活血補(bǔ)腎合劑對(duì)C57BL6小鼠皮膚血管新生及毛囊中血管內(nèi)皮細(xì)

1、活血補(bǔ)腎合劑對(duì)C57BL/6小鼠皮膚血管新生及毛囊中血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子表達(dá)的影響    【摘要】 通過觀察C57BL/6小鼠皮膚局部血管新生及毛囊中血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子（vascular endothelial growth factor， VEGF）的表達(dá)，探討活血補(bǔ)腎合劑促進(jìn)小鼠毛發(fā)生長(zhǎng)的可能機(jī)制。方法:以熱松香和石蠟混合物脫毛法誘導(dǎo)C57BL/6小鼠休止期毛囊進(jìn)入生長(zhǎng)期，建立動(dòng)物模型。90只小鼠隨機(jī)分為活血補(bǔ)腎合劑組、養(yǎng)血生發(fā)膠囊組和模型組。造模后第1天起開始灌藥，每天觀察各組小鼠皮膚毛發(fā)生長(zhǎng)情況，并分別于造模后第4、11、17天每組分批處死10

2、只小鼠，病理切片計(jì)數(shù)拔毛部位的血管數(shù)，并以免疫組織化學(xué)方法檢測(cè)毛囊中VEGF表達(dá)情況。結(jié)果:活血補(bǔ)腎合劑組局部新生血管數(shù)第4天時(shí)多于模型組（ P <0.05），第11天時(shí)明顯多于養(yǎng)血生發(fā)膠囊組和模型組（ P <0.05）;活血補(bǔ)腎合劑組毛囊中VEGF的表達(dá)在第11天和第17天時(shí)均明顯高于養(yǎng)血生發(fā)膠囊組和模型組（ P <0.05）。結(jié)論:活血補(bǔ)腎合劑可能是通過調(diào)節(jié)細(xì)胞因子水平，起到促進(jìn)血管新生和毛發(fā)生長(zhǎng)的作用。    【關(guān)鍵詞】 中醫(yī)藥; 血管; 血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子; 免疫組織化學(xué); 毛囊; 小鼠 活血補(bǔ)腎合劑（Huoxue Bushe

3、n Mixture， HXBSM） 是龍華醫(yī)院皮膚科經(jīng)驗(yàn)方，臨床治療脫發(fā)取得了良好的療效1。本實(shí)驗(yàn)觀察活血補(bǔ)腎合劑對(duì)小鼠毛發(fā)生長(zhǎng)、局部血管新生及毛囊中血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子 （vascular endothelial growth factor， VEGF）表達(dá)的影響，旨在從微觀結(jié)構(gòu)和細(xì)胞因子水平對(duì)活血補(bǔ)腎合劑促進(jìn)毛發(fā)生長(zhǎng)作用的機(jī)制加以闡釋。 1 材料與方法 1.1 實(shí)驗(yàn)材料 1.1.1 動(dòng)物 C57BL/6小鼠，普通級(jí)，8周齡，體質(zhì)量（20±2）g，雄性，由上海中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。 1.1.2 藥物來源與制劑加工 活血補(bǔ)腎合劑由地黃30 g、丹參40 g、益母草20 g、玄參

4、15 g、黃芪 40 g 、黨參20 g、麥冬15 g、豬苓20 g、金錢草40 g、白花蛇舌草40 g共10味中藥組成，由龍華醫(yī)院制劑室制備（滬藥制字z05170520），含生藥4 g/ml。養(yǎng)血生發(fā)膠囊（熟地黃、當(dāng)歸、羌活、木瓜、制何首烏等）由廣州敬修堂藥業(yè)股份有限公司生產(chǎn)，批號(hào)030263。生理鹽水，上海市富民制藥廠生產(chǎn)。 1.2 造模、分組及藥物處理 1.2.1 動(dòng)物模型建立 參考文獻(xiàn)2建立動(dòng)物模型，將按11的比例混合的松香和石蠟加熱融化后涂于C57BL/6小鼠背部，凝固變硬后揭去，從而達(dá)到脫毛的效果。每只小鼠脫毛區(qū)域約為2 cm×2 cm。 1.2.2 動(dòng)物分組及藥物處理

