細胞分裂素代謝信號轉(zhuǎn)導交叉反應與農(nóng)藝性狀改良

1、植物學通報2006, 23 (5: 478498基金項目:教育部新世紀優(yōu)秀人才支持計劃(楊淑華、國家自然科學基金委優(yōu)秀創(chuàng)新團隊(No. 30221002; 左建儒和杰出青年科學基金(No. 30125025; 左建儒These authors contributed equally to this paper.* Author for correspondence. E-mail: for Shuhua Yang: yangshuhua; for Jianru Zuo: jrzuo細胞分裂素:代謝、信號轉(zhuǎn)導、交叉反應與農(nóng)藝性狀改良鄧巖1,王興春1,楊淑華2*,左建儒1*1中國科學院遺傳與發(fā)育生

2、物學研究所, 植物基因組學國家重點實驗室, 北京 1001012中國農(nóng)業(yè)大學生物學院, 植物生理學與生物化學國家重點實驗室, 北京 100094摘要 在高等植物中, 細胞分裂素通過對細胞分裂與分化的調(diào)節(jié)而廣泛參與了對植物生長發(fā)育的調(diào)控。在過去的10余年, 利用模式植物擬南芥的研究, 在闡明細胞分裂素的代謝、轉(zhuǎn)運與信號轉(zhuǎn)導等方面取得了重要的進展。同時, 關于細胞分裂素與其它信號途徑之間存在的廣泛交叉反應也受到了人們的注意。根據(jù)我們現(xiàn)有的知識, 細胞分裂素信號轉(zhuǎn)導是通過磷酸基團在一個雙元組分系統(tǒng)之間的系列傳遞而完成的, 該過程被稱之為“磷酸接力傳遞”(phosphorelay。細胞分裂素與其它信號

3、途徑的互作可能也主要是通過雙元組分系統(tǒng)鏈接的。雙元組分系統(tǒng)中目前已知的主要信號元件不僅表現(xiàn)出功能冗余性, 同時在調(diào)控特定的植物生長發(fā)育過程時也具有特異性。本文在對細胞分裂素的代謝與轉(zhuǎn)運過程簡要評述的基礎上,對其信號轉(zhuǎn)導以及與其它信號途徑間交叉反應的研究進展進行重點討論, 并展望細胞分裂素研究對重要農(nóng)業(yè)性狀改良的意義。關鍵詞 細胞分裂素, 信號轉(zhuǎn)導, 雙元組分系統(tǒng), 交叉反應New Insights into Cytokinins: Metabolism, Signal Transduction,Cross Talks and Potentials in Agricultural Applica

4、tionsYan Deng 1, Xingchun Wang 1, Shuhua Yang 2*, Jianru Zuo 1*1State Key Laboratory of Plant Genomics , Institute of Genetics and Developmental Biology , ChineseAcademy of Sciences , Beijing 100101, China2State Key Laboratory of Plant Physiology and Biochemistry , China Agriculture University , Bei

5、jing100094, ChinaAbstract The plant phytohormone cytokinin regulates numerous growth and developmental processes by regulating cell division and cell differentiation. During the past ten years, remarkable progress has been made to our understanding on the cytokinin metabolism, transport and signalin

6、g, mainly using Arabidopsis thaliana as a model system. In addition, substantial attentions have also been paid to cross-talks between cytokinin and other signaling pathways. According to our current understanding, cytokinin signaling is mediated by sequen-tially transferring a phosphoryl group in d

7、ifferent members of a two-component system, referred to as phosphorelay. The two-component system may also act as a module linking cytokinin and other signaling pathways. Most known members of the two-component system are functionally redundant, but also show綜述 . 細胞分裂素479 2006鄧巖等: 細胞分裂素:代謝、信號轉(zhuǎn)導、交叉反應

8、與農(nóng)藝性狀改良1955年, Miller等人在鯡魚精子DNA熱壓水解產(chǎn)物中發(fā)現(xiàn)了一種可以促進植物細胞分裂與分化的物質(zhì), 將其命名為激動素(kinetin (Miller et al., 1955。隨后, 一些有著相同生理活性的物質(zhì)也陸續(xù)被發(fā)現(xiàn), 它們被統(tǒng)稱為細胞分裂素(cytokinins。早在發(fā)現(xiàn)之初, 人們便認識到細胞分裂素可以與生長素一起調(diào)節(jié)植物愈傷組織的分化, 并被廣泛地應用到了植物組織培養(yǎng)技術中。隨后, 細胞分裂素在調(diào)控頂端優(yōu)勢、主根伸長、維管束的形成、開花時間以及葉綠體發(fā)育中的功能也逐漸被人們發(fā)現(xiàn) (Mok, 1994; Mok and Mok, 2001。長期以來, 雖然人們在遺

