骨髓基質(zhì)細(xì)胞聯(lián)合細(xì)胞因子對臍血CD133+細(xì)胞體外擴(kuò)增作用的研究

1、骨髓基質(zhì)細(xì)胞聯(lián)合細(xì)胞因子對臍血CD133+細(xì)胞體外擴(kuò)增作用的研究         08-03-05 09:08:00     編輯：studa20                   作者：毛平曾進(jìn)龍王彩霞杜慶華 【摘要】  為了探討胚胎骨髓基質(zhì)細(xì)胞（FBMSC）聯(lián)合細(xì)胞因子對臍血單個核細(xì)

2、胞（MNC）中CD133+細(xì)胞的體外擴(kuò)增作用，將新鮮臍血（CB）中分離出來的MNC接種于無血清培養(yǎng)體系中培養(yǎng)14天。實驗分為4組：C組為空白對照組，不含基質(zhì)細(xì)胞和細(xì)胞因子；S組為單用基質(zhì)細(xì)胞組；F組為單用細(xì)胞因子組；SF組為聯(lián)合使用基質(zhì)細(xì)胞和細(xì)胞因子組。在第0，6，10及14天檢測有核細(xì)胞總數(shù)、CD133+細(xì)胞數(shù)及集落形成單位（CFU）數(shù)。結(jié)果表明：各時間點SF組有核細(xì)胞總數(shù)的擴(kuò)增倍數(shù)均高于其它組；除了第14天外，SF組在第6、10天時CD133+細(xì)胞數(shù)、CFU數(shù)的擴(kuò)增倍數(shù)均高于其它組。結(jié)論： 胚胎骨髓基質(zhì)細(xì)胞對延緩造血細(xì)胞的分化具有重要的作用，基質(zhì)細(xì)胞聯(lián)合細(xì)胞因子可以有效的擴(kuò)增臍血單個核細(xì)胞

3、及其中的CD133+細(xì)胞，這是一種比較接近于臨床移植要求的造血細(xì)胞體外擴(kuò)增方法。 【關(guān)鍵詞】  骨髓基質(zhì)細(xì)胞； 造血干細(xì)胞； 細(xì)胞擴(kuò)增； CD133+細(xì)胞； 臍血； 細(xì)胞因子In Vitro Expansion of Cord Blood CD133+ Cells Supported by Bone Marrow Stromal Cells and Cytokines       Abstract    The aim of this study was to investigate the e

4、ffects of human fetal bone marrow stromal cells (FBMSC) in combination with exogenous cytokines on supporting  in vitro expansion of CD133+cells in cord blood mononuclear cells (MNC). MNCs separated from cord blood (CB) were cultured for up to 14 days in a serumfree system with FBMSC or exogeno

5、us cytokines or both of them. On day 0,6,10 and 14, total nucleated cells (TNC) were counted；CD133+ cells were quantified  by FACS, and hematopoietic progenitor cells were assessed by semisolid culture assay. The results showed that the number of TNC was remarkably increased in FBMSC and cytoki

6、ne group, the expansion of CD133+ cells and  CFU were increased in FBMSC  and cytokine group except that on day 14. It is concluded that FBMSC play an important role in delaying the differentiation of hematopoietic cells. FBMSC in combination with exogenous cytokines can promote the effect

7、ive expansion of CB MNC and CD133+ cells, this expanding system may meet the needs for clinical application of expanded CD133+cells.    Key words    bone marrow stromal cell; hematopoietic stem cell; cell expansion; CD133+ cell; cord blood; cytokine    CD

