用定量PCR從雜交陽(yáng)性融合噬菌斑中分離候選插入片段

1、    用定量PCR從雜交陽(yáng)性融合噬菌斑中 分離候選插入片段        【摘要】目的為了在cDNA文庫(kù)雜交篩選目的基因過(guò)程中，當(dāng)復(fù)篩的雜交信號(hào)對(duì)應(yīng)于1個(gè)多克隆融合噬菌斑時(shí)，能夠快速、準(zhǔn)確地分離出特異克隆的插入片段。方法依據(jù)定量PCR擴(kuò)增的原理，利用初始模板量的不同，通過(guò)兩次PCR反應(yīng)，鑒定和分離出所需cDNA片段。結(jié)果利用這一方法，在-1，4-半乳糖苷轉(zhuǎn)移酶cDNA的“步移”復(fù)篩中，從一個(gè)雙克隆融合斑中，得到了特異性克隆的插入片段，經(jīng)測(cè)序證實(shí)為-1，4-半乳糖苷

2、轉(zhuǎn)移酶的5cDNA序列，長(zhǎng)1.9kb，從而完成了全長(zhǎng)cDNA的克隆，節(jié)省了進(jìn)行再次復(fù)篩的時(shí)間和材料。結(jié)論該方法簡(jiǎn)便、快捷，可以顯著地節(jié)省時(shí)間和實(shí)驗(yàn)材料，在新基因克隆中有一定的實(shí)用價(jià)值?！娟P(guān)鍵詞】定量聚合酶鏈反應(yīng)雜交篩選融合噬菌斑基因克隆Isolating candidate inserted fragment from positive fused phage clones using quantitative PCRFAN Yuxin, YU Long*, JIANG Ying, DAI Fangyan, CUI Yingyu,CHEN Chiyuan, DONG Changyu, ZHAO

3、 Shouyuan.*Institute of Genetics, Fudan University, Shanghai, 200433 P.R.China.E-mail:Longyu【Abstract】ObjectiveTo isolate quickly and exactly the specific inserted fragment from fused phage clones which were obtained from cDNA library by hybridization.MethodsAccording to the amplification principle

4、of quantitative polymerase chain reaction (PCR) and based on the difference of original template quantity, target cDNA fragment was isolated and identified by two PCRs.ResultsA positive clone with specific cDNA fragment of HumGT-H1 gene was obtained from a two-phage fused clone by using this method,

5、 and the inserted fragment was verified to be the 5cDNA sequence of HumGT-H1,1.9kb in length. So another hybridization screening is not necessary.ConclusionThe method presented is effective and rapid in gene cloning and can greatly save time and materials.【Key words】Quantitative polymerase chain rea

6、ctionHybridization screeningFused phage clonesGene cloning在基因克隆的過(guò)程中，常需進(jìn)行雜交篩選1。這一方法在從數(shù)十萬(wàn)個(gè)克隆中尋找所需的少數(shù)克隆是行之有效的。在進(jìn)行了2輪或3輪雜交篩選后，一般可得到單個(gè)克隆。但在某些情況下，產(chǎn)生陽(yáng)性雜交信號(hào)的噬菌斑與無(wú)關(guān)的噬菌斑發(fā)生融合而無(wú)法獲得單克隆時(shí)，通常需再進(jìn)行一次復(fù)篩。限于同位素定期供應(yīng)等條件的限制，有時(shí)不得不多用1030天的時(shí)間，才能獲得目的克隆的插入片段。為此，我們?cè)O(shè)想此時(shí)如能用定量PCR鑒定和分離出目的克隆的插入片段2，則可以有效節(jié)省時(shí)間和材料。我們?cè)诜蛛x和克隆新基因-1，4-半乳糖苷轉(zhuǎn)移酶

7、(HumGT-H1)全長(zhǎng)cDNA的過(guò)程中，運(yùn)用了定量PCR擴(kuò)增策略，從兩個(gè)克隆的融合噬菌斑中得到了所需步移克隆的插入片段，從而證實(shí)這一設(shè)想是可行的。1材料和方法1.1實(shí)驗(yàn)材料本實(shí)驗(yàn)室雜交篩選HumGT-H1全長(zhǎng)cDNA過(guò)程中獲得的有陽(yáng)性雜交信號(hào)的融合噬菌斑，它由兩個(gè)克隆的噬菌斑彼此融合形成。人睪丸cDNA分子庫(kù)購(gòu)自Clontech公司。Taq DNA聚合酶購(gòu)自Promega公司。PCR引物由上海生工生物工程有限公司合成，其中依據(jù)HumGT-H1的EST序列設(shè)計(jì)的特異引物兩條：GTH1-A：5-ACTCTTGAATGTGGGCTATCT-AG-3和GTH1-B：5-CAAACCAGAAATCCA