9、傳學、生物化學以及生理學等方面進行了大量工作, 但對細胞分裂素的代謝、轉(zhuǎn)運及信號轉(zhuǎn)導等認識仍然有限, 主要原因是細胞分裂素與其它信號途徑間存在著廣泛、復雜的交叉反應, 細胞分裂素相關基因間的功能冗余以及缺乏特異性的生物學分析系統(tǒng)。直到1996年Kakimoto創(chuàng)造性地將“不定芽分析技術”(shoot regeneration assay 應用于對細胞分裂素相關突變體的遺傳篩選和分析中, 狀況才有所改善(Kakimoto, 1996。在近10年的時間里, 人們在細胞分裂素的代謝、轉(zhuǎn)運、信號轉(zhuǎn)導以及與其它信號途徑間交叉反應的研究中都取得了重大的進展。本文將就上述研究進展做一簡要的評述。1細胞分裂素

10、的代謝和轉(zhuǎn)運細胞分裂素是一類具有腺嘌呤環(huán)結構的植物激素。在腺嘌呤環(huán)的第6位氮原子(N6上共價連接的不同取代基團產(chǎn)生了不同類型的細胞分裂素。根據(jù)N6基團上取代基團的不同, 細胞分裂素可分為類異戊二烯形式細胞分裂素和芳香環(huán)形式細胞分裂素等。1.1 細胞分裂素的生物合成在植物體內(nèi), 細胞分裂素主要以類異戊二烯的形式存在。目前已知的細胞分裂素生物合成途徑有兩個, 即從頭合成途徑和tRNA分解途徑?，F(xiàn)有的證據(jù)表明, tRNA途徑只是植物體內(nèi)細胞分裂素合成的次要途徑, 而絕大部分內(nèi)源細胞分裂素是由從頭合成途徑合成的(Haberer and Kieber, 2002(圖1。人們對從頭合成途徑的最初了解來自于

11、從黏菌(Dictyostelium discoideum中鑒定出的一種酶,該酶可催化腺苷酸(AMP和二甲基丙烯基二磷酸(dimethylallyl diphosphate, DMAPP轉(zhuǎn)化成有活性的細胞分裂素異戊烯基腺苷-5'-磷酸(isopentenyladenosine-5'-monophosphate, iPMP。該步驟是細胞分裂素生物合成的一個限速步驟 (Taya et al., 1978。隨后, 在致癌農(nóng)桿菌 (Agrobacterium tumefaciens 中的致瘤Ti 質(zhì)粒上克隆的異戊烯基轉(zhuǎn)移酶基因 (IPT是第一個被克隆的編碼細胞分裂素合成酶的基因。在農(nóng)桿菌

12、的致瘤Ti質(zhì)粒上有Tmr和Tzs兩個IPT 基因(Akiyoshi et al., 1984; Barry et al., 1984。在之后10余年中, 對在植物細胞中是否具有類似的細胞分裂素從頭合成途徑一直沒有定論。在擬南芥全基因組序列完成后, 兩個研究小組獨立發(fā)現(xiàn)擬南芥中共有9個IPT-類似基因,分別命名為AtIPT1到AtIPT9。生物信息學分析表明AtIPT2和AtIPT9在序列上與tRNA-IPT 更相似, 而其它7種AtIPTs與細菌IPT基因結構相似 (Kakimoto, 2001; Takei et al., 2001。其中, PGA22/IPT8基因的過量表達導致典型的細胞d

13、istinctive function in the regulation of a variety of developmental processes. In this review, we summarize our current understanding on cytokinin metabolism and transport, and discuss in detail on recent advances in cytokinin signaling as well as its cross-talks with other signaling pathways. We al

14、so make prospects on possible improvement of important agricultural traits by manipulating the cytokinin network.Key words cytokinin, signal transduction, two-component system, cross-talks48023(5圖1 細胞分裂素的代謝IPT催化細胞分裂素生物合成的第一個限速步驟, 該酶可能優(yōu)先利用ATP和ADP作為底物。植物體內(nèi)的大部分iPMP來自于底物iP、iPR、iPTP和iPDP, 僅有少部分是由AMP經(jīng)IPT催

