在無(wú)血清培養(yǎng)基中代謝副產(chǎn)物對(duì)雜交瘤細(xì)胞生長(zhǎng)代謝的影響I_乳酸

1、Vol.28No.22002-04華東理工大學(xué)學(xué)報(bào)JournalofEastChinaUniversityofScienceandTechnology157文章編號(hào):1006-3080(2002)02-0157-04在無(wú)血清培養(yǎng)基中代謝副產(chǎn)物對(duì)雜交瘤細(xì)胞生長(zhǎng)代謝的影響I.乳酸的作用張立,金亦輝,張?jiān)d(華東理工大學(xué)生物反應(yīng)器工程國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,上海200237)摘要:研究了無(wú)血清批培養(yǎng)中乳酸對(duì)雜交瘤細(xì)胞生長(zhǎng)代謝的影響。當(dāng)乳酸濃度低于5.3mmol/L時(shí),乳酸對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)和代謝無(wú)明顯影響;當(dāng)乳酸濃度在10mmol/L25mmol/L時(shí),對(duì)雜交瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)代謝有弱抑制;當(dāng)乳酸濃度高于34mmol/L

2、時(shí),對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)代謝有較明顯的抑制。關(guān)鍵詞:雜交瘤細(xì)胞;細(xì)胞培養(yǎng);乳酸;無(wú)血清培養(yǎng)中圖分類號(hào):Q953.31文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼:A*InfluenceofMetabolicByproductsonGrowthandMetabolismofHybridomaCellsinSerum-freeCulturesI.EffectofLactate*ZHANGLi,JINYi-hui,ZHANGYuan-xing(StateKeyLaboratoryofBioreactorEngineeringECUST,Shanghai200237,China)Abstract:InthebatchculturesofWuT3

3、hybridomacellsinserum-freemediumwithdifferentlactateconcentrations,theinfluencesoflactateoncellsgrowthandmetabolismwereinvestigated.Itwasfoundthatlactatebelow5.3mmol/Linfluencedhardlyoncells,lactatebetween10mmol/Land25mmol/Linhib-itedalittleoncellsgrowthandmetabolism,andlactateabove34mmol/Linhibited

4、stronglyoncellcultures.Keywords:lactate;hybridomacell;cellculture;serum-freeculture乳酸是雜交瘤細(xì)胞培養(yǎng)中產(chǎn)生的主要代謝副產(chǎn)物,對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)和代謝有抑制作用12。乳酸主要是葡萄糖經(jīng)糖酵解途徑產(chǎn)生的,另外大約15%的谷氨酰胺可經(jīng) -酮戊二酸、蘋(píng)果酸和丙酮酸生成乳酸。目前,生產(chǎn)高質(zhì)量體內(nèi)治療用單克隆抗體常采用無(wú)血清培養(yǎng)。在掌握細(xì)胞營(yíng)養(yǎng)需求和代謝規(guī)律的基礎(chǔ)上,雜交瘤細(xì)胞的高密度培養(yǎng)通常采用流加或灌注的培養(yǎng)方法來(lái)提高單抗?jié)舛?4。在高密度培養(yǎng)中,控制乳酸的生成是至關(guān)重要的因素,研究在無(wú)血清培養(yǎng)基中乳酸對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)代謝的影響是

5、非常必要基金項(xiàng)目:國(guó)家九五重點(diǎn)科技攻關(guān)項(xiàng)目(95020305)E-mail:yxzhang收稿日期:2001-04-20,:的。本文通過(guò)雜交瘤細(xì)胞在不同乳酸濃度下的無(wú)血清培養(yǎng),研究了不同乳酸濃度對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)代謝的影響。1材料與方法1.1細(xì)胞株和培養(yǎng)基WuT3雜交瘤細(xì)胞由骨髓瘤細(xì)胞NS1和經(jīng)免疫的Balb/c小鼠的脾細(xì)胞融合而成,分泌抗人T淋巴細(xì)胞CD3抗原的IgG2a單克隆抗體。該細(xì)胞由衛(wèi)生部武漢生物制品研究所建株并提供。無(wú)血清培養(yǎng)基(Serum-freemedium,SFM)是在RPMI1640)158華東理工大學(xué)學(xué)報(bào)5第28卷機(jī)鹽和其他成分。1.2培養(yǎng)方法在150mL方瓶中,分別加入含不同濃