8、C-TGTGATG-3；gt10載體上克隆位點(diǎn)兩側(cè)各1個(gè)引物：EF：5-AGCAGCCAGTCAACACTTACG-3和ER：5-GAGTTTGCATATCGCCTCCATC-3。1.2實(shí)驗(yàn)方法3(1)分離噬菌體插入片段：融合噬菌斑稀釋液為模板，以EF、ER為引物，4種dNTP各200mol/L，引物各0.5mol/L，Tris.HCl 20mmol/L，KCl 50mmol/L，MgCl2 3mmol/L，Taq DNA聚合酶1.5U，PCR反應(yīng)體積為50l。反應(yīng)條件為93預(yù)變性4分鐘，93變性1分鐘，60退火1分鐘，72延伸1分30秒，35個(gè)循環(huán)，最后72延伸5分鐘。PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠

9、電泳鑒定，以低熔點(diǎn)瓊脂糖凝膠分離兩條條帶，EB染色后在長(zhǎng)波紫外燈下切割DNA條帶，65恒溫槽上保溫10分鐘以熔化膠塊并滅活可能污染的DNA酶，4冰箱存放備用。(2)定量PCR鑒別候選插入片段：以含回收DNA片段的低熔點(diǎn)瓊脂糖凝膠液為模板，用特異引物進(jìn)行擴(kuò)增鑒別候選插入片段，退火溫度改為54，其它條件同前。在反應(yīng)進(jìn)行至5、10、15、20、25個(gè)循環(huán)時(shí)間點(diǎn)分別取出10l進(jìn)行電泳檢測(cè)，首先出現(xiàn)512bp特異片段的DNA模板樣品即視為來(lái)自候選克隆的插入片段。(3)測(cè)序：用PCR循環(huán)測(cè)序法進(jìn)行DNA手工測(cè)序，SequiTherm EXCELTM DNA測(cè)序試劑盒購(gòu)自Epicentre Techonol

10、ogies公司，具體操作按試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。2結(jié)果用GTH1-A和GTH1-B引物從人睪丸cDNA分子庫(kù)中擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物為雜交探針雜交篩選人睪丸cDNA分子庫(kù)。經(jīng)兩次雜交篩選，得到若干陽(yáng)性克隆，其中一強(qiáng)陽(yáng)性雜交信號(hào)來(lái)自一個(gè)融合噬菌斑，仔細(xì)觀察發(fā)現(xiàn)該斑由兩個(gè)緊密相鄰噬菌斑融合而成，此時(shí)如對(duì)該噬菌斑再次進(jìn)行復(fù)篩鑒定，則還需10天以上才能作出鑒定，因急于得到正確候選克隆的插入片段，我們?cè)囉昧薖CR方法來(lái)分離正確侯選克隆的插入片段。首先，用gt10載體兩臂上的引物(EF和ER)擴(kuò)增這個(gè)融合噬菌斑的稀釋液，PCR產(chǎn)物顯示為兩條電泳帶，長(zhǎng)度分別約為1.9kb(a)和0.6kb(b)。為確定哪一條電泳帶是

11、我們所需的插入片段，我們用特異PCR引物(GTH1-A和GTH1-B)分別擴(kuò)增這兩個(gè)條帶，但兩個(gè)條帶都能擴(kuò)增出我們所預(yù)期的512bp長(zhǎng)度片段，推測(cè)這一現(xiàn)象可能與DNA分子在電場(chǎng)遷移中的相互攜帶有關(guān)，即長(zhǎng)片段電泳帶中含有少量的短片段，短片段電泳帶中亦含有少量的長(zhǎng)片段。為此，我們繼而采用了定量PCR的策略，在PCR進(jìn)行至第5、10、15、20、25個(gè)循環(huán)時(shí)，分別取出10l反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行電泳鑒定。以a為模板的反應(yīng)在5個(gè)循環(huán)后可見(jiàn)有512bp特異片段出現(xiàn)，而以b為模板的反應(yīng)則無(wú)可見(jiàn)條帶。由此鑒別出1.9kb的a條帶即是我們所需克隆的插入片段。后來(lái)對(duì)1.9kb片段的測(cè)序結(jié)果(測(cè)序結(jié)果未示出)證實(shí)，這一基于

12、定量PCR的推斷是正確的，該片段是我們所需的HumGT-H1 5cDNA序列，該基因已在GenBank登錄，注冊(cè)號(hào)為AF020920。然后在10個(gè)循環(huán)后，a反應(yīng)特異條帶更加明顯而b反應(yīng)也可見(jiàn)特異條帶出現(xiàn)；至20個(gè)循環(huán)后，兩反應(yīng)產(chǎn)物量的差別已無(wú)法區(qū)別(1)。在第5、10、15、20、25個(gè)循環(huán)時(shí)b反應(yīng)產(chǎn)物與a反應(yīng)產(chǎn)物面積掃描(分析軟件：Smart View 3.0)比值分別為0、0.47、0.91、0.96、0.98。A：融合克隆示意；B：以gt10EF/ER為引物擴(kuò)增融合克隆，產(chǎn)物電泳顯示為1.9kb(a)和0.6kb(b)兩條帶；C：以HumGT-H1特異引物GTH1-A/GTH1-B分別對(duì)