15、化合成的。t-ZMP 可能主要由AMP和未知的側鏈前體經(jīng)iPMP非依賴途徑合成, 也可由iPMP和t-ZDR合成。反式玉米素t-Z主要由iP形式的細胞分裂素羥基化形成, 細胞色素P450單加氧酶CYP735A催化了這一反應。iP和t-Z是細胞分裂素的活性形式, 二者及其核苷化衍生物iPR和t-ZR可被CKX不可逆地降解。iP和t-Z也可被細胞分裂素N-葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶(CKNGT不可逆的糖基化。t-Z還可以由tZOGT催化形成t-ZR, 該反應是可逆反應。而t-ZR的糖苷鍵可被-葡萄糖苷酶裂解而產(chǎn)生自由態(tài)的t-Z。玉米素可以在反式(t-Z和順式(c-Z之間相互轉(zhuǎn)換, 一般認為t-Z比c-Z的生物

16、學活性要高。上述反應共同調(diào)節(jié)細胞分裂素在體內(nèi)的動態(tài)平衡。改編自參考文獻(Astot et al., 2000; Kakimoto, 2003a; Takei et al., 2004; Sakakibara, 2006。Fig. 1 Cytokinin metabolismIPT catalyzes the first rate-limiting step in the cytokinin biosynthesis pathway, which may preferentially utilize ATP and ADP as substrates. Most iPMP is produced

17、 from iP, iPR, iPTP and iPDP, whereas a minor fraction is derived from AMP. t-ZMP may be mainly synthesized from AMP and an unknown precursor via the iPMP-independent pathway, and can also be derived from iPMP and t-ZDR. Trans-zeatin (t-Z is predominantly converted from the iP-type cytokinins, catal

18、yzed by the cytochrome P450 monooxygenase CYP735A. iP and t-Z are biologically active forms of cytokinin, which, together with their riboside-derivatives iPR and t-ZR, can be irreversibly degraded by CKX. iP and t-Z can be irreversibly converted to the inactive O-glucoside derivatives by CKNGT. In a

19、ddition, t-Z can also be reversibly converted to tZOGT, which, in turn, can be converted into t-ZR by -glucosidase. Zeatins have two isoforms, t-Z and cis-zeatin (c-Z, and t-Z is generally believed to be a more active form than c-Z. These interconversions regulate homeostasis of cytokinins in planta

20、. Adapted from refer-ences (Astot et al., 2000; Kakimoto, 2003a; Takei et al., 2004; Sakakibara, 2006.481 2006鄧巖等: 細胞分裂素:代謝、信號轉(zhuǎn)導、交叉反應與農(nóng)藝性狀改良分裂素反應, 例如根變短, 下胚軸變粗, 子葉深綠色等。進一步的研究發(fā)現(xiàn), 在pga22突變體中, 異戊烯基腺嘌呤(isopentenyladenosine, iP的核苷酸形式iPMP和核苷形式iPR (isopenteny-ladenosine riboside的含量分別增加了19和38倍 (Sun et al.,

21、2003。上述結果表明, AtIPT8作為一個有功能的IPT在植物體內(nèi)直接催化了iPMP的生物合成。類似的結果也發(fā)現(xiàn)于對AtIPT4 (Kakimoto, 2001、牽?；?(Petunia hybrida (Zubko et al., 2002和蛇麻草 (Humulus lupulus (Sakano et al., 2004 等IPT基因的研究。在擬南芥中, 不同AtIPTs基因的表達模式不完全相同, 呈現(xiàn)不同的組織特異性, 表明細胞分裂素可能在植物體不同組織或部位合成(Miyawaki et al., 2004。由于以上細胞分裂素的合成途徑都有一個共同的中間體iPMP, 因此被稱為iPM

22、P依賴途徑。近年來的研究表明, 在植物體內(nèi)還存在著另一條細胞分裂素合成途徑, 即iPMP非依賴途徑。iPMP在內(nèi)源羥化酶的作用下, 可轉(zhuǎn)化成ZMP。然而在IPT轉(zhuǎn)化擬南芥植株中, ZMP 的生物合成速率比由IPT 酶催化產(chǎn)生的iPMP 的生物合成速率高66倍 (Astot et al., 2000。此外, 同位素雙示蹤試驗表明, ZMP 的主要前體不是細胞質(zhì)中的iPMP, 可能是由AMP和一種未知的側鏈前體合成, 而該途徑受3-羥基-3-甲基戊二酰輔酶A還原酶的抑制劑mevastatin的強烈抑制, 表明這種未知的側鏈前體物質(zhì)可能是類萜的衍生物 (Astot et al., 2000。對IPT