8、34是目前造血干細(xì)胞（HSC）最常用的表面抗原標(biāo)志。隨著對HSC研究的深入，人們發(fā)現(xiàn)存在CD34抗原尚未表達(dá)的造血干細(xì)胞1，又發(fā)現(xiàn)部分AC133可能是比CD34更早表達(dá)的表面抗原2，3，在第七屆人類白細(xì)胞分化抗原大會上AC133正式命名為CD133，CD133+細(xì)胞比CD34+細(xì)胞具有更高的增殖和自我更新能力4。我們利用本實驗室已經(jīng)建立的人胚胎骨髓基質(zhì)細(xì)胞聯(lián)合細(xì)胞因子的造血細(xì)胞體外培養(yǎng)體系5，以臍血MNC為起始細(xì)胞，研究臍血CD133+細(xì)胞的體外擴(kuò)增潛能。    材料和方法    主要試劑和儀器    羥

9、乙基淀粉液（HES）購自美國B.Braun公司。人淋巴細(xì)胞分離液（FicollHypaque，密度1.077）購自天津灝洋公司。25 ml一次性塑料培養(yǎng)瓶購自美國Becton Dickinson公司。DMEMLG培養(yǎng)液及胎牛血清（FBS）購自Gibco公司。青霉素和鏈霉素購自HyClone公司。無血清培養(yǎng)液使用Stem spanTM SFEM，造血祖細(xì)胞半固體培養(yǎng)基使用MethocultTMGF H4434，圴購自加拿大Stem Cell Technologies公司。干細(xì)胞因子（SCF）、酪氨酸激酶3類配基（FL）、血小板生成素（TPO）均購自英國PeproTech公司。CD133PE購自德

10、國Miltenyi Biotech公司。流式細(xì)胞儀為美國Becton Dickinson公司FACS Vantage產(chǎn)品。    中國實驗血液學(xué)雜志  J Exp Hematol 2007; 15(2)骨髓基質(zhì)細(xì)胞聯(lián)合細(xì)胞因子對臍血CD133+細(xì)胞體外擴(kuò)增作用的研究胚胎骨髓基質(zhì)細(xì)胞滋養(yǎng)層的建立    經(jīng)家屬知情同意后，取自然流產(chǎn)的胚胎（4-5月）3個。無菌條件下沖出骨髓液，經(jīng)Ficoll離心后獲得MNC，以1×106/cm2接種于5 ml的DMEMLG培養(yǎng)液中（含有20% FBS，  100 U/ml青霉

11、素，100  g/ml鏈霉素）。48小時后全量換液棄去懸浮細(xì)胞為原代細(xì)胞（F0），以后每隔5天進(jìn)行半量換液。貼壁細(xì)胞融合達(dá)到80%時以0.05%胰酶消化傳代后為F1，F(xiàn)3 至F5代的基質(zhì)細(xì)胞,經(jīng)15Gy 射線照射,用于共培養(yǎng)，使用之前用PBS洗滌3次。    臍血MNC的制備    足月妊娠的健康產(chǎn)婦臍血，經(jīng)病人及家屬知情同意后取自本院，共10份，ACDA抗凝。所采臍血在4小時內(nèi)按41體積比與HES混勻之后靜置30-45分鐘沉淀紅細(xì)胞，吸取上清經(jīng)Ficoll密度梯度離心分離出單個核細(xì)胞（MNC），用PBS洗滌3次后備用。&#

12、160;   臍血MNC的液體培養(yǎng)體系及實驗分組    采用Stem SpanTM無血清培養(yǎng)體系，SCF、FL、TPO的終濃度均為50 ng/ml。實驗分為4組：C組：空白對照組，僅有培養(yǎng)基+MNC；S組：基質(zhì)細(xì)胞+MNC；F組SCF+FL+TPO+MNC; SF組：基質(zhì)細(xì)胞+SCF+FL+TPO+MNC。臍血MNC的接種密度為1×106/ml，置37、5% CO2、飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。分別在第6、10、14天進(jìn)行半量換液，檢測細(xì)胞總數(shù)和CFU數(shù)，用流式細(xì)胞術(shù)檢測CD133表達(dá)的情況。所得數(shù)值與第0天數(shù)值為1.00的相應(yīng)數(shù)值作比較。