6、度L-乳酸(濃縮液,用NaOH預(yù)調(diào)pH至中性)的培養(yǎng)基10mL,細(xì)胞接種密度為2.5×105cells/mL,放到5%CO2培養(yǎng)箱中,在36.8下培養(yǎng)。每隔12h取樣,計(jì)數(shù)細(xì)胞,離心培養(yǎng)上清液(4000r/min,5min),-20保存,用于樣品分析。1.3分析方法細(xì)胞密度:血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù),用臺(tái)盼藍(lán)染色法區(qū)分活細(xì)胞。葡萄糖濃度:用葡萄糖氧化酶(POD-GOD)法測(cè)定。乳酸濃度:用乳酸脫氫酶法(LDH)測(cè)定。氨濃度:用尿素氮試劑盒測(cè)定。單抗?jié)舛?用免疫單擴(kuò)散法測(cè)定。6圖1乳酸濃度對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)的影響Fig.1Influenceoflactateoncellgrowthinserum-fre

7、eculturesonWuT3cellsCLactate/(mmolL-1):0;5.3;10.5;24.8;33.6;46.2;57.32結(jié)果與討論2.1乳酸對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)的影響從圖1的細(xì)胞生長(zhǎng)曲線可以看出,在初始培養(yǎng)基中添加5.3mmol/L乳酸對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)影響不大,最大活細(xì)胞密度與對(duì)照相當(dāng),都達(dá)到了7.5×10cells/mL,只是得到最大活細(xì)胞密度的時(shí)間后移。當(dāng)初始培養(yǎng)基的乳酸濃度達(dá)到10.5mmol/L時(shí),最大活細(xì)胞密度降低到6.0×105cells/mL。當(dāng)初始培養(yǎng)基的乳酸濃度為24.8mmol/L時(shí),細(xì)胞生長(zhǎng)明顯放緩,在對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞的倍增時(shí)間(約50h)幾乎是對(duì)照

8、(約24h)的兩倍,其最大活細(xì)胞密度只有5.2×105cells/mL,同時(shí)該組細(xì)胞的衰亡速度也減慢,在120h時(shí)仍然有較多的活細(xì)胞,這可能是因?yàn)樵撊樗釢舛葘?duì)細(xì)胞生長(zhǎng)沒(méi)有很強(qiáng)的抑制,僅減慢了細(xì)胞的生長(zhǎng)速率,使培養(yǎng)液中其他抑制性因子積累速率減慢,導(dǎo)致了細(xì)胞衰亡速率減慢。在初始培養(yǎng)基的乳酸濃度超過(guò)30mmol/L時(shí),乳酸對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)產(chǎn)生了明顯的抑制。在33.6mmol/L乳酸的初始培養(yǎng)基中,細(xì)胞的死亡和生長(zhǎng)速率接近,沒(méi)有出現(xiàn)對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期,在進(jìn)入衰亡期之前,一直維持在2.0×105cells/mL左右。在46.2mmol/L和57.3mmol/L乳酸的初始培養(yǎng)基中,細(xì)胞很少生長(zhǎng),直接

9、進(jìn)入衰亡期。由圖2可見(jiàn)細(xì)胞存活率與細(xì)胞生長(zhǎng)有很好的對(duì)應(yīng)。乳酸濃度在24.8mmol/L以下,細(xì)胞存活率在培養(yǎng)過(guò)程中緩慢降低。當(dāng)乳酸濃度高于30mmol/L時(shí),細(xì)胞存活率在培養(yǎng)過(guò)程中快速下降。33.65圖2乳酸濃度對(duì)細(xì)胞存活率的影響Fig.2Influenceoflactateoncellviabilityinserum-freeculturesofWuT3cellsCLactate/(mmolL-1):0;5.3;10.5;24.8;33.6;46.2;57.3圖3乳酸濃度對(duì)細(xì)胞比生長(zhǎng)速率的影響Fig.3Influenceoflactateonthespecificcellgrowthrate

10、sinserum-freeculturesofWuT3cellsCLactate/(mmolL-1):0;10.5;24.8;響。乳酸濃度為0時(shí)(對(duì)照實(shí)驗(yàn)),細(xì)胞表觀比生長(zhǎng)速率在接種后就維持在較高的值(0.03h-1),隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)而減小,在穩(wěn)定期(60h)變?yōu)樨?fù)值,在衰第2期張立等:在無(wú)血清培養(yǎng)基中代謝副產(chǎn)物對(duì)雜交瘤細(xì)胞生長(zhǎng)代謝的影響I.159小。乳酸濃度為10.5mmol/L,細(xì)胞表觀比生長(zhǎng)速率變化的趨勢(shì)與對(duì)照接近,但數(shù)值較小。乳酸濃度為24.8mmol/L,細(xì)胞生長(zhǎng)受到了抑制,最大比生長(zhǎng)速率只有0.01h-1,并且在整個(gè)培養(yǎng)周期中,比生長(zhǎng)速率的變化較緩慢,在很長(zhǎng)的衰亡期中,細(xì)胞的表