23、過表達轉(zhuǎn)基因煙草的研究發(fā)現(xiàn), ZR和ZMP的含量增加, 而iPMP的含量不受影響 (Redig et al., 1996或降低 (Eklof et al., 1996, 此結果也支持了iPMP 非依賴途徑的存在。但在擬南芥中的研究也表明IPTs可能優(yōu)先利用ADP和(或ATP, 而AMP可能不是細胞分裂素生物合成的主要底物或前體。因此, 有的研究者認為植物體內(nèi)的絕大部分iPMP可能由下面3個途徑產(chǎn)生: (1二磷酸異戊烯基腺苷(isopentenyladenosine-5'-diphosphate, iPDP或三磷酸異戊烯基腺苷iPTP (isopentenyladenosine-5

24、9;-triphosphate經(jīng)磷酸化酶去磷酸化; (2核苷結合態(tài)細胞分裂素異戊烯基腺苷(isopentenyladenosine riboside, iPR經(jīng)腺苷激酶而磷酸化; (3iPR經(jīng)腺嘌呤磷酸轉(zhuǎn)移酶結合上磷酸核糖基團 (Kakimoto, 2001; Takei et al., 2004。iP-形式的細胞分裂素也可以由細胞色素P450單加氧酶CYP735A1和CYP735A2羥基化后合成反式玉米素(trans-zeatin, t-Z(Takei et al., 2004(圖1。1.2 細胞分裂素的降解與修飾近年來, 細胞分裂素的氧化分解作為調(diào)節(jié)細胞分裂素動態(tài)平衡的一種重要方式而得到廣

25、泛關注。細胞分裂素氧化酶(cytokinin oxidase/ dehydrogenase, CKX首先是在玉米中發(fā)現(xiàn)的,能特異的降解細胞分裂素類異戊二烯側鏈的不飽和鍵, 該反應是一個不可逆反應(圖1(Houba-Herin et al., 1999; Morris et al., 1999。在蘭花(Dendrobium orchid或擬南芥中過量表達蘭花DSCKX1基因, 導致內(nèi)源細胞分裂素的含量顯著下降, 從而產(chǎn)生了細胞分裂素缺失表型, 如莖生長延遲, 而根的生長加速 (Yang et al., 2003a, 2003b 。過量表達AtCKX1-4基因的擬南芥植株中, 內(nèi)源細胞分裂素的含量

26、顯著下降, 表現(xiàn)多種細胞分裂素缺失表型(Werner et al., 2003, 類似于細胞分裂素受體三突變體的表型(見下述。擬南芥細胞分裂素缺陷的表型之一是促使胚乳細胞分裂與生長, 因而CKX基因過量表達導致轉(zhuǎn)基因種子的明顯增大(Werner et al., 2003, 暗示細胞分裂素對提高農(nóng)作物產(chǎn)量的潛在價值。這一重要推測最近在水稻中得到證實。在水稻中, 許多重要農(nóng)藝性狀都是受數(shù)量遺傳性狀(QTL基因控制的。日本和中國科學家通過圖位克隆鑒定分析了其中的一個主要QTL基因GN1A, 發(fā)現(xiàn)其編碼一個細胞分裂素氧化酶(OsCKX2。通過對不同產(chǎn)量性狀的栽培品種Koshihikari(低產(chǎn)、 Ha

27、bataki、5030、5150和90B2(后3個品種在我國長江流域大規(guī)模48223(5種植等的分析發(fā)現(xiàn), 高產(chǎn)品種(后4個品種中OsCKX2基因均攜帶不同的功能缺失性突變, 促使體內(nèi)細胞分裂素含量增加, 特別是在分生組織與生殖器官中增加更為顯著, 因而導致小穗數(shù)和小穗中籽粒數(shù)顯著增加(Ashikari et al., 2005。這一發(fā)現(xiàn)對新一輪綠色革命具有重大意義。細胞分裂素在體內(nèi)的修飾、相互轉(zhuǎn)換與轉(zhuǎn)運對調(diào)控其生理活性具有重要意義(Mok and Mok, 2001。細胞分裂素可以在自由態(tài)、核苷和核苷酸等形式之間相互轉(zhuǎn)換。這種轉(zhuǎn)換不僅影響了細胞分裂素的動態(tài)平衡而且還影響了其轉(zhuǎn)運, 因而受到廣

