HBVS基因與IL-12基因聯(lián)合免疫小鼠的免疫應(yīng)答.

1、HBVS基因與IL-12基因聯(lián)合免疫小鼠的免疫應(yīng)答HBV S 基因與 IL-12 基因聯(lián)合免疫小鼠的免疫應(yīng)答第四軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報(bào) 2000 年第 21 卷第 4 期王全楚周永興姚志強(qiáng)馮志華摘 要：目的 觀察小鼠對(duì) IL-12 基因表達(dá)質(zhì)粒與 HBV s 基因疫苗聯(lián)合免疫 的免疫應(yīng)答方法 用已構(gòu)建的 HBV s 基因疫苗（pCR3.1-S）和表達(dá) IL-12 p35 和 p40 蛋白的真核表達(dá)載體 pW rG3169 分別給 BALB/c 小鼠多點(diǎn)肌肉注射， 2 wk 后追加免疫 1次，用 ELISA 法及 MTT 法檢測(cè)小鼠 血清抗-HBs 及脾細(xì)胞對(duì) HBsAg 的特異性增殖反應(yīng).結(jié)果 免疫接種

2、 2 wk 后小鼠 血清抗-HBs 滴度 及脾 細(xì)胞對(duì) HBsAg 的刺激指數(shù)均明顯高于對(duì)照組，pWRG3169+pCR3.1 組明顯高于 單純 pCR3.1-S 注射組.結(jié)論 IL-12表達(dá)質(zhì)?？梢栽鰪?qiáng) pCR3.1-S 基因疫苗誘導(dǎo) 的體液和細(xì)胞免疫應(yīng)答強(qiáng)度；尤以細(xì)胞免疫增高明顯關(guān)鍵詞：肝炎病毒，乙型；基因免疫；IL-120 引言基因免疫是近幾年發(fā)展起來(lái)的新的生物技術(shù)，不僅可誘導(dǎo)體液免疫應(yīng)答，而且可誘導(dǎo)強(qiáng)烈而 持久的細(xì)胞免疫應(yīng)答：1：.細(xì)胞因子可通過(guò)不同作用環(huán)節(jié)調(diào)節(jié) 和增強(qiáng) DNA的免疫效應(yīng)，發(fā)揮免 疫佐劑作用.IL-12 在機(jī)體免疫功能中具有重 要作用，尤其 是對(duì)Th1/Th2 平衡的影

3、響備受關(guān)注 .為探求 HBVS因免疫的 增強(qiáng)策略，我們對(duì) IL-12 基因表達(dá)質(zhì)粒與 HBV S 基因聯(lián)合免疫的小鼠細(xì)胞和體 液免疫應(yīng)答進(jìn)行了研究 .1 材料和方法1.1 材料 編碼 IL-12 p35 和 p40 蛋白的真核表達(dá)載體 pWR G316 抽美國(guó) Rakhmilevich 博士惠贈(zèng):3.含 HBV S 基因的質(zhì)粒 pCR3.1-S 由姚志強(qiáng)教授在 比 利時(shí)魯汶大學(xué)構(gòu)建：以計(jì)算機(jī)設(shè)計(jì) PCR 引物，從 HBV 患者血清（adw 型）中獲 得 HBV s基因序列，以 T-A 克隆法插入真核表達(dá)載體 pCR3.1 （Invitrogen 公 司產(chǎn)品），酶切、電泳，鑒定正向插入片段，最后

4、得到重組質(zhì)粒PCR3.1-S.質(zhì)粒的大量制備以?xún)煞N質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌 JM1 09（本室保存），篩選 陽(yáng)性克隆，經(jīng) LB 培養(yǎng)基擴(kuò)增，按堿裂解法提取質(zhì)粒，聚乙二醇（PEG 法純 化，通過(guò)紫外分光光度計(jì)測(cè)定其濃度，按 1 g*L-1溶于無(wú)菌生理鹽水中，-20E儲(chǔ)存?zhèn)溆?.1.2 方法 選用 68 wk 齡雌性 BALB/c 小鼠（本校實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供），隨機(jī)分為 3 組，S 基因?qū)φ战M（每次注射 pCR3.1-S 100 卩 g）、增強(qiáng)組（每次注射 pCR3.1-S 和 pWRG316 各 100 卩 g） 、 對(duì)照組 （每次注射空載體 PCR3.1100 卩 g），每組小鼠 5 只.注

