淺論乳腺癌組織中EMS1 mRNA檢測的臨床意義

1、淺論乳腺癌組織中EMS1 mRNA檢測的臨床意義                  作者：盛建， 徐青， 陳錦鵬， 何志賢【摘要】  目的： 通過檢測EMS1基因在乳腺癌組織中的表達，結(jié)合乳腺癌分子分型及各項臨床病理參數(shù)，分析EMS1 mRNA表達水平在乳腺癌組織檢測中的臨床意義。方法： 采用RTPCR法檢測94例乳腺癌及癌旁組織EMS1 mRNA相對含量，以乳腺癌癌旁組織EMS1 mRNA的相對表達量均值為界限, 乳腺癌組織

2、分為高表達組和低表達組;采用ELIVISON二步法，對乳腺癌組織進行免疫組化分析并根據(jù)基因聚類分析進行分子分型;分析EMS1基因表達與乳腺癌分子分型及各項臨床病理參數(shù)的關(guān)系。結(jié)果： 乳腺癌組織與癌旁組織中EMS1 mRNA平均表達水平為0.578±0.105和0.397±0.079,高表達率為60.6%(57/94)。Basallike型乳腺癌中EMS1平均表達水平最高，與其他分子分型比較,差異有統(tǒng)計學(xué)意義。EMS1 mRNA高表達與患者年齡50歲、絕經(jīng)后和腋淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移成正相關(guān),與腫瘤大小、腫瘤分級和TNM分期狀況無關(guān)。結(jié)論： EMS1基因可能是乳腺癌的一種新預(yù)后指標。 【

3、關(guān)鍵詞】  乳腺癌; EMS1; 逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈式反應(yīng); 腋淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移Abstract Objective: To detect the expression of EMS1 gene in breast cancer tissues, combining the molecular type and clinicopathological parameters to evaluate the clinical significance of EMS1 expression in breast cancer. Methods： The expression of EMS1 was d

4、etected by RTPCR in surgical neoplastic and paraneoplastic breast tissues from 94 cases of breast cancer patients. The ER,PR,Her2/neu,EGFR status was detected after operation by ELIVISON twostep immunohistochemistry method and according to gene expression clustering analyze breast cancer molecular t

5、ype，breast cancer tissues were divided into EMS1 mRNA high expression group and low expression group based on the average value of all paraneoplastic breast tissues and the correlation between EMS1 gene expression, the molecular type and clinicopathological parameters of breast cancer was analyzed.

6、Results： The average expression level of the EMS1 mRNA was 0.578±0.105 and 0.397±0.079 in all neoplastic and paraneoplastic breast tissues，and 60.6%(57/94) of all neoplastic cases was EMS1 mRNA high expression.EMS1 average expression in the basallike carcinoma of the breast was the highest

7、 than the four other molecular types and had significant difference. The high expression of EMS1 mRNA was positively correlated with age50, postmenopausal status,axillary lymph nodes metastasis. The expression of EMS1 mRNA was independence of tumor size,tumor grade and TNM stage. Conclusion： EMS1 ge

8、ne may be a new prognosis factor of breast cancer.Key words breast cancer;EMS1; RTPCR; axillary lymph nodes metastasisEMS1基因是由Schuuring等1于1992年通過cDNA克隆序列分析發(fā)現(xiàn)的一種新的基因，與細胞胞突形成有關(guān),其編碼蛋白為細胞皮質(zhì)區(qū)肌動蛋白結(jié)合蛋白(cortical actin binding protein，Cortactin),能通過氨基末端結(jié)合并活化肌動蛋白相關(guān)蛋白2/3(Arp2/3)復(fù)合物，來調(diào)節(jié)肌動蛋白的動力;而羧基末端則在肌動蛋白多聚化中起關(guān)

9、鍵作用，能顯著增強上皮細胞的運動遷移能力,與腫瘤細胞侵襲、轉(zhuǎn)移有關(guān)。本實驗通過RTPCR法對94例乳腺癌組織及癌旁組織中EMSl mRNA表達情況進行研究，結(jié)合乳腺癌分子分型及各項臨床病理學(xué)檢測結(jié)果，分析EMSl mRNA表達水平在乳腺癌組織中的臨床意義。1 資料與方法1.1 臨床資料94例女性乳腺癌為南通大學(xué)附屬醫(yī)院普外科2007年2月至2008年1月收治的患者。年齡在2487歲之間，平均年齡58.4歲，50歲者62例，絕經(jīng)者54例，61例腫塊直徑2 cm。病理分型、組織學(xué)分級、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移狀況等均以術(shù)后病理報告為準?；颊咝g(shù)前均未進行化療或放療,其中行乳腺癌改良根治術(shù)79例,根治術(shù)13例,擴大