5、按藥理與中藥藥理實(shí)驗(yàn)3人鼠等效劑量換算方法計(jì)算各種藥物的人鼠等效劑量。C57BL/6小鼠，共90只，隨機(jī)分為 3組 ，每組30只?；钛a(bǔ)腎合劑組，以生藥 25 g/（kg?d） 劑量灌飼;養(yǎng)血生發(fā)膠囊（Yangxue Shengfa Capsule， YXSFC）組，以0.36 g/（kg?d）劑量灌飼; 模型組，生理鹽水0.4 ml/d灌胃。以上 3組 每天灌服藥物1次，從造模后第1天起，連續(xù)給藥17 d。 1.3 檢測(cè)指標(biāo)與方法 1.3.1 肉眼觀察 各組小鼠拔毛局部皮色變化及毛發(fā)生長(zhǎng)情況。 1.3.2 光學(xué)顯微鏡下觀察 分別于造模后第4、 11天 用斷頸法每組隨機(jī)處死10只小鼠，第17天

6、用 同樣方法處死各組剩余小鼠。在每只小鼠拔毛部位切取新鮮皮膚標(biāo)本，固定于10%中性甲醛，經(jīng)脫水，透明，滲蠟，包埋，連續(xù)切片，并進(jìn)行HE染色，觀察真皮淺層毛細(xì)血管數(shù)（條）。以200倍視野計(jì)數(shù)，每張切片數(shù)5個(gè)視野，計(jì)算平均值4。 1.3.3 檢測(cè)VEGF表達(dá) 采用免疫組織化學(xué)法。 1.3.3.1 檢測(cè)方法 免疫組化Envision二步法測(cè)定VEGF（VEGF抗體為Santa Cruz Biotechnology 公司產(chǎn)品，工作濃度125150），與HE染色同步進(jìn)行。 1.3.3.2 圖像分析 采用Leica DMIRB倒置像差顯微鏡和 Leica Q 500 IW圖像分析儀，選擇200倍視野，每張

7、免疫組化切片任選2個(gè)視野，分析視野中免疫組化切片染色陽(yáng)性面積占整個(gè)視野面積的百分比。 1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用 x ± s 表示。采用SPSS for Windows軟件包進(jìn)行完全隨機(jī)設(shè)計(jì)資料的兩因素方差分析。2 結(jié)果 2.1 各組小鼠拔毛局部毛發(fā)生長(zhǎng)情況 各組小鼠在造模時(shí)皮膚均為粉紅色;HXBSM組和YXSFC組在造模后第45天局部皮膚變黑，第89天出現(xiàn)新生毛發(fā)，第17天皮膚變灰;而模型組約在第 6天 皮膚變黑，第11天出現(xiàn)新生毛發(fā)，第17天皮膚變灰。其中皮膚變黑的時(shí)間頭端早于尾端。    2.2 對(duì)小鼠皮膚局部血管新生的影響 因?qū)嶒?yàn)過

8、程中有動(dòng)物死亡，各組第4和11天均處死10只，第17天HXBSM組和YXSFC組均處死9只，模型組處死8只。同組小鼠不同時(shí)間拔毛局部真皮淺層毛細(xì)血管數(shù)相比，HXBSM組在造模后第11天和第17天時(shí)明顯多于第4天（ P <0.05），模型組第 17天 時(shí)明顯多于第4天和第11天（ P <0.05）;同一時(shí)間不同組別相比，第4天和第11天時(shí)HXBSM組新生血管數(shù)較模型組增加（ P <0.05），YXSFC組第11天時(shí)新生血管數(shù)較模型組增加（ P < 0.05 ）;而第11天時(shí)，HXBSM組明顯多于YXSFC組（ P <0.05）;第17天時(shí)，3組小鼠局部毛細(xì)血管數(shù)目相

9、比，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（ P >0.05）。見表1。 2.3 對(duì)小鼠皮膚局部毛囊中VEGF表達(dá)的影響 同組小鼠不同時(shí)間拔毛局部毛囊中VEGF的表達(dá)相比，HXBSM組和YXSFC組在造模后第11天高于第4天（ P <0.05），第17天高于第11天和第 4天 （ P <0.05）;模型組在第11天和第17天高于第4天（ P <0.05），而第11天和第17天相比，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。同一時(shí)間不同組別相 比，第4天時(shí)各組小鼠毛囊中VEGF的表達(dá)量差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（ P >0.05）;第11天和第17天時(shí)，HXBSM組VEGF的表達(dá)量高于YXSFC組和

