高親和性神經(jīng)生長因子受體對神經(jīng)生長因子誘導神經(jīng)母細胞瘤細胞分化的影響

1、    高親和性神經(jīng)生長因子受體對神經(jīng)生長因子 誘導神經(jīng)母細胞瘤細胞分化的影響        【摘要】目的觀察人神經(jīng)母細胞瘤細胞系IMR-32細胞在恢復高親和性神經(jīng)生長因子受體基因trkA表達后對神經(jīng)生長因子(NGF)誘導分化的反應。方法應用基因重組技術構建含外源trkA cDNA的逆轉錄病毒載體，經(jīng)PA317細胞包裝后感染靶細胞系IMR-32細胞，經(jīng)Southern blot雜交、逆轉錄-聚合酶鏈反應(RT-PCR)證實轉化細胞系中含有外源基因的整合及穩(wěn)定表達后，

2、進行神經(jīng)生長因子誘導分化實驗。結果轉化細胞系未經(jīng)NGF誘導前與母系細胞在細胞形態(tài)及生長狀態(tài)方面差異均無顯著性意義，而經(jīng)NGF誘導后細胞出現(xiàn)明顯神經(jīng)元樣分化，生長及代謝速率減慢(四甲基偶氮唑鹽法測定原細胞系IMR-32和空載體轉化細胞系IMR-32/pIRV分別為0.258±0.017,0.237±0.011；而trkA基因轉化的細胞系則僅為0.028±0.003)，撤去NGF后分化細胞仍然維持分化狀態(tài)。轉化細胞在軟瓊脂內(nèi)很少形成集落，集落形成率僅為0.6；遠低于原細胞系IMR-32和空載體轉化細胞系IMR-32/pIRV 的32.3 和33.6，在裸鼠體內(nèi)未見腫瘤

3、形成。結論高親和性神經(jīng)生長因子受體基因的表達可以使轉化細胞系對NGF產(chǎn)生不可逆的誘導分化反應，使腫瘤細胞惡性表型得到逆轉?！娟P鍵詞】神經(jīng)母細胞瘤；受體，神經(jīng)生長因子；基因轉移；細胞分化Effects of high-affinity nerve growth factor (NGF) receptor gene on NGF-induced differentiation of neuroblastoma cell lineZHE Xiaoning, CHEN Jie(Email:chenj)*, LIU Tonghua, GAO Jie.*Department of Pathology, P

4、eking Union Medical College Hospital, Chinese Academy of Medical Sciences, Peking Union Medical College, Beijing 100730，China【Abstract】ObjectiveTo study the effects of transfection of high-affinity nerve growth factor receptor gene (trkA) on NGF-induced differentiation of human neuroblastoma cell li

5、ne IMR-32. MethodsThe recombinant retrovirus vector containing exogeneous trkA gene was constructed and packed by PA317 packaging cell line. The neuroblastoma cell line IMR-32 was transfected by virus containing supernatant. The transformant cell line was confirmed by Southern blot and RT-PCR techni

6、ques. The NGF was used to induce cellular differentiation of the transformant cells. ResultsThe trkA gene was successfully transferred and expressed in the neuroblastoma cells. After NGF treatment, the transformant cells displayed apparent neuron-like differentiation morphologically, and a slower ra

7、te of cell growth (MTT value 0.028±0.003) compared with original cell line (0.258±0.017) and empty virus transformed cell line (0.237±0.011). The cells remained in differentiated status after withdrawing the NGF from the medium. The transformant tumor cells rarely formed colonies in s

8、oft agar and failed to form tumor in nude mice. ConclusionRestoration of high-affinity NGF receptor (trkA) expression in neuroblastoma cells could induce non-reversal differentiation. The trkA might be the important factor during NGF-induced differentiation of neuroblastoma cell. 【Key words】Neurobla

9、stoma；Receptors, nerve growth factor；Gene transfer；Cell differentiation神經(jīng)母細胞瘤是兒童期常見的惡性腫瘤之一。我們實驗室以往在對多種人神經(jīng)母細胞瘤細胞系及其他神經(jīng)外胚層腫瘤細胞系的研究中發(fā)現(xiàn)，缺乏神經(jīng)生長因子受體（NGFR）表達的細胞系對神經(jīng)生長因子(NGF)不產(chǎn)生誘導分化反應；即使恢復了低親和性NGFR在人神經(jīng)母細胞瘤細胞系IMR-32中的表達，轉化細胞經(jīng)NGF誘導仍然不能發(fā)生明顯的分化反應。近年來越來越多的實驗證據(jù)表明，高親和性NGFR所介導的信號傳導通路在NGF誘導包括神經(jīng)母細胞瘤在內(nèi)的多種神經(jīng)源性腫瘤體外培養(yǎng)細胞系