10、根治術(shù)2例。術(shù)后病理證實腋窩淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者給予化療，腋窩淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移超過3枚者加做放療，雌激素受體(estrogen receptor, ER)陽性者給予他莫昔芬口服5年，或者ER陽性且絕經(jīng)者使用第三代芳香化酶抑制劑進行內(nèi)分泌治療。1.2 EMS1 mRNA半定量檢測1.2.1 標本收集及處理 94例乳腺癌及癌旁組織標本均在手術(shù)時收集，離體后切取新鮮無壞死組織立即投入-196液氮速凍，1 h后移至-70深凍冰箱中保存?zhèn)溆谩?.2.2 總RNA提取 取100 mg組織，采取Trizol一步法提取總RNA，將RNA溶于無RNA酶純水中,紫外分光光度計定量并鑒定RNA的純度, RNA電泳判斷抽提RNA的

11、質(zhì)量。1.2.3 RT反應(yīng) 按照試劑盒說明進行，依次取2 g總RNA、OligodT(18)(0.5 g/l)1 l、DEPC水補至總體積12 l,混勻后70孵育5 min;依次加入5×反應(yīng)緩沖液 4 l、Rnase 抑制劑(20 U/l) 1 l、10 mmol/L dNTP 2 l后，37孵育5 min;冰上冷卻后，加入MMULV 反轉(zhuǎn)錄酶(200 U/l) 1 l至20 l反轉(zhuǎn)錄體系,于42孵育60 min,70孵育10 min，冰上冷卻后，-20保存。1.2.4 PCR反應(yīng) 取20 l反應(yīng)體系中逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生的cDNA模板2.0 l，10×PCR 緩沖液5 l，dNTP

12、(10 mmol/L) 2 l，Tap酶1.5 U，EMS1及GAPDH引物(上、下游)各1 l，MgCl2(25 mmol/L)3 l和滅活Rnase的雙蒸水補足體積至50 l,于PCR擴增儀上經(jīng)94預(yù)變性5 min，94變性45 s，56退火45 s，72復(fù)性1 min，30個循環(huán)，最后72延伸10 min。產(chǎn)品及引物由上海生工有限公司合成提供。EMS1引物參考文獻：正義: 5TCCCAATCCAGAGACCCG3;反義:5TCCCCTGATGCCCAGGTC3,擴增EMS1基因片斷，共113 bp。以細胞內(nèi)表達恒定的人GAPDH作為內(nèi)參照。根據(jù)基因庫中GAPDH cDNA序列，由引物設(shè)計

13、軟件Prime Premier 5.0設(shè)計目的基因，擴增片段全長215 bp。引物為正義：5CCTTCATTGACCTCAACTACATG3;反義：5CTTCTCCATGGTGGTGAAGAC3。1.2.5 PCR產(chǎn)物相對定量分析 取10 l PCR產(chǎn)物加入2 l 6×加載緩沖液，經(jīng)2%瓊脂糖凝膠水平電泳，溴化乙啶染色，紫外燈下觀測。存入Dolphin1d凝膠成像分析系統(tǒng)，測量電泳帶的光密度值。結(jié)果判定：PCR產(chǎn)物量以光密度×面積來表達，以目的基因EMS1的PCR產(chǎn)物量與GAPDH產(chǎn)物量的比值代表目的基因的相對表達量。以癌旁組織EMS1 mRNA的相對表達量均值為界限，將癌

