缺氧論文缺血缺氧至低齡大鼠腦少突膠質(zhì)細(xì)胞的改變及腦白質(zhì)損傷和神經(jīng)功能障礙相關(guān)性研究-醫(yī)學(xué)論文網(wǎng)

1、缺氧論文|缺血缺氧至低齡大鼠腦少突膠質(zhì)細(xì)胞的改變及腦白質(zhì)損傷和神經(jīng)功能障礙相關(guān)性研究-醫(yī)學(xué)論文網(wǎng)    摘要：9 m$ t8 : r' z6 L* u0 , W目的 觀察3日齡大鼠缺血缺氧腦損傷后腦少突膠質(zhì)細(xì)胞變化及鼠遠(yuǎn)期行為、學(xué)習(xí)記憶變化,研究早產(chǎn)兒腦損傷的發(fā)病機(jī)理，為干預(yù)治療提供時(shí)間窗的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。方法 選擇3日齡同窩生SD 低齡新生大鼠112只隨機(jī)分為實(shí)驗(yàn)組62只和假手術(shù)組50只。新生大鼠在乙醚麻醉下切開頸部皮膚，假手術(shù)組僅分離左側(cè)頸總動(dòng)脈，而實(shí)驗(yàn)組行左側(cè)頸總動(dòng)脈結(jié)扎術(shù),術(shù)后吸6±0.5氮氧混合氣4h，建立未成熟鼠缺血缺

2、氧腦損傷模型,分別于損傷后24h 、48h 、72h 、11d四個(gè)時(shí)間點(diǎn)處死大鼠,采用組織切片蘇木精伊紅染色、少突膠質(zhì)細(xì)胞抗體O4 和細(xì)胞凋亡免疫組化雙標(biāo)記方法,觀察低齡新生大鼠腦損傷的病理變化、少突膠質(zhì)細(xì)胞凋亡表達(dá)及1m時(shí)行為變化，3m時(shí)記憶學(xué)習(xí)能力改變。結(jié)果 缺血缺氧影響了低齡新生鼠的生長（體重增長緩慢、睜眼延遲）和神經(jīng)行為功能缺陷、腦白質(zhì)疏松、小膠質(zhì)細(xì)胞增生和腦室擴(kuò)大等病理變化,深部白質(zhì)少突膠質(zhì)細(xì)胞凋亡數(shù)在損傷后24h 、48h 、72h 較對照組增多( P < 0. 05) ,以48 h 兩組差異最為顯著,生后2 周兩組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 ( P > 0. 05) 。結(jié)論 3

3、 日齡低齡新生大鼠缺血缺氧腦損傷后,腦白質(zhì)損傷明顯，腦白質(zhì)少突膠質(zhì)細(xì)胞凋亡，伴生長遲緩和神經(jīng)行為功能缺陷,有助于理解早產(chǎn)兒腦損傷發(fā)病機(jī)制和神經(jīng)病理變化,并可作為研究早產(chǎn)兒缺血缺氧腦損傷的動(dòng)物模型。/ 3 p8 s- _, l8 0 i* G% l) i, z6 K5 M' e& ) Z  z" B關(guān)鍵詞：腦室周圍白質(zhì)損害，腦室周圍白質(zhì)軟化，早產(chǎn)兒，少突膠質(zhì)細(xì)胞，新生大鼠  a9 k( K+ D- Q3 R6 W3 y0 |: '! Y* s* H# m: x+ H因受益于NICU 的精心救治和護(hù)理，90 %早產(chǎn)兒可在新生

