復(fù)合皮真皮-表皮連接區(qū)結(jié)構(gòu)再生與功能重建

1、    復(fù)合皮真皮-表皮連接區(qū)結(jié)構(gòu)再生與功能重建        摘要目的：為了解復(fù)合皮(CS)真皮-表皮連接(DEJ)區(qū)結(jié)構(gòu)再生及其對(duì)CS功能重建的作用機(jī)制。方法：用經(jīng)胰蛋白酶處理的異體乳豬真皮與自體表皮重組CS，并以自體表皮為對(duì)照(C組)，對(duì)移植術(shù)后2124周的活檢標(biāo)本作光鏡和透射電鏡觀察。結(jié)果：CS組表皮和真皮生長(zhǎng)快、成熟早，乳頭層組織疏松有序，毛細(xì)血管增生迅速，2024周時(shí)，乳頭和皮釘及以致密板為中心的半橋粒、錨絲、錨纖維等DEJ區(qū)結(jié)構(gòu)形成，以靠近毛細(xì)血管部位的上述結(jié)構(gòu)

2、再生迅速而密集；C組早期水泡發(fā)生率高(P<0.05)，DEJ區(qū)缺乏錨絲和錨纖維；至48周時(shí)上述結(jié)構(gòu)稀疏而不典型。結(jié)論：CS有較好的外觀、抗攣縮和耐磨功能與DEJ區(qū)結(jié)構(gòu)再生密切相關(guān)，異體乳豬真皮具有引導(dǎo)血管再生和正?；饔?，加速了DEJ區(qū)結(jié)構(gòu)形成和功能的重建。關(guān)鍵詞復(fù)合皮；真皮-表皮連接；皮膚移植結(jié)構(gòu)；功能中分類(lèi)號(hào)R322.991文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼A文章編號(hào)1001-7399(2000)05-0397-04Structural restoration and functional reformation in dermal-epidermal junction zone of composite

3、skinJiang DuyingChen BiHu DahaiTang Chaowu（Department of Burns,Xijing Hospital,Fourth Military Medical University,Xian710032）Shi Yenghui（Center of Electron Microscopy,Department of Basic Medicine,Fourth Military Medical University,Xian710032）ABSTRACTPurposeTo investigate the mechanism of structure r

4、eformation in dermal-epidermal junction(DEJ) zone of composite skin(CS) with allogeneic newborn pig dermis and its significance to functional restoration of CS. MethodsBiopsied specimens from experimental group using CS made of trypsin-treated frozen allogeneic newborn pig dermis and autologous epid

5、ermis(group CS) and control group using autologous epidermis alone (group C) respectively,were observed and compared under the light microscope and transmission electron microscope during the weeks 2 to 124 after graft operation. ResultsThe epidermis and dermis grew faster and matured earlier with l

6、oose and regular tissue structure and rapid rate of angiogenesis in papillary layer in the groups CS. By weeks 20 to 24 after graft operation,the reformation of papillae,dermal ridges and half-desmosomes,anchoring filaments and anchoring fibers converging around the dense laminae appeared in DEJ zon

7、e of group CS occurred with performing more rapidly and densely near the new microvessels. There was a higher incidence of blister in the early stage in the group C(P<0.05),without reformation of anchoring filaments or anchoring fibers which appeared scattering and untypical in DEJ zone until wee

8、k 48 postoperation. ConclusionThe characteristics of the CS,such as good-looking appearance,anti-contracture and tolerance to abrasive force,might closely relate to the structural reformation of DEJ zone. Allogeneic newborn pig dermis could improve the angiogenesis and remodeling of new blood vessel

9、s and subsequently accelerate the structural and functional reformation of DEJ zone.KEY WORDSskin;dermal-epidermal junction;skin transplantation;microscopy,electron復(fù)合皮(composite skin,CS)的研制和應(yīng)用揭開(kāi)了組織修復(fù)學(xué)的嶄新一頁(yè)。隨著近年來(lái)研究的不斷深入，國(guó)外已有不少學(xué)者注意到CS移植后真皮-表皮連接(dermal-epidermis junction,DEJ)區(qū)的表皮規(guī)范物質(zhì)釘、真皮乳頭、基膜帶(BMZ)、錨絲(

