氨基胍對(duì)白介素-1β損傷的離體大鼠胰島細(xì)胞的保護(hù)作用

1、    氨基胍對(duì)白介素-1損傷的離體大鼠胰島細(xì)胞的保護(hù)作用        摘要目的：觀察氨基胍(AG)對(duì)白細(xì)胞介素-1(IL-1 )誘導(dǎo)的胰島細(xì)胞損害的作用。方法：應(yīng)用體外單層培養(yǎng)的大鼠胰島細(xì)胞， 分別檢測(cè)IL-1、AG及其聯(lián)合對(duì)胰島細(xì)胞亞硝酸鹽生成、胰島素分泌以及胞內(nèi)DNA、胰島素 含量和細(xì)胞活性的影響。結(jié)果：以IL-1誘導(dǎo)，胰島細(xì)胞亞硝酸鹽生成量顯著增加；同時(shí)胰島素基 礎(chǔ)分泌以及葡萄糖刺激的胰島素釋放均明顯減少；胰島細(xì)胞內(nèi)DNA、胰島素含量及細(xì)胞活性( MTT值)均顯著下

2、降(均P0.01)；AG能阻斷這些抑制效應(yīng)(均P0.01)。 結(jié)論：IL-1通過(guò)一 氧化氮(NO)介導(dǎo)對(duì)胰島細(xì)胞有細(xì)胞活性抑制和毒性效 應(yīng)。AG可能是一種有效的iNOS抑制劑，通過(guò)阻斷NO生成起到細(xì)胞保護(hù)作用。主題詞白細(xì)胞介素-1；一氧化氮；胰島 The protective effects of aminoguanidine against interleukin-1 -induceddestruction of isolated rat pancreatic islets of LangerhansCHEN Hong, CAI De-Hong, WANG Mei, LIU Hong, YE

3、 Ren-QingDepartment of Endocrinology, Zhujiang Hospital, The First Military Medica l University, Guangzhou(510282)Abstract AIM：The effects of aminoguanidine (AG) on interleuki n -1-induced destruction of isolated rat pancreatic islets of Langerhans were ob seved. METHODS：Isolated pancreatic islet ce

4、lls from SD rat were c u ltured in monolayer in vitro. Nitrite production, insulin release, islet cel l DNA and insulin content, and cell activity (MTT assay) in rat pancreatic islet cells incubated with IL-1, AG, singly and in combination, were measured. RESULTS：IL-1 induced a significant increase

5、in nitrite produtio n, inhibited the medium insulin accumulation and the glucose-stimulated insulin release, and decreased islet cell DNA and insulin content and MTT reduction ( P0.01), which were blocked by AG(P0.01). CONCLUSION： The cytotoxicity of IL-1 on pancreati c islets might be mediated by n

6、itric oxide (NO), and that AG prevented IL-1-in duced destruction of pancreatic islets as a inhibitor of NO formation.MeSHInterleukin-1; Nitric oxide; Islets of Langerhans胰島素依賴型糖尿病(insulin-dependent diabetes mellitus, IDDM) 是一種胰島細(xì)胞選擇性破壞的自身免疫性疾病。其病理表現(xiàn)為，大量免疫炎性細(xì)胞浸潤(rùn)胰 島，并分泌細(xì)胞因子，逐漸導(dǎo)致胰島細(xì)胞的完全破壞。近 年來(lái)許多研究證實(shí)細(xì)胞