10、分化過程中起到較為重要的作用。我們的研究目的即為觀察高親和性NGFR是否能介導神經(jīng)母細胞瘤細胞對NGF產(chǎn)生誘導分化反應。材料與方法一、材料含trkA cDNA的質(zhì)粒pIRV-CMV-trkA及人神經(jīng)母細胞瘤細胞系IMR-32由美國伍斯特實驗生物學研究所Dr.Ross惠贈；小鼠纖維母細胞NIH 3T3、雙向性包裝細胞系PA317由中國醫(yī)學科學院醫(yī)學分子生物學重點實驗室提供。TrkA cDNA擴增引物5-CTGGGCGGAGTGCCTGAA-3及5-GGCTGCCGGCTC-CAGGAA-3,擴增片段長度為523 bp1；擴增內(nèi)參照GAPDH引物：5-TCCCTCAAGATTGTCAGCAA-3及

11、5-AGATCCACAACGGATACATT-3,擴增片段長度為309 bp2。以上引物均由北京賽百盛(Cybersyn)公司合成。隨機引物標記試劑盒為Gibcol BRL公司產(chǎn)品,逆轉錄試劑盒為Promega公司產(chǎn)品,-32P-dCTP購自亞輝醫(yī)學生物工程公司，1.11×105 GBq/mmol, 370 MBq/ml。Balb/c裸鼠及飼料購自中國醫(yī)學科學院腫瘤醫(yī)院動物室，裸鼠動物號：01-1004。二、方法1.質(zhì)粒的構建：含trkA cDNA的逆轉錄病毒載體經(jīng)限制性內(nèi)切酶EcoR酶解，回收線狀空病毒載體，經(jīng)T4DNA連接酶體系連接，恢復其閉環(huán)結構，即為pIRV-neo-CMV空

12、載體。2.細胞培養(yǎng)及轉化細胞系的建立：IMR-32細胞用含10%胎牛血清的IMDM培養(yǎng)基培養(yǎng)，PA317細胞用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)；將經(jīng)純化的上述2種質(zhì)粒經(jīng)脂質(zhì)體法3轉染逆轉錄病毒雙向包裝細胞系PA317，經(jīng)G418篩選獲得陽性克隆，擴大培養(yǎng)后收集上清，測定病毒滴度4，用高滴度病毒上清轉染IMR-32細胞系，經(jīng)G418篩選獲得抗性克隆，擴大培養(yǎng)，轉化細胞系分別命名為IMR-32/trkA及IMR-32/pIRV。3.轉化細胞中外源基因整合與表達的鑒定：分別提取2種轉化細胞系及IMR-32母系基因組DNA及總RNA，應用-32P-dCTP標記的neo cDNA探針行Souther

13、n雜交5，應用逆轉錄-聚合酶鏈反應(RT-PCR)技術進行目的片段的擴增，實驗按試劑盒說明進行操作。4.NGF誘導分化實驗：NGF以200 ng/ml作為終濃度，持續(xù)給藥2周，觀察細胞生長分化狀況，測定細胞生長曲線，四甲基偶氮唑鹽(MTT)法檢測細胞增殖代謝率6，常規(guī)進行軟瓊脂集落形成實驗7，即每組用2個鋪雙層瓊脂的平皿，接種2×103細胞，培養(yǎng)2周后，分別計數(shù)集落數(shù)，用2個平皿的平均數(shù)除以接種細胞數(shù)得出集落形成率；應用Northern 雜交檢測NGF作用后細胞中神經(jīng)絲蛋白mRNA的表達情況。所有實驗均以不加NGF，同原細胞系作對照。5.裸鼠體內(nèi)致瘤性8: 選無致病原雌性4周齡Bal

14、b/c裸鼠，以原細胞系細胞做對照組，空病毒轉化細胞IMR-32/pIRV和trkA 轉化細胞IMR-32/trkA為實驗組。每組34只，無菌條件下飼養(yǎng)，每周換飼料及墊料1次，分別于裸鼠背部皮下接種1×107細胞，4周后開始觀察，每周觀察1次，并記錄腫瘤體積，觀察36個月。計算方法如下：V=0.523 6(/6)×a×b2,其中a和b分別為腫瘤在體測量時的最大和最小徑線值9。結果1質(zhì)粒的酶切鑒定結果如1顯示，含外源cDNA的質(zhì)粒經(jīng)EcoR酶切可得到2.7 kb的cDNA片段及6.5 kb的載體，而空載體酶切后僅出現(xiàn)6.5 kb條帶。1：DNA/Hind，2：pIRV

