p73基因多態(tài)性及蛋白表達(dá)與結(jié)直腸腫瘤關(guān)系的研究

1、p73基因多態(tài)性及蛋白表達(dá)與結(jié)直腸腫瘤關(guān)系的研究    【摘要】  目的 探討p73基因的多態(tài)性及蛋白表達(dá)與結(jié)直腸腫瘤發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)的關(guān)系。 方法 血液標(biāo)本分為3組，包括結(jié)直腸腺癌組、結(jié)腸腺瘤組、結(jié)腸未見(jiàn)明顯異常組，各60例。采用PCRRFLP方法檢測(cè)血液標(biāo)本p73基因多態(tài)性。組織標(biāo)本分3組，分別取自結(jié)直腸腺癌病灶處、結(jié)腸腺瘤病灶處、結(jié)直腸腺癌患者的相應(yīng)遠(yuǎn)離癌灶的正常黏膜組織，各30例，采用免疫組織化學(xué)方法檢測(cè)腫瘤組織中p73蛋白表達(dá)情況。 結(jié)果 （1）p73基因多態(tài)性與結(jié)直腸腺癌、腺瘤的發(fā)生有相關(guān)性，且AT/AT基因型的人群易患結(jié)腸腫瘤。（2）p7

2、3蛋白表達(dá)與結(jié)直腸腺癌的發(fā)生、發(fā)展有相關(guān)性。 結(jié)論 p73基因多態(tài)性與結(jié)直腸癌的發(fā)生有相關(guān)性，且AT/AT基因型的人群易患結(jié)腸腫瘤。p73蛋白表達(dá)的增加或上調(diào)與結(jié)直腸癌相關(guān)。     【關(guān)鍵詞】  結(jié)直腸腫瘤； 基因，腫瘤抑制； 腫瘤抑制蛋白質(zhì)類(lèi)； 多態(tài)現(xiàn)象，遺傳    結(jié)直腸癌的發(fā)生是黏膜上皮受到遺傳和環(huán)境等多種因素作用、導(dǎo)致多基因改變及相互作用的結(jié)果。已知p53基因是人類(lèi)腫瘤中的重要抑癌基因，而p73基因作為p53家族的成員，在人類(lèi)腫瘤中也起著重要作用。現(xiàn)已確定TAp73與p53類(lèi)似，也能誘導(dǎo)不可逆的

3、細(xì)胞周期停滯、促進(jìn)細(xì)胞凋亡，并且此功能與TAp73激活p53靶基因如Bax、p2l waf1等的轉(zhuǎn)錄有關(guān)1。p73基因包含一個(gè)多態(tài)性，在上游起始子AUG外顯子，理論上可能形成莖環(huán)結(jié)構(gòu)，被認(rèn)為可以改變基因表達(dá)從而影響p73結(jié)構(gòu)。筆者通過(guò)研究p73蛋白在結(jié)腸腺癌組織、腺瘤組織及正常組織的表達(dá)水平，探討其與結(jié)腸腺癌的細(xì)胞分化程度以及腫瘤發(fā)生發(fā)展的關(guān)系。    1  對(duì)象和方法    1.1  對(duì)象  所有病例均來(lái)自福建省立醫(yī)院內(nèi)鏡檢查和外科手術(shù)治療患者，其中結(jié)直腸癌主要指散發(fā)型，排除遺傳性非

4、息肉病性大腸癌（HNPCC）。詳細(xì)記錄病人性別、年齡及結(jié)直腸腫瘤易感因素，如家族史、手術(shù)史、飲食等。血液標(biāo)本分為3組，包括腺癌組60例，腺瘤組60例，未見(jiàn)明顯異常組60例。組織標(biāo)本分為3組，分別取自結(jié)直腸腺癌病灶處30例，結(jié)腸腺瘤病灶處30例，結(jié)直腸腺癌患者的相應(yīng)遠(yuǎn)離癌灶的正常黏膜組織30例。所有腺癌或腺瘤均經(jīng)過(guò)內(nèi)鏡形態(tài)學(xué)及病理組織學(xué)證實(shí)?！敖Y(jié)腸未見(jiàn)異?！睘閮?nèi)鏡形態(tài)學(xué)上結(jié)腸黏膜光滑的受檢者。所有組織標(biāo)本均為10%甲醛溶液固定、石蠟包埋。    1.2  方法    1.2.1  PCRRFLP&