13、a、b兩帶進(jìn)行定量PCRFig 1Electrophoresis photograph of quantitative PCRA:Shown fused phage clone;B:Amplification of fused clone withprimers gt10 EF/ER.C:Quantitative PCR of band a and b with HumGT-H1 specific primers GTH1-A/GTH1-B3討論本實(shí)驗(yàn)的依據(jù)是，第1次PCR后，產(chǎn)物雖經(jīng)電泳分離，但由于分子攜帶現(xiàn)象，在同一電泳樣品含有兩個(gè)以上長(zhǎng)度不同的DNA片段時(shí)，從凝膠上回收某一長(zhǎng)度DNA片段

14、，該回收DNA片段中都不可避免地含有另一長(zhǎng)度片段的很少量分子，其攜帶量的多少與總的DNA加樣量成正比。就我們這個(gè)實(shí)驗(yàn)而言，即a帶中可能含有少量的b片段分子，b帶中可能含有少量的a片段分子。第2次PCR反應(yīng)時(shí)，由于引物是特異的，因此對(duì)作為擴(kuò)增模板的a片段或b片段而言，它們中只有一種長(zhǎng)度的DNA片段是對(duì)應(yīng)于特異引物的特異DNA模板，可以擴(kuò)增出PCR產(chǎn)物。然而由于a、b兩個(gè)電泳條帶的彼此微量攜帶摻雜，盡管特異模板量在兩條電泳帶中相差懸殊，但在進(jìn)行了常規(guī)的PCR循環(huán)擴(kuò)增之后，二者所有產(chǎn)生的特異擴(kuò)增產(chǎn)物量仍難以區(qū)分。以致不能判斷哪一條電泳帶是我們所需的特異目標(biāo)片段。我們運(yùn)用劑量PCR的原理，采用不同時(shí)點(diǎn)

15、采樣的方式，發(fā)現(xiàn)在僅進(jìn)行了5個(gè)循環(huán)的擴(kuò)增后，含特異模板量多的樣品就已能產(chǎn)生出較大量的特異擴(kuò)增產(chǎn)物，而含特異模板量少的樣品則不能產(chǎn)生足以顯示的產(chǎn)物，由此而分辨出哪一條電泳帶的回收片段是對(duì)應(yīng)于特異引物的特異模板。而當(dāng)進(jìn)行至15個(gè)以上的循環(huán)時(shí)，即使特異模板量少的樣品亦可產(chǎn)生足夠多的特異擴(kuò)增產(chǎn)物而使其與另一個(gè)反應(yīng)無(wú)法區(qū)別。由本實(shí)驗(yàn)看出，定量PCR技術(shù)在基因克隆中也可發(fā)揮作用。當(dāng)遇到雜交陽(yáng)性克隆為融合噬菌斑時(shí)，此法與再次雜交篩選鑒定方法相比，具有簡(jiǎn)便，快速等優(yōu)點(diǎn)。2比較了兩種方法的操作時(shí)間，定量PCR方法只需幾小時(shí)而雜交篩選需幾天，可見(jiàn)定量PCR可大大縮短實(shí)驗(yàn)進(jìn)程。如再考慮到我國(guó)同位素購(gòu)買(mǎi)的時(shí)間限制因素

16、，本方法的優(yōu)勢(shì)則更加明顯。2定量PCR法與雜交篩選鑒定操作時(shí)間的比較Fig 2Time comparsion of two methods本實(shí)驗(yàn)的鑒別對(duì)象是兩個(gè)克隆的融合噬菌斑，當(dāng)復(fù)篩后的雜交陽(yáng)性信號(hào)對(duì)應(yīng)于3個(gè)以上克隆的融合噬菌斑時(shí)，則更能體現(xiàn)此方法的優(yōu)勢(shì)。但是，當(dāng)融合噬菌斑中的幾個(gè)克隆中，正確克隆的插入片段和無(wú)關(guān)克隆的插入片段長(zhǎng)度十分接近，用電泳難以分開(kāi)時(shí)，則此方法難以奏效。盡管如此，我們認(rèn)為定量PCR技術(shù)在基因克隆中仍不失為一種有用的輔助方法。本課題受?chē)?guó)家863高技術(shù)項(xiàng)目資助作者單位：200433上海，復(fù)旦大學(xué)遺傳學(xué)研究所；余龍：通信聯(lián)系人參考文獻(xiàn)1施少林，余龍，吳國(guó)俊，等.人類(lèi)“鋅指”蛋白基因ZNF191 cDNA的分離與克隆.自然科學(xué)進(jìn)展，1997，7(4)499-502.2Horikoshi T, Danenberg K, Volkenandt M, et a