徑外，還能直接激活T細(xì)胞和巨噬細(xì)胞，使巨噬細(xì)胞和淋巴細(xì)胞都增加，也證明了細(xì)胞因子抗腫瘤的主要作用機(jī)制是通

17、過誘導(dǎo)局部免疫反應(yīng)來達(dá)到治療目的。另外，每間隔幾天給藥，還有利于存在于腫瘤局部的重組BCG特異性記憶T細(xì)胞重新啟動(dòng)免疫，更有效殺傷腫瘤細(xì)胞，從而出現(xiàn)rBCG-IL-2組和rBCG組的腫瘤大小明顯小于對(duì)照組，鏡下觀察也發(fā)現(xiàn)癌細(xì)胞明顯減少，甚至消失。此外，還發(fā)現(xiàn)注射這兩株重組BCG，在癌細(xì)胞周圍形成多層的長梭形細(xì)胞，對(duì)照組沒有此現(xiàn)象，但它是由重組BCG對(duì)癌細(xì)胞的作用所致，還是通過免疫細(xì)胞的間接作用，有待進(jìn)一步探討，這種現(xiàn)象可能與限制腫瘤轉(zhuǎn)移和抑制或約束腫瘤生長有關(guān)。雖然本實(shí)驗(yàn)是一種局部治療，但檢測(cè)的IL-2，IFN-和GM-CSF細(xì)胞因子水平來看，局部治療也能誘導(dǎo)全身的免疫反應(yīng)。rBCG-IL-2

18、組測(cè)得的IL-2和IFN-含量均高于對(duì)照組，P0.01,而對(duì)GM-CSF的產(chǎn)生無明顯影響。研究表明，rBCG-IL-2除有類似BCG刺激局部免疫反應(yīng)外，還能利用在局部表達(dá)的IL-2，繞過巨噬細(xì)胞處理抗原的過程，直接激活殺傷細(xì)胞，同時(shí)還能誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生IL-2和IFN-因子協(xié)同抗癌作用。本課題國家自然科學(xué)基金(39870944),國家中醫(yī)藥管理局編號(hào)中醫(yī)藥科基(1977)7號(hào)和廣東省中醫(yī)藥管理局奧中醫(yī)(1998)076號(hào)資助曾星,女,40歲,研究員,醫(yī)學(xué)博士,主要從事腫瘤生物治療的基礎(chǔ)研究.曾星（廣州中醫(yī)藥大學(xué)第二臨床醫(yī)學(xué)院中心實(shí)驗(yàn)室廣州510120）梅玉屏（廣州中醫(yī)藥大學(xué)第二臨床醫(yī)學(xué)院中心實(shí)驗(yàn)室

19、廣州510120）黃羽（廣州中醫(yī)藥大學(xué)第二臨床醫(yī)學(xué)院中心實(shí)驗(yàn)室廣州510120）章國來（廣州中醫(yī)藥大學(xué)第二臨床醫(yī)學(xué)院中心實(shí)驗(yàn)室廣州510120）譚敏（廣州中醫(yī)藥大學(xué)第二臨床醫(yī)學(xué)院中心實(shí)驗(yàn)室廣州510120）張維彬（廣州中醫(yī)藥大學(xué)第二臨床醫(yī)學(xué)院中心實(shí)驗(yàn)室廣州510120）參 考 文 獻(xiàn)1，史久華. 膀胱癌的卡介苗免疫治療. 國外醫(yī)學(xué)*預(yù)防*診斷*治療用生物制品分冊(cè)， 2000， 23（1）： 72，曾 星， 楊 明， 黃 羽， 等. 重組人白介素2卡介苗的構(gòu)建及表達(dá). 廣州中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào)， 1999， 16（1）： 723，曹雪濤， 章衛(wèi)平， 鄭玲莉， 等. 白細(xì)胞介素2基因轉(zhuǎn)移的腫瘤細(xì)胞克隆的建立及其體內(nèi)外生長特性的研究. 中國免疫學(xué)雜志， 1994， 10（5）： 2844，F(xiàn)ujimoto T, ODonnell MA, Szilvasi A， et al. Bacillus calmette-guerin plus interleukin-2 and/or granulocyte/macrophage-colony-stimulating factor enhances immunocompetent cell production of interferon-, which inhibits