14、組織分為EMS1 mRNA高表達和低表達組，計算高表達率。1.3 ER、PR、Her2/neu、EGFR蛋白表達的檢測術(shù)后常規(guī)對乳腺癌組織進行免疫組化分析，采用LAB VISION 2D全自動免疫組化染色儀，ELIVISON二步法進行染色，檢測ER、PR、Her2/neu、EGFR的表達。ER、PR蛋白染色顆粒位于胞核內(nèi), 陽性結(jié)果為胞核呈棕黃色或棕褐色顆粒;Her2/neu染色顆粒位于胞膜，胞膜染色為陽性細胞;EGFR蛋白染色顆粒位于胞質(zhì)內(nèi)，陽性結(jié)果為胞質(zhì)內(nèi)呈棕黃色顆粒。染色半定量分級標準：每張切片選5個高倍視野(200倍)，按腫瘤陽性細胞率和著色強度分別進行計分： 按陽性細胞百分率，0分為

15、5%，1分為6%25%，2分為26%50%，3分為51%75%，4分為75%; 按著色計分：分為4個等級，0分為無著色，1分為淡黃色，2分為黃色，3分為棕黃色。兩者的乘積：0分為(-)，14分為(+)，58分為(+)，912分為(+)。統(tǒng)計時，(-)及(+)表達作為陰性組;(+)及(+)表達作為陽性組。1.4 統(tǒng)計學(xué)方法使用SPSS13.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計分析。計數(shù)資料采用Pearson卡方檢驗，卡方檢驗有相關(guān)性的，行Spearman等級相關(guān)分析。方差齊性及多樣本均數(shù)比較采用F檢驗，數(shù)據(jù)用x±s表示。檢驗水準為0.05。     &#

16、160;   2 結(jié) 果2.1 乳腺癌和配對癌旁正常組織中EMS1 mRNA的表達水平乳腺癌及配對癌旁正常組織均表達EMS1，服從正態(tài)分布，且方差齊。94例乳腺癌組織中，EMS1 mRNA表達的相對光密度值為0.578±0.105;癌旁組織為0.397±0.079。乳腺癌組織EMS1 mRNA表達均值明顯高于癌旁組織，兩者比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.01)。但由于癌組織與癌旁組織EMS1 mRNA表達的相對光密度值范圍部分重疊，少數(shù)癌組織EMS1 mRNA相對光密度值可略低于癌旁組織，如33號標本(圖1，T表示腫瘤組織，N為其癌旁正常對照)。以EMS1

17、mRNA 表達均值0.397為界，將乳腺癌組織EMS1 mRNA表達分為高表達和低表達，本組94例乳腺癌患者中有57例患者高表達，高表達率為60.6%(圖2，T19/T27/T52/T68為高表達，T11/T44/T75為低表達)。2.2 EMS1 mRNA表達與乳腺癌臨床病理參數(shù)的關(guān)系EMS1 mRNA高表達與年齡50歲、絕經(jīng)后、腋淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移成正相關(guān)，相關(guān)度R分別為0.248，0.275和0.213;而與腫瘤大小、分級水平、TNM分期無關(guān)(表1)。表1 EMS1 mRNA表達與乳腺癌臨床病理參數(shù)的關(guān)系2.3 EMS1 mRNA表達與乳腺癌分子分型的關(guān)系免疫組化結(jié)果見圖3。根據(jù)免疫組化結(jié)果，運

18、用Perou等和Sorlie 等提出的基因表達聚類分析，將94例乳腺癌組織按分子分型分為5種不同的亞型：luminal A 型，luminal B 型，HER2 過表達型，basallike型和normal breastlike型。分別檢測EMS1表達水平(表2)。Luminal A型中EMS1平均表達水平最低，而basallike型中EMS1平均表達水平最高;兩者EMS1平均表達水平與其余4型比較,差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)。3 討 論EMS1/Cortactin促進腫瘤轉(zhuǎn)移的具體作用機制，目前尚不十分清楚。Kurebayashi等發(fā)現(xiàn)，Cortactin通過加強與內(nèi)皮細胞的相互作用，

19、促進腫瘤細胞骨轉(zhuǎn)移，可能是Cortactin促進腫瘤細胞侵襲轉(zhuǎn)移的機制之一。有研究表明，Cortactin過表達通過促進Eselectin介導(dǎo)的細胞間黏附連接的形成和細胞骨架表2 EMS1 mRNA表達與乳腺癌分子分型的關(guān)系的重組，可能是Cortactin促進腫瘤細胞侵襲與轉(zhuǎn)移的機制之一。EMS1/Cortactin過表達通過細胞外信號調(diào)節(jié)激酶和/或AKT(蛋白激酶B),提高血清和表皮生長因子介導(dǎo)的細胞增殖,并抑制腫瘤細胞的失巢凋亡。Luo等研究發(fā)現(xiàn)，EMS1/Cortactin可能通過PI3 Kinase/Akt信號途徑抑制腫瘤細胞的失巢凋亡。腋淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移是判斷乳腺癌患者預(yù)后重要的指標，同時