7、因子對(duì) 胰島細(xì)胞有抑制和細(xì)胞毒作用。一些研究還表明，細(xì)胞因子可能是通過(guò)一 氧化氮(nitric oxide, NO)的介導(dǎo)而導(dǎo)致胰島細(xì)胞的損害1。本文應(yīng)用體外培養(yǎng)的大鼠胰島 細(xì)胞，觀察IL-1對(duì)胰島細(xì)胞NO生成、胰島素分泌以及胞內(nèi)DNA、胰島素含量和細(xì)胞活性 的影響，并進(jìn)一步觀察和探討氨基胍(aminoguanidine, AG)的作用及其機(jī)制。材料與方法(一)材料：膠原酶(型)、氨基胍、二甲基亞砜購(gòu)自Sigma公司。RPMI-1640培養(yǎng)液為Gibco 產(chǎn)品。人重組IL-1、NO測(cè)試試劑盒購(gòu)自軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院。胰島素放免分析試劑盒購(gòu)自3V公 司。MTT為Fluka公司產(chǎn)品。蛋白酶-K、RNas

8、e-A購(gòu)自Bocheringer Mannheim公司。SD大鼠 購(gòu)自中山大學(xué)生命科學(xué)中心。(二)大鼠胰島細(xì)胞的分離與培養(yǎng)：按胡遠(yuǎn)峰等的方法2略加改動(dòng)。雄性健康SD大 鼠，重250300 g，于無(wú)菌條件下取出胰腺，置Hanks液中洗凈，剪成碎片。用Hanks液反復(fù) 洗滌3次，加入膠原酶(0.5 mg/mL, pH 7.6)，置(38±1)水浴中逐級(jí)消化分離。收集分 離的細(xì)胞與細(xì)胞團(tuán)洗滌，接種于含15%小牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)液。將細(xì)胞濃度調(diào)整至1×1 09/L，置CO2培養(yǎng)箱(Napco)內(nèi)，95%空氣/5 CO2、37恒溫培養(yǎng)。24 h后轉(zhuǎn)入2 4孔培養(yǎng)板(Cor

9、ning)，每孔細(xì)胞數(shù)為1×106。8 h后用新鮮配制的2.5 g/mL碘乙酸處 理56 h，以去除成纖維細(xì)胞。每23 d調(diào)換全部培養(yǎng)液1次。繼續(xù)培養(yǎng)4 5 d，直至細(xì)胞 充分鋪展形成良好的胰島細(xì)胞單層。取同批單層培養(yǎng)細(xì)胞吸去原培養(yǎng)液后，分別加入含IL-1 (20 U/mL)，AG(1 mmol/L)及兩者聯(lián)合的培養(yǎng)液，同時(shí)設(shè)置對(duì)照組，置于95%空氣/5% CO 2、37恒溫培養(yǎng)24 h，同步留取培養(yǎng)液，分裝，-20貯存，待測(cè)亞硝酸鹽和胰島素含量， 然后行葡萄糖刺激的胰島素釋放試驗(yàn)。并測(cè)定胞內(nèi)DNA和胰島素含量及細(xì)胞活性。(三)NO含量測(cè)定：通過(guò)分光光度法測(cè)定培養(yǎng)液NO代謝產(chǎn)物亞硝酸

10、鹽累積量來(lái)反映一定時(shí)間內(nèi) NO的生成量。批內(nèi)變異系數(shù)為3.3%，批間變異系數(shù)為6.4%。(四)胰島素水平測(cè)定：采用放射免疫雙抗體法。批內(nèi)變異系數(shù)為5.8%，批間變異系數(shù)為12 .5%。(五)胞內(nèi)DNA含量測(cè)定：DNA提取方法參照Sellins等的方法3加以改動(dòng)。以0.25 mg/mL胰蛋白酶處理單層培養(yǎng)細(xì)胞，離心收集細(xì)胞，洗滌，加入500 L細(xì)胞裂解液(含蛋白 酶-K 0.4 mg/mL)，置50水浴3 h后，13 000 r/min，離心10 min,-4。取上清，加入2 mol/L NaCl溶液(終濃度0.2 mmol/L)和2倍體積的無(wú)水乙醇沉淀16 h，-20。同上離心， 棄上清，加入