13、    造血祖細(xì)胞集落培養(yǎng)    將細(xì)胞按2×105/ml接種到24孔板MethocultTMGF H4434半固體培養(yǎng)液中，內(nèi)含1%甲基纖維素、30% FBS、 1% BSA、 10-4mol/L 2ME、 50 ng/ml rhSCF、 50 ng/ml GMCSF、 10 ng/ml rhIL3、  3 U/ml rhEPO。造血祖細(xì)胞集落培養(yǎng)第14天時在倒置顯微鏡下計算CFU集落數(shù)。    細(xì)胞表面標(biāo)志的流式細(xì)胞術(shù)檢測    流式細(xì)胞試劑有CD13

14、3PE單克隆抗體.。流式細(xì)胞儀檢測每個樣品收1×104個細(xì)胞。使用CellQuest軟件系統(tǒng)進(jìn)行分析。    統(tǒng)計處理    用SPSS統(tǒng)計軟件進(jìn)行分析，結(jié)果以±SD表示，差異顯著性采用方差分析。    結(jié)    果    胚胎骨髓基質(zhì)細(xì)胞滋養(yǎng)層的建立    胚胎骨髓細(xì)胞經(jīng)全量換液后，貼壁細(xì)胞經(jīng)7-9天培養(yǎng)后即達(dá)到80%融合，主要為長梭形的成纖維細(xì)胞，原代細(xì)胞尚可見少量圓形貼壁細(xì)胞及黏附于貼壁細(xì)胞

15、表面的造血細(xì)胞。經(jīng)2次傳代以后成纖維細(xì)胞得以純化，呈平行或旋渦狀生長。經(jīng)射線照射后，基質(zhì)細(xì)胞能在Stem spanTM SFEM無血清培養(yǎng)液中繼續(xù)培養(yǎng)18-20天而不發(fā)生脫落，臺盼藍(lán)染色顯示活力>95%。    臍血、MNC、CD133+細(xì)胞數(shù)    所采集臍血的容量平均為65.7 ml (52-92 ml),收集的MNC數(shù)為（1.2±1.3）×108個，新鮮臍血MNC中CD133+細(xì)胞的所占比例為（0.92±0.31）%。    培養(yǎng)過程中有核細(xì)胞總數(shù)的變化 

16、;   C組、F組在培養(yǎng)過程中有核細(xì)胞總數(shù)一直呈下降趨勢，尤其C組下降迅速，第6天的有核細(xì)胞總數(shù)為第0天的0.55±0.20，至第14天僅剩0.14±0.07。F組有核細(xì)胞數(shù)的下降速度較平緩，分別為0.92±0.30、0.88±0.29和0.66±0.36，但組內(nèi)不同時間點比較均無差異（P>0.05）。S組在第6天有所下降，為第0天值的0.87±0.32，之后則一直增加，但增幅小，雖然第6天和第14天差異明顯（P<0.01）,但在相鄰時間點即第6天與第10天，第10天與第14天比較時均P>0.05

17、。SF組在第6天、第10天細(xì)胞總數(shù)明顯擴(kuò)增，第10天達(dá)到組內(nèi)最高值，為第0天值的2.29±0.73，第14天略有下降，為第0天值的2.19±0.66，但跟第6天比較并不明顯（P>0.05）。    在相同的時間點里，SF組有核細(xì)胞總數(shù)的擴(kuò)增倍數(shù)均比其它組要高（P<0.05）（附表）。    CD133+細(xì)胞數(shù)變化    C組、F組CD133+細(xì)胞數(shù)雖然在第6天都有所增加，但之后即第10天和第14天均已低于初始水平，C組在第14天CD133+細(xì)胞基本已經(jīng)消耗殆盡。S組和SF組在第6天，第10天都保持著增長的趨勢，S組在第6天、第10天分別為第0天值的（4.06±1.44）倍和（4.51±1.8