5、#160; 取外周血2 mL，用EDTA抗凝，基因組DNA提取試劑盒（TaKaRa D9081）進(jìn)行基因組DNA提取，聚合酶鏈反應(yīng)限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性分析（PCRRFLP）。PCR引物（228 bp)：    上游：5CAGGAGGACAGAGCACGAG3    下游：5CGAAGGTGGCTGAGGCTAG3    PCR循環(huán)參數(shù)：95 變性5 min，95 30 s57 45 s72 30 s，進(jìn)行35個(gè)循環(huán)，最后72 延伸10 min。PCR產(chǎn)物中加入1 L限制性?xún)?nèi)切酶Sty1，37 孵

6、育酶切78 h，產(chǎn)物用2%瓊脂糖膠電泳，結(jié)果用凝膠成像系統(tǒng)分析。    1.2.2  免疫組織化學(xué)染色  采用二步法免疫組織化學(xué)染色。p73蛋白陽(yáng)性物質(zhì)定位于細(xì)胞核，呈棕黃色或棕褐色顆粒。陽(yáng)性判定標(biāo)準(zhǔn)：在顯微鏡中倍視野（10×10）下觀察陽(yáng)性細(xì)胞分布情況，分別取45個(gè)獨(dú)立的高倍視野（10×40），各計(jì)數(shù)200250個(gè)細(xì)胞，陽(yáng)性細(xì)胞<10%為陰性，陽(yáng)性細(xì)胞>10%為陽(yáng)性。比較結(jié)直腸腺癌和腺瘤以及遠(yuǎn)離病灶正常組織的細(xì)胞染色密度。    1.3  統(tǒng)計(jì)學(xué)處理&

7、#160; SPSS 12.0統(tǒng)計(jì)軟件包進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。采用2檢驗(yàn)和Fisher確切概率法分析p73基因的多態(tài)性以及p73蛋白的表達(dá)在結(jié)直腸腺癌、腺瘤以及正常組中的差別，P<0.05為差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。    2  結(jié)果    2.1  p73基因多態(tài)性  當(dāng)有AT時(shí)，酶切AT為156和72 bp 2個(gè)產(chǎn)物，GC型不能被Sty1酶切，仍為228 bp產(chǎn)物（圖1）。p73基因多態(tài)性在結(jié)直腸腺癌、腺瘤組和正常組中的分布見(jiàn)表1。腺癌組和腺瘤組比較，2=1.703，P>0.0125

8、，提示p73基因在腺癌組和腺瘤組基因型頻率分布無(wú)顯著差異；腺癌組和正常組比較，2=9.713，P<0.0125，提示p73基因在腺癌組和對(duì)照組基因型頻率分布有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；腺瘤組和正常組比較，2=5.378，P>0.0125，提示p73基因在腺瘤組和正常組基因型頻率分布無(wú)顯著差異。并提示AT/AT基因型的人群易患結(jié)腸腫瘤。    圖1  PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)酶切后瓊脂糖電脈結(jié)果（略）    Fig 1  Restriction analysisof p73 gene  

9、  表1  p73多態(tài)性在腺癌、腺瘤和對(duì)照組中的分布（略）    Tab 1  The distribution of the p73 genotypes frequencies    表中數(shù)據(jù)為n(%).  2=10.066，P<0.05.    2.2  p73蛋白在結(jié)直腸組織中的表達(dá)情況  p73蛋白表達(dá)定位于腺癌細(xì)胞的細(xì)胞核中，呈灶性或彌漫性分布，在結(jié)腸腺癌中呈陽(yáng)性表達(dá)(圖2)，在腺瘤組及對(duì)照

10、組表達(dá)減少或不表達(dá)（圖3，表2）。    表2  p73蛋白在腺癌、腺瘤和遠(yuǎn)離癌灶的正常組織中的表達(dá)（略）    Tab 2  The expression of p73 protein in colorectal adenocarcinoma, adenoma and healthy group    表中數(shù)據(jù)為n.  2=15.417，P<0.05.    3  討論 

11、0;  Hamajima等對(duì)日本人的研究未發(fā)現(xiàn)p73基因型與結(jié)直腸腺癌患病風(fēng)險(xiǎn)有聯(lián)系；Li等對(duì)美國(guó)人進(jìn)行頭頸部腫瘤的研究，得出AT/AT基因型的人有著一定的結(jié)直腸腺癌患病風(fēng)險(xiǎn)；但Ryan等在p73基因的多態(tài)性研究中得出，AT/AT基因型可能不容易得食管癌的結(jié)論24。這些不同的結(jié)論，可能是基于研究人群的種族、性別、年齡、環(huán)境、社會(huì)，甚至是病理學(xué)等因素的差異造成的，也可能是腫瘤的類(lèi)型不同，易患基因型也不同，這需要更多的病例來(lái)證實(shí)。A：×100；B：×400.    圖2  腺癌中p73蛋白陽(yáng)性表達(dá)（二步法免疫組織化學(xué)染