11、70%乙醇漂洗。同上離心，棄乙醇，待干燥后，加入50 L含RNase-A的TE溶液 溶解沉淀，65水浴30 min。取TE溶液，采用紫外分光光度法測(cè)定。(六)胞內(nèi)胰島素含量測(cè)定：收集單層培養(yǎng)細(xì)胞，用Hanks液洗滌3次，經(jīng)反復(fù)凍融破碎，加入 酸化乙醇溶液(0.18 mmol/L HCl:無(wú)水乙醇=13體積比)，4孵育16 h，留取標(biāo)本，待測(cè) 胰島素含量。(七)細(xì)胞活性測(cè)定：采用MTT比色分析法。(八)葡萄糖刺激的胰島素釋放試驗(yàn)：取單層培養(yǎng)細(xì)胞，用KRBB液(含1.67 mmol/L葡萄糖)洗 滌3次，加入KRBB液(含1.67 mmol/L葡萄糖)，培養(yǎng)1 h后，留取培養(yǎng)液。并用KRBB液(含

12、16 .7 mmol/L葡萄糖)更換，繼續(xù)培養(yǎng)1 h，留取培養(yǎng)液，待測(cè)胰島素含量。(九)統(tǒng)計(jì)方法：所有實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均標(biāo)化成每106個(gè)胰島細(xì)胞某物質(zhì)的含量 。數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示，組間差異顯著性用t檢驗(yàn)。結(jié)果一、AG對(duì)IL-1誘導(dǎo)胰島細(xì)胞亞硝酸鹽生成的影響：AG對(duì)基礎(chǔ)條件下胰島細(xì)胞亞硝酸鹽的生成量無(wú)明顯影響(P0.05)。以IL-1誘導(dǎo)，胰 島細(xì)胞亞硝酸鹽生成量顯著增加(P0.01)。AG對(duì)IL-1誘導(dǎo)的亞硝酸鹽生成有阻抑作 用(P0.01)，如表2所示。二、AG對(duì)IL-1抑制胰島素分泌的影響：與對(duì)NO生成的作用相對(duì)應(yīng)，AG對(duì)胰島素基礎(chǔ)分泌也無(wú)明顯影響(P0.05)。改

13、變培養(yǎng)液 葡萄糖濃度(1.67或16.70 mmol/L)結(jié)果無(wú)明顯變化(P0.05)。當(dāng)用IL-1誘導(dǎo)時(shí)， 在葡萄糖11.1 mmol/L(培養(yǎng)液所含葡萄糖濃度)、1.67 mmol/L、16.70 mmol/L條件下，均 致胰島素分泌明顯減少(P0.01)。AG呈現(xiàn)對(duì)抑制的保護(hù)性效應(yīng)(P0.01)，見(jiàn)表 1。表1AG對(duì)IL-1抑制胰島素分泌的作用Tab 1 Effect of AG on IL-1-induced inhibition of insulin release (U/106 cells, ±s, n=6)Treatment Glucose( mmol/L)11.101

14、.6716.70Control1126.61±80.7110.67±1.4594.12±7.65AG1159.29±114.7112.53±1.53102.85±9.18IL-1359.60±37.58?4.29±0.68?14.65±2.49?IL-1+AG919.46±48.2410.15±1.8199.54±8.49*P0.01,vs control; P0.01, vs IL-1 group三、AG對(duì)IL-1誘導(dǎo)的胰島細(xì)胞內(nèi)DNA、胰島素含量及細(xì)胞活性抑制作用的影響：

15、IL-1作用后，胰島細(xì)胞內(nèi)DNA、胰島素含量及細(xì)胞活性(MTT值)均顯著下降(P0.01) ；AG能阻斷IL-1對(duì)胰島細(xì)胞內(nèi)DNA、胰島素含量及細(xì)胞活性的抑制作用，如表2、1所示 。表2AG對(duì)IL-1誘導(dǎo)的胰島細(xì)胞亞硝酸鹽生成量以及對(duì)胞內(nèi)DNA和胰島素含量抑制作用的影響Tab 2 Effect of AG on IL-1-induced nitrite production and decrease of islet cell DNA insulin content (±s, n=6)TreatmentNitrite(nmol/106 cells)DNA(g/106 cells)In