4、兒期存活。在存活的早產(chǎn)兒中，約10 %早產(chǎn)兒可出現(xiàn)痙攣性運(yùn)動(dòng)缺陷即腦癱，更有25 %50 %早產(chǎn)兒主要表現(xiàn)為認(rèn)知、行為缺陷或輕度運(yùn)動(dòng)障礙，這個(gè)高神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)病率日益受到關(guān)注，其主要與腦白質(zhì)損害有關(guān)。長期以來，無論是臨床試驗(yàn)還是動(dòng)物實(shí)驗(yàn)，研究焦點(diǎn)一直集中在缺血缺氧性腦損傷的神經(jīng)元損害上，而相對忽視了對于腦白質(zhì)損傷的研究，目前對于腦白質(zhì)損害的研究尚處于探索階段。本實(shí)驗(yàn)預(yù)通過建立腦白質(zhì)損傷大鼠模型來研究低齡新生大鼠腦室周圍白質(zhì)損傷發(fā)病機(jī)制及其與少突膠質(zhì)細(xì)胞間的關(guān)系。) D! _+ L+ Y! Q; d4 x9 L1 N+ T) M. p  y生后5天大鼠是神經(jīng)元遷移的終末階段，神經(jīng)

5、系統(tǒng)發(fā)育還未成熟，相當(dāng)于人類的早產(chǎn)兒，所以，本研究采用單側(cè)頸總動(dòng)脈結(jié)扎法聯(lián)合吸入6（6O2、94N2）氮氧混合氣4h，建立3 日齡未成熟大鼠缺血缺氧腦損傷模型，觀察低齡新生大鼠腦損傷的病理變化、少突膠質(zhì)細(xì)胞(oligodendrocyte ,OL)凋亡表達(dá)。而且有必要知道是否缺血缺氧損傷在我們的發(fā)育大鼠的模型中也有長期的神經(jīng)行為能力方面的變化，本實(shí)驗(yàn)對大鼠體重和神經(jīng)行為改變作了測定。/ y- J2 h6 ) & g8 I) L4 - ! K5 k8 X* w' % Z1. 材料和方法' U6 a8 w' E& L- X" f* Q# l

6、0; s# P+ k8 $ g1.1 材料實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 4 G+ d) m( w7 R. j# z4 R) t- F; ; u: O5 k0 Z清潔級3日齡(P3)SD大鼠(東南大學(xué)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供)14窩,每窩約69只不等, 雌雄不拘，共112只，體重6.510.5g。將同窩P3 大鼠隨機(jī)分為兩組: 單側(cè)頸總動(dòng)脈結(jié)扎聯(lián)合吸入6氮氧混合氣4h組(實(shí)驗(yàn)組) 62只和僅分離左側(cè)頸總動(dòng)脈組(假手術(shù)組,即對照組)50只。兩組大鼠乙醚吸入麻醉12min后仰臥、四肢固定于手術(shù)臺上。取正中切口，實(shí)驗(yàn)組用50線結(jié)扎，縫合皮膚后放回原飼養(yǎng)環(huán)境中恢復(fù)23小時(shí)，然后置于2000ml密閉容器中，該容器置于

7、37。C恒溫水域箱中，以2L/min的速度輸入6O2、94N2混合氣體，持續(xù)4小時(shí)，取出后返籠飼養(yǎng)。對照組僅游離左側(cè)頸總動(dòng)脈。術(shù)后假手術(shù)組死亡2只，試驗(yàn)組死亡14只，兩組大鼠共96只(實(shí)驗(yàn)組和對照組各64只) 分別于術(shù)后24h 、48h、72h 和11d 斷頭取腦(每組各8只)。切片進(jìn)行蘇木精伊紅染色，細(xì)胞凋亡和OL 雙標(biāo)記，另兩組大鼠共32只(實(shí)驗(yàn)組和對照組各8只) 分別于術(shù)后1月、3月分別作行為學(xué)測定及三臂迷宮實(shí)驗(yàn)。* M" y( p- D; a3 t; p7 S" Z  D: n7 K3 h# z" ?$ H1.2 方法" ?7

8、 k& : W7 U* 9 W" ! l$ e' NHE染色于HI 后24 h、48 h、72h、11d用0.4%戊巴比妥鈉（40mg/kg）大鼠腹腔麻醉后經(jīng)心臟插管，生理鹽水沖洗，后灌入4%多聚甲醛，灌畢即斷頭取腦，外固定。取不同冠狀面于冰凍切片機(jī)切片，10um切片行常規(guī)蘇木素-伊紅(HE)染色。& E: N% r! k& H* G5 l  e. 2 R6 h9 d3 l凋亡和OL 標(biāo)記O4 檢測 單純少突膠質(zhì)細(xì)胞標(biāo)記：冰凍切片依次加入OL 標(biāo)記O4 的一抗4 過夜(10&mu;g/ mL，試劑購自R D 公司)，暗室中德