10、模型組（ P <0.05）;第17天YXSFC組VEGF的表達(dá)量高于模型組（ P <0.05）。見表1、圖1。 表1 各組小鼠局部血管新生和皮膚局部毛囊中VEGF表達(dá)（略） Table 1 Skin blood vessel neogenesis and expression of VEGF in hair follicle of mice in three groups *P <0.05， vs day 4;P <0.05， vs day 11;P <0.05， vs untreated group;P <0.05， vs YXSFC group. 圖1

11、第11天各組毛囊中VEGF的表達(dá)情況（略） Figure 1 The eleventh day's VEGF expression of mice hair follicle in three groupsA: HXBSM group; B: YXSFC group; C: Untreated group.    3 討論 臨床上，我們發(fā)現(xiàn)脫發(fā)患者以青壯年居多。患者生活節(jié)奏快，心理壓力大，造成勞傷心脾，或肝郁氣滯，或暗耗腎精。由此導(dǎo)致了濕阻、血瘀或腎虛，氣血不能上達(dá)頭部，毛發(fā)失于精血的濡養(yǎng)而脫落。故治療脫發(fā)應(yīng)以“活血、利濕、補(bǔ)腎”為治則，而活血補(bǔ)

12、腎合劑正是以這一原則組方。我們臨床以該方治療腎虛血瘀型脫發(fā)，為期3個(gè)月的臨床觀察顯示，治療組痊愈率和顯效率分別為44%和36%，明顯優(yōu)于首烏片對(duì)照組的12%和28%（ P <0.05），并且對(duì)頭痛失眠、腰酸乏力等腎虛血瘀的證候改善也明顯優(yōu)于首烏片對(duì)照組（ P <0.05）5。本實(shí)驗(yàn)所選的C57BL/6小鼠在68周飼養(yǎng)良 好的情況下，所有毛囊均由生長(zhǎng)期進(jìn)入休止期，且生理狀態(tài)下不再自發(fā)進(jìn)入生長(zhǎng)期。經(jīng)人工脫毛或拔毛等創(chuàng)傷刺激后可誘導(dǎo)其毛發(fā)進(jìn)入生長(zhǎng)期，并可自發(fā)經(jīng)過退行期再進(jìn)入休止期。這個(gè)周期活動(dòng)與自然周期無明顯差別6。該小鼠軀干皮膚的黑素細(xì)胞只存在于毛囊中，而且僅在生長(zhǎng)期合成黑素并傳遞給角

13、質(zhì)形成細(xì)胞，使皮膚變成黑色，而退行期皮膚變成灰色，休止期皮膚變?yōu)榉奂t色，因此可根據(jù)皮膚顏色大致判斷毛發(fā)周期與毛發(fā)生長(zhǎng)情況2。本研究觀察各組小鼠毛發(fā)生長(zhǎng)情況，HXBSM組小鼠毛發(fā)進(jìn)入生長(zhǎng)期和長(zhǎng)出的時(shí)間均早于模型組，而各組進(jìn)入退行期的時(shí)間相當(dāng)，表明活血補(bǔ)腎合劑可促進(jìn)小鼠毛發(fā)進(jìn)入生長(zhǎng)期，并可促進(jìn)毛發(fā)生長(zhǎng)，但不能延長(zhǎng)或縮短小鼠毛發(fā)固有的自然周期。Castex-Rizzi等7發(fā)現(xiàn)VEGF及其受體僅在生長(zhǎng)期毛囊（主要在外毛根鞘、毛母質(zhì)和毛乳頭）表達(dá)，進(jìn)入退行期后逐漸降低，在休止期則基本消失，進(jìn)一步證實(shí)VEGF對(duì)毛囊生長(zhǎng)周期和毛發(fā)生長(zhǎng)具有正相調(diào)節(jié)的重要作用。本研究結(jié)果則表明，活血補(bǔ)腎合劑可明顯提高小鼠拔毛局

14、部毛囊VEGF的表達(dá)。推測(cè)活血補(bǔ)腎是通過調(diào)節(jié)細(xì)胞因子水平，達(dá)到促進(jìn)血管新生、促進(jìn)毛發(fā)生長(zhǎng)的作用。 【參考文獻(xiàn)】 1Li YM， Song Y， Ma SY. Observation of curative effects of Huoxue Bushen Mixture on 317 patients with alopecia. Zhejiang Zhong Xi Yi Jie He Za Zhi. 2004; 14（7）: 440-441. Chinese. 李詠梅， 宋瑜， 馬紹堯. 活血補(bǔ)腎合劑治療脫發(fā)317例療效觀察. 浙江中西醫(yī)結(jié)合雜志. 2004; 14（7）: 440-441.

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