16、sulin(U/ 106 cells)Control6.87±1.656. 03±0.811118.53±93.82AG7.06±1.796.33±0.681004.63±108.76IL-120.35±1.93?3.78±0.50?810.76±73.27?IL-1+AG8.29±1.565.87±0.501000.75±106.07*?P0.01,vs control; P0.01, vs IL-1 groupFig 1 Effect of AG on IL-1-ind

17、uced inhibition of islet cell activity (MTT redu ction)(n=6) ?P0.01, vs control; P0.01, vs IL-1 gr oup; MTT:thiazole blue1AG對(duì)IL-1誘導(dǎo)的胰島細(xì)胞活性抑制作用的影響討論目前，NO在自身免疫性疾病中的作用越來(lái)越引起重視。體內(nèi)的NO是L-精氨酸在一氧化氮合酶 (nitric oxide synthetase, NOS)催化下生成的。誘生型NOS(inducible NOS, iNOS)，必 需經(jīng)過(guò)細(xì)胞因子等刺激物誘導(dǎo)才能表達(dá)。其所生成的NO主要發(fā)揮細(xì)胞毒性作用。1990年以

18、來(lái) ，Southern等4，5先后報(bào)道，IL-1等細(xì)胞因子能誘導(dǎo)胰島細(xì)胞NO的生成，并 認(rèn)為與IL-1抑制胰島細(xì)胞線粒體酶活性、DNA合成及葡萄糖刺激的胰島素分必等生物學(xué)作 用有關(guān)。我們觀察到IL-能誘導(dǎo)大鼠胰島細(xì)胞NO生成，同時(shí)顯著抑制胰島素分泌及葡 萄糖 刺激的胰島素釋放；并降低胰島細(xì)胞內(nèi)DNA、胰島素含量，顯著抑制胰島細(xì)胞活性。這可能 與NO抑制線粒體內(nèi)含鐵硫中心的酶類(lèi)活性以及致DNA鏈斷裂有關(guān)1，6。有報(bào)道I L-1能夠誘導(dǎo)胰島細(xì)胞iNOS的表達(dá)7。這表明，NO可能是介導(dǎo)IL-1等細(xì)胞因子誘 導(dǎo)的胰島細(xì)胞損害的效應(yīng)分子。但其確切的機(jī)制仍未闡明。氨基胍是胍基衍生物，與L-精氨酸結(jié)構(gòu)相似。

19、有文獻(xiàn)報(bào)道，AG能有效地抑制胞內(nèi)外結(jié)構(gòu)蛋白 的非酶促糖基化，防止糖尿病血管病變和神經(jīng)病變8。AG能明顯延緩自發(fā)性糖尿 病BB大鼠糖尿病發(fā)病9。并發(fā)現(xiàn)AG能阻斷IL-1誘導(dǎo)的胰島細(xì)胞NO生成1 0。我們的實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步觀察到：AG不僅能明顯抑制IL-1誘導(dǎo)的NO生成，同時(shí)還能阻斷 IL-1對(duì)胰島素分泌及葡萄糖刺激的胰島素釋放的抑制作用；并呈現(xiàn)對(duì)IL-1誘導(dǎo)的胰島細(xì) 胞DNA、胰島素含量降低及細(xì)胞活性抑制的保護(hù)性效應(yīng)。這可能與AG競(jìng)爭(zhēng)性抑制iNOS，從而 阻抑NO生成有關(guān)。作者單位：陳宏蔡德鴻王梅劉宏葉仁青第一軍醫(yī)大學(xué)附屬珠江醫(yī)院內(nèi)分泌科呼吸科(廣州 510282)參考文獻(xiàn)1Corbett JA,Mc

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