10、anchoring filaments)及其錨纖維(anchoring fibrils)等結(jié)構(gòu)再生影響CS質(zhì)量或功能重建1，2，并有將DEJ區(qū)結(jié)構(gòu)再生情況作為評(píng)判CS中真皮替代物質(zhì)量?jī)?yōu)劣標(biāo)準(zhǔn)的趨勢(shì)。本研究在豬CS動(dòng)物模型建立的基礎(chǔ)上3，對(duì)移植術(shù)后2124周的活檢標(biāo)本作組織學(xué)和透射電鏡的動(dòng)態(tài)觀察。1材料和方法1.1CS制作及移植方法以出生2天的7頭小白乳豬為異體真皮的供體，無(wú)菌條件下剝?nèi)∪衿?，用取皮鼓反取厚約0.3 mm的真皮，經(jīng)抗凍液處理，液氮內(nèi)貯存。移植前快速?gòu)?fù)溫，用0.25%胰蛋白酶消化脫細(xì)胞后備用。選擇體重710 kg不同種源健康小白豬作復(fù)合皮移植受體，于脊柱兩側(cè)各設(shè)計(jì)70 mm

11、15;70 mm大小的正方形創(chuàng)面3塊，每塊間隔1.5 cm，取下的全厚皮膚經(jīng)取皮鼓反取約0.1 mm厚完整自體刃厚皮片，再經(jīng)0.25%胰蛋白酶內(nèi)消化，小心分離整張表皮備用。把經(jīng)酶處理的冷凍異體乳豬真皮與自體表皮重疊(CS組)，一次性移植于受體7頭豬的19塊創(chuàng)面上，另以相同大小和方法處理的8塊自體表皮片(C組)為對(duì)照，兩組移植部位的機(jī)率均等。移植后常規(guī)打包包扎，分圈喂養(yǎng)。具體移植方法同文獻(xiàn)報(bào)道3。1.2一般觀察術(shù)后2周首次打開(kāi)創(chuàng)面，常規(guī)換藥，于2124周觀察皮片成活、表面水泡和瘢痕生長(zhǎng)和皮片面積(mm2)變化情況(表1)。1.3標(biāo)本留取兩組在上述各時(shí)間點(diǎn)(術(shù)后24周內(nèi)，每隔2周)用直徑5 mm活

12、檢針穿刺留取標(biāo)本23塊，并取附近正常皮膚(NS)作對(duì)照。對(duì)發(fā)生水泡的部位及時(shí)留取標(biāo)本，入4%多聚甲醛緩沖液內(nèi)固定。1.4DEJ區(qū)結(jié)構(gòu)觀察方法所有標(biāo)本常規(guī)作HE和VG染色，觀察皮釘和乳頭等一般結(jié)構(gòu)再生情況。兩組各時(shí)間點(diǎn)選6個(gè)標(biāo)本按常規(guī)方法制作透射電鏡(TEM)樣本，觀察DEJ區(qū)BMZ的超微結(jié)構(gòu)變化。其中對(duì)術(shù)后8周、24周和72周標(biāo)本統(tǒng)計(jì)5個(gè)不同視野內(nèi)DEJ區(qū)半橋粒和錨纖維數(shù)(表2)，行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。2結(jié)果2.1外觀CS組和C組皮片成活率差異無(wú)顯著性(P>0.05)。57周時(shí)，CS和C組分別有16%(3/19)和63%(5/8)的皮片表面有水泡產(chǎn)生，二者相差顯著(P<0.001)。CS組

13、表面光滑、柔軟(較正常皮膚彈性稍差)，89.7%(17/19)皮片表面無(wú)瘢痕，色質(zhì)正常，隨著豬的長(zhǎng)大，皮片面積增加。C組表面潮紅，手感質(zhì)韌，凹凸不平，75%(6/8)的皮片有條索狀瘢痕增生攣縮。CS組和C組皮片面積變化如表1。2.2組織學(xué)觀察2.2.1CS組26周內(nèi)，DEJ界面平坦，真皮淺層毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞(VEC)和成纖維細(xì)胞(Fb)增生活躍，深層有較多的淋巴細(xì)胞和單核細(xì)胞浸潤(rùn)。712周，組織炎性水腫逐漸消退，表皮基底細(xì)胞(BC)增生，真皮淺層組織疏松，新生的毛細(xì)血管長(zhǎng)至表皮下。1320周，毛細(xì)血管淺 層的BC凸出生長(zhǎng)，相鄰兩個(gè)毛細(xì)血管之間的BC長(zhǎng)入真皮內(nèi)，分別形成原始乳頭和皮釘，真皮深層膠