5、射前以 2.5 g*L-1鹽酸布比卡因 100 卩 g 預(yù)處理小鼠股四頭肌， 24 h 后將相應(yīng)質(zhì) 粒直接多點(diǎn)注射處理后肌肉，間隔 2 wk 后追加免疫 1 次.不同時(shí)間間隔剪尾取血.免疫 4 wk 后， 處死小鼠， 取小鼠 脾細(xì)胞， 洗滌后用含 100 mL*L-1胎牛血清的 RPMI 1 640 培養(yǎng)液重懸， 制成細(xì)胞 懸液濃度為 1X109*L-1， 加入 96 孔板，每孔100卩g,平行3孔， 前2孔分別 加入HBsAg 5卩g/孔和1 : 300植物血凝素 （PHA，第 3 孔只加 buffer，作對(duì)-1照.37 C ,50 mL*L CO2 溫育 72 h，加入四甲基偶氮唑鹽（MT

6、 t） 10 卩 g， 37C繼續(xù)孵 育 4 h，棄去孔內(nèi)培養(yǎng)液，每孔加入 DMSO150L,振蕩 10 min， 使結(jié)晶物充分溶解，在酶免疫檢測(cè)儀上測(cè)各孔 A490 nm 計(jì)算刺激指數(shù)（SI）， SI=實(shí)驗(yàn)孔 A490 nm/對(duì)照孔 A490 nm.抗-HBs 抗體檢測(cè)：在 HBsAg 包被好的 96 孔 ELISA 軟板（華美生物技術(shù)公司）中加入生理鹽水稀釋過(guò)的小鼠血清（1 : 50），37C孵育 1 h，洗滌后加入 HRP 標(biāo)記羊抗鼠 IgG，洗滌，加 TMB 為 底物，于波長(zhǎng) 450 nm 處測(cè) ELlSA A490 nm. （ELISA 儀系 Bio-Rad 公司產(chǎn) 品），以檢測(cè) A

7、490 nm/陰性對(duì)照 A490 nm =2.1 為陽(yáng)性.2 結(jié)果以 Xbal 酶切重組質(zhì)粒 pCR3.1-S,獲得 630 bp 片段，結(jié)果符合酶切圖譜2.1T 細(xì)胞抗原特異性增殖反應(yīng)增強(qiáng)組除對(duì) HBsAg 表現(xiàn)出特異性增殖反應(yīng)外，IL-12 也對(duì) PHA 有非特異性增殖反應(yīng)（Tab1）.表 1 小鼠脾細(xì)胞對(duì) HBsAg 增殖反應(yīng)的刺激指數(shù)tab 1Stimulatory in dex of sple no cytes on HBsAgSIGroupHBsAgPHApCR3.1-S+pWRG31691.9 0.6ac1.5 0.2ac(n=5,X s)1.4 0.3a1.2 0.1cpCR3

8、.1-SpCR3.10.9 0.11.0 0.1aPv0.05 vs pCR3.1,cPv0.05 vs pCR3.1-S group. 22小鼠血清抗-HBs-IgG 2 wk 后實(shí) 驗(yàn)組和增 強(qiáng)組均產(chǎn)生了抗-HBs 特異性抗體.免疫 4 wk 后增強(qiáng) 組抗-HBs效價(jià)高于實(shí)驗(yàn)組(Pv0.05,Fig 1).圖 1 重組質(zhì)粒免疫小鼠血清的抗 HBs 效價(jià)fig 1Serum antiHBs titers of mice immunized with pCR3.1-S, pWRG3169 plus pCR3.1-S or pCR3.13 討論IL-12 是目前認(rèn)為的作用免疫細(xì)胞范圍最廣、作用最