9、克薩斯紅( Texas Red ) 標(biāo)記的二抗(20&mu;g/ mL，試劑購自Vector公司) 37 孵育1h。雙免疫熒光標(biāo)記O4抗體和Tunel，前步驟相同，然后在暗室中再加入標(biāo)記有FITC 熒光素的Tunel 反應(yīng)液50&mu;L 于37 孵育1 h (試劑盒購自R  D 公司) ,熒光顯微鏡（Nikon，放大倍數(shù)&times;200）下觀察腦室周圍白質(zhì)部位細(xì)胞凋亡情況。每個(gè)標(biāo)本連續(xù)切3 張切片進(jìn)行標(biāo)記，每張切片隨即選取6 個(gè)視野計(jì)數(shù)，并取其平均值統(tǒng)計(jì)。在不同波段下觀察，再于電腦合成計(jì)算少突膠質(zhì)細(xì)胞調(diào)亡率。0 x! h- d6 1 v7 U7

10、 g+ # * t* w* p1 d* o# h1 w) 2 R  t行為、學(xué)習(xí)、記憶測定4 K% a7 D) M) Y/ R9 c7 B3 R4 Y# 3 Q! p& c! s$ + f0 D& G6 j（1） 懸吊試驗(yàn)一月齡大鼠雙前腿抓住一水平木棒（直徑約0.5cm），離開地面45cm，記錄大鼠掉下的時(shí)間，并對其進(jìn)行評分。* x' s9 h  _6 q$ c1 d& v9 e, + s) z' Z% O" d（2） 曠場試驗(yàn)裝置為36 x 36 x 36 cm的無頂紙盒，盒底用黑線分成9個(gè)等大小方格，

11、將大鼠置于中央方格中，觀察30s內(nèi)大鼠1/2以上身體從所在方格進(jìn)入相鄰方格及大鼠后肢性站立活動(dòng)情況，并記分。# k- j9 w; R: z( , a% e) l$ n! B0 |2 m# w* g. T7 r（3） 三臂迷宮測試 大鼠至3月左右時(shí)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。三等分迷宮系改良的鈥淵鈥澅勖怨? 支長度相等的臂組成，底部為可通電的銅棒，臂的末端裝有小燈。訓(xùn)練大鼠由暗臂(通電) 跑向亮臂(斷電) 以逃避電擊(即為正確)，每次隨機(jī)點(diǎn)亮一臂，凡通電時(shí)動(dòng)物直接跑向安全區(qū)為正確反應(yīng),反之為錯(cuò)誤。達(dá)到學(xué)會(huì)標(biāo)準(zhǔn)為連續(xù)10 次訓(xùn)練中有9 次正確，記錄每一動(dòng)物達(dá)標(biāo)前所需測試數(shù),以此作為學(xué)習(xí)快慢的客觀指標(biāo)。24 h 以后

12、檢測記憶保存情況，即在連續(xù)10 次測試中正確反應(yīng)保持多少，以記憶保持的百分?jǐn)?shù)表示。+ o' U" q4 X0 y; 3 ) H3 m& r; U) B1 O統(tǒng)計(jì)學(xué)處理應(yīng)用SPSS11. 5 進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，兩樣本均數(shù)比較采用t 檢驗(yàn)，結(jié)果均以x&plusmn;s 表示， P < 0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。, v! a/ ?/ g! A* k5 X$ $ Z1 p$ 6 D* _! k2 I# P; H2. 結(jié)果; d. K4 C7 g* p. n2 c# ' z4 |5 v$ Y2.1 體重變化* M% C3 ?' M6 Y$ k2