12、色）（略）    Fig 2  The positive expression of p73 in colorectal adenocarcinoma    A：腺瘤；B：正常組織.    圖3  p73蛋白陰性表達(dá)（二步法免疫組織化學(xué)染色×100）（略）    Fig 3  The negative expression of p73 protein in colorectal adenoma

13、or healthy group(×100)    研究表明，p73在許多腫瘤組織中高表達(dá)。Yokomizo等發(fā)現(xiàn)，野生型p73蛋白在膀胱癌中存在過(guò)度表達(dá)；Tannapfel等利用原位雜交和免疫組織化學(xué)的方法檢測(cè)到32%的肝細(xì)胞癌組織中有p73基因的高水平表達(dá)，且這些表達(dá)與患者的預(yù)后有關(guān)，而非腫瘤性肝細(xì)胞中p73基因呈低水平表達(dá)，提示p73基因的高表達(dá)與HCC有關(guān)57。DNA損傷后，E2F1誘導(dǎo)p73在mRNA和蛋白水平表達(dá)增加，而E2F1是受CEBP反饋調(diào)節(jié)的。用DNA損傷因子DX損傷細(xì)胞后，CEBP從細(xì)胞核內(nèi)輸出，解除了對(duì)E2F1的抑制，從

14、而促進(jìn)了p73的表達(dá)增加 8。Ozaki認(rèn)為RACK1 （receptor for activated C kinase1）在SAOS2細(xì)胞中的異位過(guò)度表達(dá)能減少p73介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄，并能抑制依賴(lài)p73的凋亡 9。而依賴(lài)p53的轉(zhuǎn)錄激活和凋亡則不受RACK1的影響，pRB則會(huì)抑制RACK1的作用。用復(fù)制缺陷的腺病毒表達(dá)p73(Adp73)轉(zhuǎn)染細(xì)胞株，可提高p73的表達(dá)水平，激活目標(biāo)基因p21WAF1。Adp73是有效的細(xì)胞毒素因子，能引起細(xì)胞周期停滯，誘導(dǎo)凋亡，并且能增加化療的敏感性10。但也有文獻(xiàn)報(bào)道，p73蛋白因細(xì)胞分化不同而表達(dá)不同，而不是因增殖或者腫瘤表達(dá)不同。Kamiya等發(fā)現(xiàn)，p73在

15、基底細(xì)胞癌和脂溢性角化病中的類(lèi)似基底細(xì)胞中強(qiáng)表達(dá)，而在鱗狀上皮細(xì)胞癌和脂溢性角化病中的類(lèi)似鱗狀細(xì)胞中弱表達(dá)11。本研究也顯示，p73蛋白在結(jié)直腸腺癌中存在高表達(dá)現(xiàn)象，在30例的結(jié)直腸腺癌組織中有13例存在高表達(dá)，而在腺瘤和正常組織中分別只有3例和2例表達(dá)，提示p73蛋白的高表達(dá)可能與結(jié)腸腺癌有關(guān)。    【參考文獻(xiàn)】  1 Fang L,Lee S W,Aaronson S A. Comparative analysis of p73 and p53 regulation and effector functionsJ. J Cell Biol

16、, 1999,147(4): 823830.2 Hamajima N,Matsuo K,Suzuki T, et al. No association of p73 G4C14toA4T14 at exon 2 and p53 Arg72Pro polymorphism with the risk of digestive tract cancers in JapaneseJ. Cancer Lett, 2002,181(1):8185.3 Li G,Sturgis E M,Wang L E, et al. Association of a p73 exon 2 G4C14toA4T14 po

17、lymorphism with risk of squamous cell carcinoma of the head and neckJ. Carcinogenesis, 2004,25(10):19111916.4 Ryan B M,McManus R,Daly J S, et al. A common p73 polymorphism is associated with a reduced incidence of oesophageal carcinomaJ. Br J Cancer, 2001,85（10）:14991503.5 Yokomizo A,Mai M,Tindall D

18、 J, et al. Overexpression of the wild type p73 gene in human bladder cancerJ. Oncogene, 1999,18(8):16291633.6 Tannapfel A,Wasner M,Krause K, et al. Expression of p73 and its relation to histopathology and prognosis in hepatocellular carcinomaJ. J Natl Cancer Inst, 1999,91(13):11541158.7 Herath N I,Kew M C,Whitehall V L, et al. p73 is upregulated in a subset of hepatocellular carcinomasJ. Hepatology, 2000,31(3):6016058 Mirko M, Faina V, Cristina R, et al. DNA damage induces transcriptional activation ofp73 by removing CEBP repression on E2F1. Nu