14、原纖維增粗致密，真皮乳頭層和網(wǎng)狀層結(jié)構(gòu)清晰可辨。2432周，原始乳頭內(nèi)的VEC和Fb繼續(xù)增殖，乳頭加深，頂部橫徑擴(kuò)大，部分乳頭相互融合，水平切面上皮嵴呈網(wǎng)狀，此期皮嵴、乳頭成熟。3672周，乳頭和皮釘粗大，表面有皮紋出現(xiàn)，真皮中仍有少數(shù)淋巴細(xì)胞、巨噬細(xì)胞滯留。96周后，上述結(jié)構(gòu)變淺呈退化趨勢(shì)。2.2.2C組早期大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)至表皮下，3周后開(kāi)始消退，真皮層內(nèi)可見(jiàn)較多肌Fb呈團(tuán)索狀增生，膠原纖維粗大、密集，排列雜亂，毛細(xì)血管稀少。58周，在皮片產(chǎn)生水泡的部位，真皮與表皮分離，泡液內(nèi)有少量炎性細(xì)胞和較多的壞死組織碎片。924周，真皮組織明顯增生增厚，淺層雖有少量毛細(xì)血管，但血管與表皮之間有致密的

15、基質(zhì)間隔，皮釘和乳頭形成十分緩慢。至72周時(shí)，只有稀少粗而淺的不典型皮釘和乳頭結(jié)構(gòu)。2.3TEM觀察2.3.1正常皮膚真皮淺層結(jié)構(gòu)疏松，基質(zhì)均勻，膠原纖細(xì)，有典型密集的DEJ結(jié)構(gòu)：BC胞漿膜為中心的細(xì)胞內(nèi)張力絲一漿膜不規(guī)則凹陷，與BMZ之間構(gòu)成的半橋粒結(jié)構(gòu)，和以致密板為中心的由來(lái)自真皮的細(xì)纖維(透明層內(nèi)錨絲)致密板錨纖維結(jié)構(gòu)，及真皮淺層包含于纖維間隙的膠原纖維、微原纖維和基質(zhì)。2.3.2CS組2周時(shí)已有連續(xù)、均一和平滑的BMZ，BC內(nèi)可見(jiàn)張力絲；36周，真皮淺層結(jié)構(gòu)疏松，BC、VEC和Fb內(nèi)核染色質(zhì)、線粒體和粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)豐富，新生膠原纖細(xì)；8周時(shí)，間隔規(guī)律的毛細(xì)血管緊鄰BMZ，其淺面已有半橋粒及

16、其錨絲，且較其它部位密集。錨纖維最先發(fā)生于半橋粒附近；916周，上述結(jié)構(gòu)明顯增多，至20周時(shí)，已有較完整的DEJ結(jié)構(gòu)形成，半橋粒和致密板增厚，電子密度明顯提高，錨纖維、錨絲和微原纖維等結(jié)構(gòu)明顯增多，同樣乳頭內(nèi)靠近毛細(xì)血管部位的DEJ上述結(jié)構(gòu)再生早，成熟快，且錨纖維在BC膜不規(guī)則陷凹處濃集。3172周，BMZ增厚，電子密度普遍提高，半橋粒和錨纖維等結(jié)構(gòu)在數(shù)量上變化不明顯，但特征更加明晰。96周后，上述DEJ結(jié)構(gòu)有退化(電子密度下降，數(shù)量減少等)趨勢(shì)。表1CS組和C組移植后皮片面積變化比較(±s,mm2)組別移植后時(shí)間(周)281624365272108124CS3454±(1

17、8) 425*3019±(11)10413644±(11)12415256±(10)10478617±(7)1721*10288±(7)1171*13321±(7)1629*13208±(7)1429*13118±(7)1239*C4237±(7)8783232±(7)6502780±(6)11533700±(6)8925521±(6)14216701±(6)11048037±(6)9798662±(4)10168436±(4