20、也是腫瘤分期及選擇治療方案的重要依據(jù)，乳腺癌患者生存率隨著陽性淋巴結(jié)數(shù)目的增多而遞減10-11。本次研究我們發(fā)現(xiàn)，EMS1基因高表達與乳腺癌患者年齡50歲、絕經(jīng)后、腋淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移正相關(guān)。提示在年齡50歲和(或)絕經(jīng)后的乳腺癌患者中，腋淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移可能與EMS1基因高表達有關(guān)。因此，測定EMS1表達狀況對判斷乳腺癌患者的治療方式的選擇及預(yù)后判斷可能有指導(dǎo)意義。乳腺癌的分子分型能很好地反映其生物學(xué)行為, 明確其個體分子特征, 不僅有助于判斷預(yù)后, 還有助于預(yù)測乳腺癌對臨床治療的反應(yīng), 是實現(xiàn)個體化治療的基礎(chǔ)。采用基因芯片技術(shù)對乳腺癌進行基因表達譜分析是鑒定各種分子亞型最有效的工具。但該技術(shù)對標本的要求

21、較高, 且費用昂貴,實際操作困難, 較難在臨床廣泛應(yīng)用;乳腺癌各分子亞型均有蛋白質(zhì)標志物如ER, PR, HER2, CK5/6, EGFR等的明顯差異, 所以大多數(shù)研究應(yīng)用免疫組織化學(xué)技術(shù)替代基因芯片技術(shù)在蛋白質(zhì)水平上對乳腺癌進行分子分型。雖然乳腺癌的異質(zhì)性使得免疫組織化學(xué)技術(shù)的分子分型和基因芯片技術(shù)的結(jié)果不完全一致，但前者也基本反映了各分子亞型的臨床特征，目前被廣泛采用。通過對EMS1在本組乳腺癌各分子分型中表達狀況的檢測，我們發(fā)現(xiàn)，luminal A型中EMS1平均表達水平最低;而basallike型中EMS1平均表達水平最高，較其他分子分型有顯著差異，提示在basallike型乳腺癌中

22、，EMS1高表達可能是促進該型腫瘤早期復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移的重要因素之一。合理使用分子靶向藥物能顯著提高乳腺癌各亞型的治療效果。luminal A 型HER2-,內(nèi)分泌治療效果明顯優(yōu)于luminal B 型, 但對化療不敏感。luminal B型HER2 +，對他莫昔芬耐藥，但對芳香化酶抑制劑敏感。HER2 過表達型ER且PR,故內(nèi)分泌治療效果差;但含有蒽環(huán)類的化療方案以及抗HER 2的靶向治療藥物赫賽汀的應(yīng)用可以顯著改善其預(yù)后12-13。Normal breast like 型對化療最不敏感，basal like型乳腺癌ER,PR和HER2均為陰性,內(nèi)分泌治療和赫賽汀對其均無效。此型雖然對化療有較高的敏感性, 但在所有分子亞型中其預(yù)后仍是最差的，其靶向基因仍不明確，因此尋找新的靶向藥物是治療此型患者的關(guān)鍵。研究發(fā)現(xiàn)，ADP核糖基化因子(Arf6)在乳腺癌的侵襲中起關(guān)鍵的作用。AMAP1蛋白是GTPArf6的效應(yīng)分子，它的表達與浸潤性乳腺癌高度相關(guān)。AMAP1與Cortactin、樁蛋白結(jié)合形成三聚體復(fù)合物而發(fā)揮作用。在復(fù)合物中，AMAP1通過Cortactin的脯氨酸富集區(qū)與其SH3區(qū)呈12結(jié)合。進一步的研究發(fā)現(xiàn)，從AMAP1中衍生出的一種細胞滲透性多肽能特異性阻抑Cortactin 與AMAP