28、泛關注。植物體中細胞分裂素的種類繁多, 形式最簡單的是自由態(tài)的異戊烯基腺嘌呤(isopentenyladenine, iP和反式玉米素(trans-zeatin, t-Z, 而更多的是發(fā)生在N3、N7和N9基團上的、以iP 和t-Z 通過N-糖基化、N-丙?；騉-糖基化、O-乙?；刃问酱嬖诘慕Y合態(tài)細胞分裂素。一般認為,結合態(tài)細胞分裂素是儲藏形式(糖基化等或轉(zhuǎn)運形式(核苷化, 而自由態(tài)為主要的生物學活性形式。因此, 不同形式細胞分裂素的轉(zhuǎn)換被認為是調(diào)節(jié)其體內(nèi)平衡的主要方式之一 (Mok and Mok, 2001。在糖基化修飾中, 了解最清楚的例證之一是玉米素配糖物(zeatin O-g

29、lucoside。玉米素配糖物的形成是由玉米素O-葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶(zeatin O-glucosyltransferase, ZOGT催化的 (Dixon et al., 1989; Veach et al., 2003。糖基化形式的細胞分裂素不但影響了細胞分裂素的活性, 而且這種形式的細胞分裂素不能被細胞分裂素氧化酶降解。然而, 這種糖基化是可逆的,葡萄糖苷酶可以切割糖苷鍵釋放出自由態(tài)的細胞分裂素 (Brzobohaty et al., 1993。一般認為,細胞分裂素的結合態(tài)形式較為穩(wěn)定, 但在有關酶的作用下, 非結合態(tài)與結合態(tài)細胞分裂素之間可以互變, 植物可以在一定程度上以形成不同程度結合

30、態(tài)的方式來調(diào)節(jié)植物體內(nèi)細胞分裂素的水平。雖然, 人們對細胞分裂素的O-糖基化的了解較多, 但對N-糖基化的認識仍有限。Hou等(2004 分析了105個重組糖基轉(zhuǎn)移酶對細胞分裂素的催化活性, 從中鑒定出2個細胞分裂素N-糖基轉(zhuǎn)移酶(CK N-glucosyltransferase, CKNGTUGT76C1和UGT76C2, 分別催化N7和N9位細胞分裂素的糖基化。體內(nèi)實驗表明UGT76C1能使外源施加的細胞分裂素發(fā)生糖基化。與O-糖基化不同, 細胞分裂素7-N-糖苷和9-N-糖苷不能被糖苷酶所識別, 因而該反應是不可逆反應(圖1。細胞分裂素的N-糖基化可能參與了植物體內(nèi)的解毒反應(Letha

31、m and Palni, 1983。1.3 細胞分裂素的轉(zhuǎn)運在所有植物激素中, 對生長素的極性運輸及其對植物生長發(fā)育的調(diào)控作用的了解比較系統(tǒng), 而對其它所有激素的轉(zhuǎn)運了解甚少。近年來, 對細胞分裂素轉(zhuǎn)運的研究獲得部分線索。由于細胞分裂素只能在特定的組織和細胞合成,因此必須通過擴散或主動運輸?shù)姆绞竭\輸?shù)桨形患毎拍苷_行使功能。目前已有的證據(jù)表明兩類蛋白可能參與了細胞分裂素的運輸, 即嘌呤透性酶(purine permeases, PUPs和核苷轉(zhuǎn)運蛋白。利用酵母細胞進行的生化研究表明,這兩種蛋白都能轉(zhuǎn)運自由態(tài)和核苷形式的細胞分裂素。擬南芥中有2個嘌呤及其衍生物的轉(zhuǎn)運蛋白AtPUP1和AtPUP