15、-CMV-trkA/EcoR，3：pIRV-CMV/EcoR1pIRV-CMV-trkA及相應空載體酶切鑒定結果1：IMR-32，2：IMR-32/pIRV，3：IMR-32/trkA2Southern雜交鑒定轉化細胞系中外源基因整合情況2Southern雜交結果如2顯示，在轉化細胞中可見前病毒整合，其中空病毒轉化細胞雜交帶為3.8 kb，為完整前病毒的長度；而trkA轉化細胞中由于trkA cDNA 5端距起始300 bp處含有Sac位點，酶切后帶neo基因的片段長度約剩3.3 kb，所以雜交帶較空載體細胞前移；3結果顯示IMR-32/trkA中可擴增出長523 bp的片段，而空載體轉化細胞

16、及母系對照中均未見擴增帶，各細胞系GAPDH表達能力差別不大，說明RNA總量基本一致。3轉化細胞對NGF誘導分化的反應：NGF誘導之前，IMR-32/trkA的細胞生物學行為與空載體轉化細胞系及母系無明顯差別；在NGF(200 ng/ml)存在的條件下，IMR-32/trkA產(chǎn)生明顯分化，包括神經(jīng)突起生長，胞體聚集(46)，分化反應在給NGF后35 d開始出現(xiàn)，911 d達到高峰，分化細胞經(jīng)Northern雜交檢測發(fā)現(xiàn)神經(jīng)絲蛋白表達上調(diào)(7)，MTT法檢測細胞增殖代謝率明顯降低(表1)。軟瓊脂集落形成實驗結果表明，經(jīng)NGF誘導分化的IMR-32/trkA細胞集落形成能力顯著下降(表2)；加藥2

17、周后撤去NGF，分化細胞依然維持分化狀態(tài)，觀察2周亦未見細胞恢復到分化前的幼稚狀態(tài)，相比之下，空載體轉化細胞及母系在NGF作用下未見明顯的分化反應，僅有輕微的生長加快，撤去NGF之后繼續(xù)維持原有的生長狀態(tài)；轉化細胞在裸鼠體內(nèi)連續(xù)觀察6個月未見腫瘤形成，而其母系IMR-32和空病毒對照系均在接種的4周時可見明顯的腫瘤形成。M：pBR322/Hinf，1：IMR-32，2：IMR-32/pIRV， 3：IMR-32/trkA3RT-PCR檢測轉化細胞系中外源基因表達情況討論神經(jīng)母細胞瘤的發(fā)生是胚胎發(fā)育過程中神經(jīng)嵴來源的母細胞在某些階段分化受阻的結果，而在此過程中，神經(jīng)營養(yǎng)因子及其相關受體的改變可能

18、不同程度地參與了該腫瘤的發(fā)生與發(fā)展過程。我們的主要研究內(nèi)容是基于課題組以往工作成果之上的繼續(xù)與深入，實驗思路以既往研究中兩項主要結論為出發(fā)點，即（1）NGF不能誘導包括IMR-32細胞系在內(nèi)的無NGFR表達的神經(jīng)母細胞瘤細胞分化，尤其是在MYCN基因擴增的情況下10；（2）通過基因重組技術在上述細胞系中恢復低親和性神經(jīng)營養(yǎng)因子受體表達之后，轉化細胞系仍不能在NGF作用之下出現(xiàn)形態(tài)學上的明顯分化11，提示低親和性NGFR所介導的信號傳導體系不足以引導神經(jīng)母細胞瘤細胞發(fā)生徹底的終末分化反應，因此，對神經(jīng)母細胞瘤細胞誘導分化的研究可能通過更有效的途徑深入下去。近年來的研究表明，trkA基因的表達產(chǎn)物

19、即高親和性NGFR所介導的信號傳導通路在NGF誘導包括神經(jīng)母細胞瘤在內(nèi)的多種神經(jīng)源性體外培養(yǎng)細胞分化過程中起到較為決定性的作用12，13。因此，觀察高親和性NGFR是否能介導神經(jīng)母細胞瘤細胞對NGF產(chǎn)生明顯的誘導分化反應即成為本研究的目的。46轉化細胞系在NGF誘導前后的形態(tài)特征，4為IMR-32母系的細胞形態(tài)，5為TrkA基因轉化后未加NGF的形態(tài)，6為TrkA基因轉化后的細胞系IMR-32/trkA在NGF處理5 d后，出現(xiàn)明顯的形態(tài)分化，細胞突起明顯延長，胞體變小變圓7Northern 雜交檢測轉化細胞系在NGF誘導前后神經(jīng)絲蛋白mRNA的表達情況表1MTT法測定各細胞系經(jīng)NGF誘導2周