11、觀比生長(zhǎng)速率在0上下,這說(shuō)明細(xì)胞受到的抑制較弱。乳酸濃度為33.6mmol/L,細(xì)胞的表觀比生長(zhǎng)速率在培養(yǎng)初期就維持在0上下,說(shuō)明細(xì)胞生長(zhǎng)受到的抑制明顯。2.2乳酸對(duì)細(xì)胞代謝的影響乳酸對(duì)細(xì)胞代謝有一定的影響。在培養(yǎng)基中不添加乳酸時(shí)(對(duì)照實(shí)驗(yàn)),隨著細(xì)胞生長(zhǎng),葡萄糖不斷被消耗,細(xì)胞進(jìn)入死亡期后,葡萄糖的消耗速率降低,在整個(gè)培養(yǎng)過(guò)程中,消耗葡萄糖1.5g/L(圖4)。當(dāng)初始培養(yǎng)基中乳酸濃度小于24.8mmol/L時(shí),細(xì)胞消耗葡萄糖的規(guī)律與對(duì)照基本相同,只是消耗葡萄糖的量有所減少,這與細(xì)胞生長(zhǎng)相吻合。當(dāng)初始培養(yǎng)基中乳酸濃度高于30mmol/L時(shí),葡萄糖的消耗很少,當(dāng)乳酸濃度達(dá)到57.3mmol/L時(shí)

12、,細(xì)胞幾乎不消耗葡萄糖。隨著乳酸添加量的提高,生成的氨總量減少,但由于細(xì)胞密度的大幅度下降,氨的比生成速率有較大的提高。圖5乳酸濃度對(duì)乳酸積累的影響Fig.5Influenceoflactateonlactateaccumu-lationinserum-freeculturesofWuT3cellsCLactate/(mmolL-1):0;5.3;10.5;24.8;33.6;46.2;57.3圖6乳酸濃度對(duì)乳酸葡萄糖轉(zhuǎn)化率的影響Fig.6Influenceoflactateontheratioof圖4乳酸濃度對(duì)葡萄糖消耗的影響Fig.4Influenceoflactateonglucosec

13、onsumptioninserum-freeculturesofWuT3cellsCLactate/(mmolL-1):0;33.6;46.25.lactateaccumulationtoglucoseconsumptioninserum-freecul-turesofWuT3cells3;10.5;24.8;在整個(gè)培養(yǎng)過(guò)程中,乳酸不斷積累。隨著初始培養(yǎng)基中乳酸濃度的提高,乳酸的累積值減少(圖5),生成的乳酸與消耗的葡萄糖的比值減少(圖6)。這可能是糖酵解過(guò)程中產(chǎn)生的丙酮酸與乳酸之間的反應(yīng)是在乳酸脫氫酶催化下的可逆反應(yīng),培養(yǎng)液中的高乳酸濃度影響了這個(gè)反應(yīng)的速率,減少了乳酸的生成。乳酸對(duì)細(xì)胞培養(yǎng)

14、中氨積累的影響見(jiàn)圖7。在培養(yǎng)過(guò)程中,雖然氨連續(xù)積累,且最終氨濃度隨著乳酸濃度的升高而降低,但是氨的比生長(zhǎng)速率卻隨著乳酸濃度的提高而增加。這可能是因?yàn)殡S著乳酸濃度的升高,細(xì)胞的生長(zhǎng)和葡萄糖代謝受到抑制,細(xì)胞生圖7第84小時(shí)氨的總生成量和平均比生成速率Fig.7Outputandspecificproductionratesofammoniaat84hinserum-freeculturesofWuT3cellsatdifferentlactatecon-centrations160華東理工大學(xué)學(xué)報(bào)第28卷2.3乳酸對(duì)單抗生成的影響隨著乳酸添加量的提高,最終單抗?jié)舛认陆?表1)。這是高乳酸濃度抑制

15、了細(xì)胞生長(zhǎng),使細(xì)胞密度降低所致。從單抗的比生成速率看,隨著乳酸濃度的升高,單抗的比生成速率有所提高,這是因?yàn)槌跏寂囵B(yǎng)基中乳酸濃度提高導(dǎo)致了培養(yǎng)液滲透壓增加,從而使單抗的比生成速率有所提高。表1不同乳酸濃度下單抗的最終濃度和比生成速率Table1ThefinalconcentrationsandspecificproductionratesofMAbatdifferentlactateconcentrationsAdditionallactateconcentration/(mmolL05.310.624.833.646.257.3-1參考文獻(xiàn):1MillerWM,WilkeCR,BlanchH

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