13、B4 z0 o/ f: i0 n) L術(shù)后實(shí)驗(yàn)組大鼠有活動(dòng)減少、喂養(yǎng)困難、體重增長緩慢等異常表現(xiàn)。術(shù)前實(shí)驗(yàn)組和對照組體重相差不大,術(shù)后實(shí)驗(yàn)組平均體重增長幅度低于對照組，第4天至2周同日齡大鼠處死前體重明顯低于假手術(shù)組大鼠體重（P?0.001），但到了1月齡時(shí)兩組體重差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P?0.05 ）(表1)。實(shí)驗(yàn)組大鼠睜眼時(shí)間較對照組早，分別為P17.82&plusmn;0.81，P15.38&plusmn;0.62，兩組時(shí)間差有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P?0.05）。( S7 r9 L% E: X6 O3 I! A: M& '9 n. V* z5 v5 m4 B9 q2

14、5 Z& y2.2 病理學(xué)變化8 9 & N2 T. i' n0 L; K5 H0 L8 T9 U6 m! D. y各組腦組織無肉眼可見的腦水腫，神經(jīng)細(xì)胞的改變隨腦損傷時(shí)間變化有差異。實(shí)驗(yàn)組早期病變相對較輕，2周后損傷程度加重, 蘇木精-伊紅染色實(shí)驗(yàn)組腦室周圍白質(zhì)較對照組染色淺且疏松，腦室周圍胼胝體及那囊組織相對疏松,缺血缺氧側(cè)腦室較對側(cè)及對照組擴(kuò)大，但皮質(zhì)病變較輕，皮層細(xì)胞結(jié)構(gòu)完整，可見水腫的神經(jīng)元細(xì)胞，而核固縮細(xì)胞相對較少，海馬病變相對較輕，未見海馬缺如。# J- |' u5 Z( X' h( B1 _3 q  O2 U# d1

15、c- a; y2.3 凋亡和OL標(biāo)記結(jié)果, 5 f! L$ z( + R) q: z  H! 4 ?1 " Z% t- E! b+ L# t4 T# T$ H熒光顯微鏡下可見標(biāo)記的OL程紅色（激發(fā)Texas red），標(biāo)記的凋亡細(xì)胞核呈現(xiàn)黃綠色熒光(激發(fā)FITC) 。實(shí)驗(yàn)組術(shù)后24hOL未見明顯減少，術(shù)后48、72 hOL數(shù)目減少，2周時(shí)實(shí)驗(yàn)組OL數(shù)與對照組無明顯差別（表2）。術(shù)后實(shí)驗(yàn)組OL凋亡數(shù)增多,以48 h 最多，2 周時(shí)兩組OL凋亡數(shù)無明顯差異(表3) 。5 P3 s8 E3 x# h+ ( - q" s5 Q* t% X6 y! V'

16、j9 S, G; j2.4 行為學(xué)測定, c0 W' G! S: A+ K: _- 3 d3 _7 R- o$ n/ I0 k8 ?4 E2 T9 m1月齡時(shí)實(shí)驗(yàn)組大鼠懸吊試驗(yàn)及曠場試驗(yàn)評分均較對照組低（P?0.05），三臂迷宮試驗(yàn)顯示試驗(yàn)組大鼠訓(xùn)練次數(shù)較對照組多（P?0.001），24小時(shí)后記憶保持率較對照組低（P?0.001）（表4）。6 ' w  j1 y) v: x$ x9 ! U; G* E2 e) d0 R3. 討論3 T$ O- f* ' n+ m; g, U, h) '! g# a; e/ B. d& _' U

17、) F5 E早產(chǎn)兒常見腦損傷主要為腦室內(nèi)出血（intraventricular hemorrhage，IVH）和腦室周圍白質(zhì)軟化（periventricular leucomalacia，PVL）。最近幾年IVH的發(fā)生率逐漸下降，PVL已上升為早產(chǎn)兒腦損傷的重要類型。圍產(chǎn)期腦缺血缺氧被認(rèn)為是早產(chǎn)兒腦白質(zhì)損傷尤其是腦室周圍白質(zhì)軟化（PVL）的主要發(fā)病因素，早產(chǎn)兒腦室周圍白質(zhì)軟化為早產(chǎn)兒神經(jīng)系統(tǒng)后遺癥最常見原因。早產(chǎn)兒的缺血缺氧性腦損傷表現(xiàn)為選擇性腦白質(zhì)損傷，而PVL 是早產(chǎn)兒最常見的白質(zhì)損傷形式。血流降低和/或氧供減少將會(huì)導(dǎo)致腦室周圍白質(zhì)損傷1。PVL為腦室周圍白質(zhì)囊性變和凝固性壞死或彌漫性白質(zhì)