20、后增殖代謝能力細胞系A550 nm(±s)抑制率(%)IMR-320.258±0.0170.00IMR-32/pIRV0.237±0.0110.08IMR-32/trkA0.028±0.00389.10表2各細胞系經(jīng)NGF誘導2周后軟瓊脂集落形成能力檢測細胞系集落數(shù)集落形成率(%)IMR-3265832.3637IMR-32/pIRV68333.6669IMR-32/trkA80.615我們首先成功獲得了表達外源基因的轉化細胞系，在進一步的NGF誘導分化實驗中發(fā)現(xiàn)，含有trkA外源基因表達的轉化細胞系在NGF的作用之下出現(xiàn)了明顯的誘導分化反應，而作為平行

21、對照的IMR-32母系以及空病毒載體轉化細胞系均未見分化反應；另外，我們再次平行對照了低親和性NGFR基因轉化細胞系在同一給藥條件下對NGF的反應，結果該細胞系僅表現(xiàn)出輕微的分化反應。通過對以上兩種分別表達高和低親和性NGFR的轉化細胞系的誘導分化過程的觀察，我們發(fā)現(xiàn)高親和性NGFR對NGF誘導神經(jīng)母細胞瘤細胞分化起到極為重要的作用，這種作用還特別表現(xiàn)在它所介導的分化反應的不可逆性，即誘導神經(jīng)母細胞瘤細胞發(fā)生明顯分化后再撤去NGF，已分化的細胞依然能夠維持既有的生存狀態(tài)，在23周的觀察期內(nèi)，細胞不再恢復到原來的幼稚狀態(tài)，而穩(wěn)定維持在一種低代謝率的分化狀態(tài)。轉化細胞在軟瓊脂內(nèi)集落形成能力明顯下降

22、，在裸鼠體內(nèi)亦不能形成腫瘤。從腫瘤細胞惡性表型得到較為完全的逆轉這個角度出發(fā)，我們的實驗結果具有相當重要的意義，因為這是實現(xiàn)對該腫瘤進行實驗性基因治療的重要和可靠的指標?；痦椖浚簢医艹銮嗄昊鹳Y助項目(39625012)；國家教委跨世紀優(yōu)秀人才計劃基金資助項目作者單位：折曉寧(100730 北京，中國醫(yī)學科學院 中國協(xié)和醫(yī)科大學 北京協(xié)和醫(yī)院病理科)陳杰(100730 北京，中國醫(yī)學科學院 中國協(xié)和醫(yī)科大學 北京協(xié)和醫(yī)院病理科)通訊作者：陳杰(Email:chenj)參考文獻1 Martin-Zanca D, Oskam R, Mitra G, et al. Molecular and b

23、iochemical characterization of the human trk proto-oncogene. Mol Cell Biol, 1989, 9:24-33.2Ma DD, Wang XM, Wang XH, et al. The expression of GDNF cDNA in nerve and non-nerve cell lines. J Beijing Med Univ, 1997, 29:2-5.3Felgner PL, Gadek TR, Holm M, et al. Lipofection: a highly efficient lipid-media

24、ted DNA transfection procedure. Proc Natl Acad Sci U S A, 1987, 84:7413-7417.4Palmer TD, Hock RA, Qsborne WR, et al. Efficient retrovirus-mediated transfer and expression of a human adenosine deaminase gene in diploid skin fibroblast from an adenosine deaminase deficient human. Proc Natl Acad Sci U

25、S A, 1987, 84:1055-1059.5Sambrook J, Fritsch EF, Maniatis T, et al. Molecular cloning: a laboratory manual. 2nd Eds. New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1988.9.31.6Hansen MB, Nielsen SE, Berg K. Re-examination and further development of a precise and rapid dye method for measuring cell growth/cell kill. J Immunol Methods, 1989, 119:203-210.7鄂征. 組織培養(yǎng)技術. 第2版. 北京：人民衛(wèi)生出版社，1989.156-158.8Yoshida H, Enomoto H, Tagawa M, et al. Impaired tumorigenicity and decreased liver metastasis of murine neuroblastoma cells engineered to secrete interleukin-2 or granulocyte macrophage colony-st