9、強(qiáng)的細(xì)胞素.它對(duì)免疫應(yīng)答的調(diào)節(jié)是通過(guò)促進(jìn) Th1 細(xì)胞的形成及分泌細(xì)胞因子而刺激 T 細(xì)胞的分化 增殖，促進(jìn) CTL,LAK 細(xì)胞等的形成，從而增強(qiáng)機(jī)體對(duì)病原體的殺傷及清除作用.我們的實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，編碼 IL-12 的表達(dá)質(zhì)粒 可以提高 pCR3.1-S 誘導(dǎo)的體液 和細(xì)胞免疫強(qiáng)度，尤以后者為甚.這與 Chow 等”報(bào) 告的結(jié)果 一致，但與 Kim 研究結(jié)論相反產(chǎn)生這種差異的原因還不清楚，可能與重組表達(dá)載體在體內(nèi)轉(zhuǎn)染細(xì)胞類(lèi)型不同及 IL-12 在體內(nèi)的表達(dá)量和生物活性不同有關(guān).chow將 5 種 含細(xì)胞因子編碼基因的重組表達(dá)載體 （pIL-12 pIL-4,pIL-2,pIFN-r,pGM-

10、CSF 分別與含 HBsAg編碼基因的 重組表達(dá)載體一起肌注小鼠，發(fā)現(xiàn) 5 種細(xì)胞 因子的重組表達(dá)載體均使抗-HBs 的 IgG 抗體產(chǎn)生增加（pIFN-R 除外）.Kim 等：句將 IL-12 基因生編碼人類(lèi)免疫缺陷病毒 1 抗原的基因一同免疫 動(dòng)物，發(fā)現(xiàn) 特異性抗體應(yīng)答降低，而 T 細(xì)胞增殖反應(yīng)和抗原特異性細(xì)胞毒活性明顯增強(qiáng).這種特異性的細(xì)胞免疫應(yīng)答不僅對(duì)預(yù)防乙型肝炎病毒感染具有保護(hù)作用，而且 對(duì)慢性病毒感染具有治療和清除作用 MacGregor 等率先將基因疫苗用于 艾 滋病的臨床治療，15 例無(wú)癥狀 AIDS 患者均產(chǎn)生特異性體液免疫，部分表現(xiàn)出 較強(qiáng)的 CTL 反應(yīng)和淋巴細(xì)胞增殖活性

11、.如何充 分利用 IL-12 的細(xì)胞免疫增強(qiáng)作 用，將基因免疫過(guò)渡到慢性乙型肝炎患者的臨床治療，將是今后努力的一個(gè)方 向基金項(xiàng)目：國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（39770065）作者簡(jiǎn)介:王全楚（1966-）,男（漢族）,湖北省云夢(mèng)縣人.主治醫(yī)師,碩士,已發(fā)表論文 30 篇.現(xiàn)工作單位：河南鄭州 153 醫(yī)院傳染科.tel.（ 029）3577595 王 全楚（第四軍醫(yī)大學(xué)唐都醫(yī)院傳染科，陜西西安 710038）周永興（第四軍醫(yī)大學(xué)唐都醫(yī)院傳染科，陜西西安 710038）姚志強(qiáng)（第四軍醫(yī)大學(xué)唐都醫(yī)院傳染科，陜西 西安 710038）馮志華（第四軍醫(yī)大學(xué)唐都醫(yī)院傳染科 ,陜西 西安 710038）參

12、考文獻(xiàn) :1schirmbeck R,Bohm W,Ando K et al. Nucleic acid vaccinati on primeshepatit is B virus surface antigen specific cytotoxic. T Lymphocytes in nonrespondermic e J. j Virol, 1995;69(10):5929- 5934.2Gately MK, Renzetti LM, Magram J et al. The interleukin-12/interleukin-12 receptor system: Role in nor

13、mal and pathologic immuneresponsesJ. annu R ev lmmunol, 1998;16:495-517.3Rakhmilevich AL, Turner J, Ford MJ et al. Gene gun-mediate d skintransfec tion with interleukin12 gene results in regression of established primary andme tastic murine tumorsJ . Proc Natl SciuSA,1996;93(13):6291-6296.4Chow YH,

14、Chiang BL, Lee YL et al. Development of Th1 and Th 2populations a nd the nature of immune response to hepatitis B virus DNA vaccine canbe modula ted by codelivery of various cytokine genes J . Jlmmunol,1998;160(3):132 0-1329.5Kim JJ, Ayyavoo V, Bagarazzi ML et al. In vivo engineering of a cellularimmune response by coadministration of IL-12 expression vector with a dNA immunogen J. J Immuno