18、)9872檢驗(yàn)，CS與C組比較*P<0.05，*P<0.01(注：括號(hào)內(nèi)位皮片塊數(shù)，未成活皮片未列入)表2CS組和C組DEJ區(qū)超微結(jié)構(gòu)再生比較(±s, 陽(yáng)性結(jié)構(gòu)數(shù)/視野，n=6)超微 結(jié)構(gòu)8周24周72周CSCCSCCSC半橋粒2.03±0.62#0.63±0.374.73±0.78*#1.88±0.74*5.06±0.63#2.30±0.79錨纖維1.62±0.65#0.77±0.405.45±1.34*#2.70±0.92*6.35±0.85#3.55

19、7;1.24t檢驗(yàn)，#CS組與C組比較，*CS組和C組組內(nèi)比較；#/*P<0.05，#/*P<0.01，#/*P<0.001 2.3.3C組2周時(shí)，BMZ極薄，呈斷續(xù)狀。36周可見(jiàn)胞漿內(nèi)分別含肌微絲和張力絲的肌Fb和BC增生活躍。718周，真皮淺層新生膠原纖維粗大、致密，少見(jiàn)的毛細(xì)血管與BMZ之間有較高電子密度的基質(zhì)間隔，BMZ增厚、呈片狀；在有水泡形成的部位，表皮和真皮自透明層分離，透明層及其深層缺乏錨絲和錨纖維連接。1930周，BC內(nèi)的張力絲增多，BMZ及其深層基質(zhì)的電子密度明顯增高，錨纖維、微原纖維、半橋粒等結(jié)構(gòu)再生稀疏，至72周時(shí)，DEJ結(jié)構(gòu)分布仍不規(guī)律，缺乏典型特征

20、。CS組和C組在電鏡下半橋粒和錨纖維結(jié)構(gòu)比較見(jiàn)表2。 3討論CS是一種新型的創(chuàng)面覆蓋物，因其具有：永久地覆蓋創(chuàng)面；較好的組織彈性，耐磨性和抗攣縮；外觀質(zhì)地似正常皮膚4等優(yōu)點(diǎn)而倍受各國(guó)學(xué)者的關(guān)注。近年來(lái)，越來(lái)越多的人把注意力集中于CS結(jié)構(gòu)與功能關(guān)系方面的研究，但缺乏系統(tǒng)研究報(bào)道。Langdon等1首先利用免疫組化和電鏡技術(shù)證實(shí)，CS移植后95天，BMZ恢復(fù)正常水平，錨纖維最先發(fā)生于半橋粒附近，水泡形成減少，皮膚功能在細(xì)胞和間質(zhì)的結(jié)構(gòu)重建中已趨于正常，而單純細(xì)胞膜片移植，45月后才見(jiàn)到含型膠原的致密板，錨纖維數(shù)量很少，甚至缺失。Hickerson等2，5實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，CS組偶爾產(chǎn)生水泡，皮色正常，

21、愈合后的皮膚柔軟，和傳統(tǒng)的斷層皮相比，既有耐磨性，又能抵抗創(chuàng)傷的感染，免疫組化和超微結(jié)構(gòu)顯示，在真皮底物上移植(培養(yǎng)的)自體表皮加速了皮膚再生，表皮及真皮間的嵴突明顯，錨纖維多，表皮角化快，至7個(gè)月時(shí)，CS組已呈現(xiàn)嵴突，而單純自體表皮組DEJ區(qū)平坦。Langdon等1在CS移植11個(gè)月時(shí)，組織學(xué)仍未見(jiàn)正常起伏的網(wǎng)嵴結(jié)構(gòu)。目前普遍認(rèn)為，皮膚的彈性、牢固性和抗攣縮性可能與表皮嵴、真皮乳頭和BMZ(尤其是錨纖維)結(jié)構(gòu)的完整性有關(guān)。DEJ是電鏡水平描述皮膚真皮與表皮之間連接的概念6，近年在CS結(jié)構(gòu)與功能關(guān)系研究中得到重視，目前尚缺乏統(tǒng)一的評(píng)價(jià)指標(biāo)。我們認(rèn)為，影響CS功能的主要結(jié)構(gòu)因素DEJ，應(yīng)按光鏡和

22、電鏡二級(jí)水平來(lái)進(jìn)行認(rèn)識(shí)，僅就電鏡水平的DEJ結(jié)構(gòu)并不能全面反映影響CS質(zhì)量的結(jié)構(gòu)因素。光鏡水平DEJ結(jié)構(gòu)包括真皮與表皮之間的皮釘、BMZ和乳頭；DEJ電鏡結(jié)構(gòu)是指由多種超微結(jié)構(gòu)組成的BMZ，包括BC的漿膜、半橋粒、透明帶(內(nèi)含錨絲)、致密板和基膜下纖維帶(含錨纖維、微原纖維和膠原纖維)及其纖維間的基質(zhì)6，7。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，CS組具有較好的彈性、耐磨性和抗攣縮功能，表皮和真皮生長(zhǎng)快、成熟早，真皮淺層組織疏松，毛細(xì)血管增生迅速，824周DEJ區(qū)乳頭、皮嵴、BMZ等光鏡結(jié)構(gòu)和半橋粒、錨絲、錨纖維等電鏡結(jié)構(gòu)再生迅速，24周時(shí)上述結(jié)構(gòu)成熟，此后無(wú)明顯變化。C組24周可見(jiàn)表皮有較多纖維組織，可能與表皮含

23、少量真皮組織、創(chuàng)基殘留和深筋膜增生所致。此外，我們發(fā)現(xiàn)靠近毛細(xì)血管附近的DEJ結(jié)構(gòu)再生快而密集，這可能與BC和VEC均有形成BMZ的能力8及局部營(yíng)養(yǎng)豐富有關(guān)。光鏡下BC的基底，鋸齒狀的BMZ相當(dāng)于電鏡下呈膜狀突起產(chǎn)生的裂隙，構(gòu)成了一個(gè)有助于錨纖維1、半橋粒和錨絲等結(jié)構(gòu)再生的微環(huán)境。DEJ區(qū)結(jié)構(gòu)先于光鏡結(jié)構(gòu)的再生，雖不能說(shuō)具有某種因果關(guān)系，但二者相輔相成，構(gòu)成完整的DEJ的結(jié)構(gòu)因素。正常皮膚真皮與表皮連接最薄弱之處為BMZ中的透明層9。C組58周時(shí)，皮片機(jī)械脆性增加，易產(chǎn)生水泡，與BMZ缺少錨絲和錨纖維有關(guān)。此后，隨著上述結(jié)構(gòu)緩慢再生，水泡呈減少趨勢(shì)，但瘢痕增生明顯，主要原因可能與缺少真皮成分對(duì)

24、Fb的抑制作用10及其引導(dǎo)性組織再生作用有關(guān)11，使Fb過(guò)度增殖、膠原和硫酸軟骨素等過(guò)量沉積，導(dǎo)致毛細(xì)血管樹(shù)型結(jié)構(gòu)和DEJ結(jié)構(gòu)再生受阻。綜上所述，決定移植皮片質(zhì)量或功能的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)不僅與錨纖維再生有關(guān)1，可能還有DEJ區(qū)其它多種結(jié)構(gòu)立體參與，即以乳頭、BMZ、皮嵴為代表的光鏡結(jié)構(gòu)和以錨纖維、半橋粒、錨絲為代表的BMZ電鏡結(jié)構(gòu)。經(jīng)胰蛋白酶和冷凍處理的異體乳豬真皮具有引導(dǎo)CS早期毛細(xì)血管樹(shù)型結(jié)構(gòu)再生和正?；淖饔?1，對(duì)CS DEJ區(qū)結(jié)構(gòu)再生及其功能的有效重建發(fā)揮先導(dǎo)作用?；痦?xiàng)目：國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(No 39070822)作者簡(jiǎn)介：姜篤銀，男，34歲，博士，主治醫(yī)師作者單位：姜篤銀（第四軍

25、醫(yī)大學(xué)西京醫(yī)院燒傷外科）陳璧（第四軍醫(yī)大學(xué)西京醫(yī)院燒傷外科）史穎輝（第四軍醫(yī)大學(xué)基礎(chǔ)部電鏡中心，西安710033）胡大海（第四軍醫(yī)大學(xué)西京醫(yī)院燒傷外科）湯朝武（第四軍醫(yī)大學(xué)西京醫(yī)院燒傷外科）參考文獻(xiàn)1，Langdon RC,Cuono CB,Birchall N et al. Reconstitution of structure and cell function in human skin grafts derived from cyopersserved allogeneic dermis and autologous cultured keratinocytes. J Invest Dermatol,1988;91(3):4784