18、損傷，而腦皮質(zhì)損傷輕。其發(fā)病因素主要為未成熟腦血流調(diào)控機(jī)制不成熟，腦白質(zhì)在發(fā)育期血供不足和OL 的前體細(xì)胞對損傷有高度的敏感性，目前PVL 的發(fā)病機(jī)制尚未明確。在PVL 的病因研究中,缺血缺氧被認(rèn)為是最重要的因素。8 j0 E, '6 9 U& q$ E: P4 v4 R: j; D6 t0 j  j長期以來由于動(dòng)物模型難以建立，阻礙了PVL的進(jìn)一步深入研究。以往的7 日齡大鼠單側(cè)頸總動(dòng)脈結(jié)扎聯(lián)合8的低氧是研究足月兒缺氧缺血性腦病(HIE) 一個(gè)較經(jīng)典的模型,主要的病變部位在皮質(zhì)和海馬神經(jīng)元2，由于7 日齡大鼠神系統(tǒng)發(fā)育相當(dāng)于人類足月或近足月的新生兒，其腦組

19、織中OL 已逐漸發(fā)育成熟并發(fā)生髓鞘化, 對損傷易感性不強(qiáng)，而神經(jīng)元卻高度敏感，最終表現(xiàn)以神經(jīng)元受損為主，白質(zhì)損傷少見。所以這對研究腦白質(zhì)損傷并不合適。生后5天大鼠是神經(jīng)元遷移的終末階段3，神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育還未成熟,相當(dāng)于人類的早產(chǎn)兒。本實(shí)驗(yàn)初采用Stephen A4等的2日齡單側(cè)頸總動(dòng)脈結(jié)扎聯(lián)合低氧法，因操作難及乳鼠死亡率較高，遂采用3日齡單側(cè)頸總動(dòng)脈結(jié)扎法聯(lián)合低氧，建立3 日齡未成熟大鼠缺血缺氧腦損傷模型。, X8 5 v$ y, o% k, * q! j# d: ; V% h! h' G. ?PVL的主要特征之一是OL的凋亡，臨床上PVL高發(fā)于23-32W胎齡的早產(chǎn)兒，作用的靶細(xì)胞是O

20、L 的前體細(xì)胞，OL 的前體細(xì)胞主要表達(dá)抗體O4，O4 是表達(dá)在未成熟少突膠質(zhì)細(xì)胞膜上的一個(gè)脂質(zhì)抗原,是未成熟少突膠質(zhì)細(xì)胞的標(biāo)志5。本研究發(fā)現(xiàn)缺血缺氧后初期階段及后期階段OL數(shù)無明顯差異，在48h及72hOL數(shù)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，具體在哪個(gè)時(shí)間段開始OL數(shù)差異不明顯有待進(jìn)一步研究。各年齡段大鼠采用O4與TUNEL標(biāo)記凋亡少突膠質(zhì)細(xì)胞，實(shí)驗(yàn)組陽性細(xì)胞計(jì)數(shù)較對照組明顯增多,而生后2周時(shí)OL凋亡數(shù)目差異已不明顯。因?yàn)樯?-5日齡大鼠相當(dāng)于早產(chǎn)兒，2周大鼠OL已發(fā)育成熟，幼鼠白質(zhì)的損傷以O(shè)L凋亡為主,這與早產(chǎn)兒PVL 損傷相一致4。而2周時(shí)OL凋亡差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，且較48hOL凋亡數(shù)明顯減少，可能與OL損傷后又有增生有關(guān)。Pamela L6等在體外試驗(yàn)中已有相關(guān)報(bào)道。; v9 S1 R# 0 u: