實驗26吲哚乙酸含量與吲哚乙酸氧化酶活性的測定

1、實驗26吲哚乙酸含量與吲哚乙酸氧化酶活性的測定  植物體內(nèi)生長素的種類很多，其中吲哚乙酸（ 1AA ）是植物體內(nèi)普遍存在的一種生長素。于不同的生育期測定不同器官中 IAA 的含量以及 IAA 氧化酶的活性，對于研究植物的生長、發(fā)育、衰老、脫落等均有重要意義。 吲哚乙酸含量的測定 一、原理 1947 年，我國植物生理學(xué)家湯玉瑋等發(fā)現(xiàn)，在無機(jī)酸存在下，吲哚乙酸能與 FeCl 3 作用，生成紅色的鰲合物。該物質(zhì)在 530 nm 有最大吸收峰，由此引出 IAA 的比色定量測定，此法可測出 g 量級的 IAA 。 二、實驗材料、試劑與儀器設(shè)備 （一）實驗材料 玉米種子。 （二）試劑 1. IA

2、A 標(biāo)準(zhǔn)溶液：精確稱取 IAA （ A.R. ） 10 mg ，先用少量乙醇溶解，后用蒸餾水定容至 100 mL （其濃度為 100 g/mL ）作為貯備液；然后用貯備液配成 0 （空白）、 0.5 、 1.0 、 5.0 、 10.0 、 15.0 、 20.0 、 25.0 g/mL 的系列濃度標(biāo)準(zhǔn)溶液，作為工作液（現(xiàn)用現(xiàn)配）。 2. 試劑 A ：內(nèi)含 0.5 mol/L FeCl 3 溶液 15 mL 、濃 H 2 SO 4 （比重 1.84 ） 300 mL 、蒸餾水 500 mL ，于使用前混合搖勻，避光保存， l mL 試液需加此試劑 4 mL 。 3. 試劑 B ：內(nèi)含 0.5

3、mol/L FeCl 3 溶液 10 mL 、 35 高氯酸 500 mL ，于使用前混合搖勻，避光保存， l mL 試液應(yīng)加此試劑 2 mL 。試劑 A 與試劑 B 可任選一種（試劑 B 比試劑 A 靈敏）。 4. 0.1 mol/L NaOH 溶液。 5. 甲醇。 （三）儀器設(shè)備 分光光度計，離心機(jī)，粉碎機(jī)，天平，水浴鍋，移液管，大試管，燒杯。 三、實驗步驟 1. 標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制 取干潔大試管 8 支（ 0 7 號），依次加入 IAA 系列濃度工作液 2 mL ，分別加入試劑 B 4 mL （或試劑 A 8 mL ），于 40 溫箱中暗保溫 30 min （加速顯色反應(yīng)）；于 530 nm

4、下比色，以 OD 值為縱坐標(biāo)，以 IAA 濃度（ g/mL ）為橫坐標(biāo)，繪出一條標(biāo)準(zhǔn)曲線。 2. 生長素的提取與測定 將風(fēng)干的玉米種子（最好是白玉米）用粉碎機(jī)磨成細(xì)粉（約 lmm 大小的細(xì)粒，太粗提取不完全，太細(xì)加熱時易糊化而使離心困難）；稱取粉末 10 g 裝入燒杯，加入 0.1 mol/L NaOH 溶液 40 mL ，于 100 水浴中煮沸 15 min （上面加蓋防止水分蒸干）；取出燒杯后再向其內(nèi)加入 0.1 mol/L NaOH 溶液 25 mL ，充分搖勻，用甲醇定容至 100 mL ，靜置 30 min ，取上層液離心 30 min ，上清液即為 IAA 提取液。 取干潔大試管

5、2 支，依次各加入上述樣品 IAA 提取液 2 mL 和試劑 B 4 mL （或試劑 A 8 mL ），于 40 溫箱中顯色 30 min ，在 530 nm 下比色（以標(biāo)準(zhǔn)曲線的“ 0 ”調(diào)零），記錄 OD 值。 四、結(jié)果計算 式中： A 標(biāo)準(zhǔn)曲線上查得的 IAA 量， g 。 V l 樣品提取液體積， mL 。 W 樣品重量， g 。 V 2 樣品反應(yīng)液體積， mL 。   吲哚乙酸氧化酶活性的測定 一、原理 吲哚乙酸在吲哚乙酸氧化酶作用下，被分解成不活躍的物質(zhì)。植物體內(nèi)吲哚乙酸氧化酶活力的大小，對調(diào)節(jié)體內(nèi)吲哚乙酸的水平起著重要的作用。酶活力的大小可用其破壞吲哚乙酸的速度表示，吲

6、哚乙酸的含量可用比色法測定。 二、實驗材料、試劑與儀器設(shè)備 （一）實驗材料 大豆或綠豆幼苗的下胚軸。 （二）試劑 1 0.02 mol/L 磷酸緩沖液（ pH6.1 ）。 2 1 mmol/L MnCl 2 ：稱取 MnCl 2 · 4H 2 O 19.8 mg 用蒸餾水定容至 100mL 。 3 1 mmol/L 2,4 二氯酚：稱取二氯酚 16.3 mg 用蒸餾水定容至 100mL 。 4 200 g /mL IAA 。 5 試劑 A ：內(nèi)含 0.5 mol/L FeCl 3 溶液 15 mL 、濃 H 2 SO 4 （比重 1.84 ） 300 mL 、蒸餾水 500 mL ，

7、于使用前混合搖勻，避光保存， l mL 試液需加此試劑 4 mL 。 6 試劑 B ：內(nèi)含 0.5 mol/L FeCl 3 溶液 10 mL 、 35 高氯酸 500 mL ，于使用前混合搖勻，避光保存， l mL 試液應(yīng)加此試劑 2 mL 。試劑 A 與試劑 B 可任選一種（試劑 B 比試劑 A 靈敏）。 （三）儀器設(shè)備 分光光度計，離心機(jī)，研缽，移液管（ 5 mL 2 支， 2 mL 2 支， 1 mL 4 支），燒杯 1 個，恒溫水浴，天平，試管 12 支。 三、實驗步驟 1. 吲哚乙酸氧化酶的制備 （ 1 ）將大豆或綠豆種子于 30 溫箱中萌發(fā) 3 4 天，選取生長一致的幼苗，除去子

8、葉，留下胚軸作實驗材料。 （ 2 ）取 20 株下胚軸，稱得重量，置于研缽中加入冰冷的磷酸緩沖液（ pH6.1 ） 5 mL 及石英砂少許，于冰浴中研磨成勻漿，再按 100 mg 鮮重加 1 mL 緩沖液的比例稀釋之，離心（ 4000 rpm ） 20 min ，所得上清液即為酶液。 2. 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作 （ 1 ）配制吲哚乙酸的系列標(biāo)準(zhǔn)溶液，其濃度分別為 0 、 0.5 、 1.0 、 2.5 、 5 、 10 、 15 、 20 、 25g/mL 。 （ 2 ）取干潔的大試管 9 支，每支加入試劑 B 4 mL ，再分別加入不同濃度的 IAA 溶液各 2 mL ，搖勻，于 40 的溫箱中保

9、溫 30 min ，使反應(yīng)呈紅色。 （ 3 ）取反應(yīng)液用分光光度計進(jìn)行測定，測定時用波長 530 nm 。以 IAA 濃度（ g/mL ）為橫坐標(biāo)，光密度值為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。 3. 吲哚乙酸氧化酶的活性測定 （ 1 ）取 2 支試管編號， 1 號試管中加 MnCl 2 1mL ， 2,4- 二氯酚 1mL ， 200g/mL IAA 2 mL ，酶液 1 mL ，磷酸緩沖液 5 mL ，混合均勻； 2 號試管，其中除酶液用磷酸緩沖液 1 mL 代替外，其余成分相同。將 2 支試管置于 25 恒溫水浴中作用 30 min 。 （ 2 ） 30 min 后，取 2 支試管編 1 、 2 號，先于每支試管中加入試劑 B 4 mL ，然后分別取反應(yīng)混合液各 2 mL 加入到有試劑 B 的相應(yīng)標(biāo)記的試管中，小心地混勻，于 40 的溫箱中保溫 30 min ，使反應(yīng)液呈紅色。 （ 3 ）在分光光度計上 530 nm 下比色測定，讀出光密度，根據(jù)讀數(shù)從標(biāo)準(zhǔn)曲線上查出相應(yīng)的 IAA 濃度。 （ 4 ）從開始時加入的吲哚乙酸量減去酶作用后殘留的吲哚乙酸量，即得被酶所分解破壞的吲哚乙