32、2, 二者均能在酵母細胞中轉(zhuǎn)運自由態(tài)細胞分裂素, 但其在植物體內(nèi)的功能未知 (Gillissen et al., 2000; Burkle et al., 2003。目前認為在植物體內(nèi), 細胞分裂素主要以核苷的形式運輸 (Mok and Mok, 2001; Sakakibara, 2006。通過篩選擬南芥pga22/ atipt8的抑制子突變體, Sun等(2005鑒定了一個弱抑制子突變soi33 (suppressor of ipt8。分子遺傳學研究發(fā)現(xiàn)SOI33基因編碼一個擴散性核苷轉(zhuǎn)運蛋白AtENT8。生理學和生化研究表明SOI33/AtENT8以及其同源蛋白AtENT3參與了擬南芥體

33、內(nèi)核苷結合態(tài)細胞分裂素的轉(zhuǎn)運。在特定條件下, soi33和atent3突變體對外源結合態(tài)細胞分裂素的反應減弱, 但對自由態(tài)外源激483 2006鄧巖等: 細胞分裂素:代謝、信號轉(zhuǎn)導、交叉反應與農(nóng)藝性狀改良素的反應沒有明顯變化。外源核苷類細胞分裂素吸收的測定結果表明, soi33和atent3對結合態(tài)3H-iPR的吸收比野生型降低了40%, 然而對3H-tZR的吸收沒有明顯地變化(Sun et al., 2005。上述結果表明SOI33/AtENT8和AtENT3可能是結合態(tài)細胞分裂素iPR的主要轉(zhuǎn)運蛋白之一。對水稻中同源蛋白的生化研究印證了這一結論。在酵母細胞中異源表達的水稻OsENT2蛋白能

34、夠高親和力地轉(zhuǎn)運iPR, 而對t-ZR的轉(zhuǎn)運效率很低 (Hirose et al., 2005。ENT 家族蛋白功能的初步確定是繼生長素轉(zhuǎn)運蛋白PIN家族蛋白功能分析后發(fā)現(xiàn)的第二類植物激素轉(zhuǎn)運蛋白。目前還不確定ENT家族蛋白參與的細胞分裂素的轉(zhuǎn)運是否為植物體內(nèi)細胞分裂素轉(zhuǎn)運的主要形式。2細胞分裂素的信號轉(zhuǎn)導途徑近年來的研究表明, 在植物體內(nèi)細胞分裂素是利用了一種類似于細菌中雙元組分系統(tǒng)的途徑將信號傳遞至下游元件的。在擬南芥中,首先是作為細胞分裂素受體的組氨酸激酶(Arabidopsis histidine kinases, AHKs與細胞分裂素結合后自磷酸化, 并將磷酸基團由激酶區(qū)的組氨酸轉(zhuǎn)移

35、至信號接收區(qū)的天冬氨酸; 天冬氨酸上的磷酸基團被傳遞到胞質(zhì)中的磷酸轉(zhuǎn)運蛋白(Arabidopsis histidine-phosphotransfer proteins, AHPs, 磷酸化的AHPs進入細胞核并將磷酸基團轉(zhuǎn)移到A型和B型反應調(diào)節(jié)因子(Arabidopsis response regulators, ARRs上, 進而調(diào)節(jié)下游的細胞分裂素反應。B型ARR是一類轉(zhuǎn)錄因子, 作為細胞分裂素的正調(diào)控因子起作用, 可激活A型ARR基因的轉(zhuǎn)錄。A型ARR 作為細胞分裂素的負調(diào)控因子可以抑制B型ARR的活性, 從而形成了一個負反饋循環(huán)(圖2。最近的一項研究發(fā)現(xiàn), 細胞分裂素受體CRE1/A

36、HK4/WOL除激酶活性外還同時具有磷酸酶的活性, 可以將磷酸基團從磷酸化的AHPs 上轉(zhuǎn)移回CRE1的天冬氨酸上, 說明細胞分裂素介導的磷酸基團傳遞是一個雙向的可逆的過程(Mahonen et al., 2006a (圖2。在擬南芥中發(fā)現(xiàn)了3個作為細胞分裂素受體的AHK、5個AHP以及23個ARR。分子生物學和遺傳學研究表明, 不同的AHK、AHP 和ARR之間在序列上有著很高的同源性, 并存在高度的功能冗余現(xiàn)象。最近的研究發(fā)現(xiàn)它們同時也具有一定的功能特異性,不同的AHK、AHP和ARR可能在特定的細胞分裂素反應或與其它信號途徑的交叉反應中起主要作用。這些功能冗余又不失特異性的蛋白一起組成了

37、細胞分裂素的信號轉(zhuǎn)導網(wǎng)絡(圖2。關于細胞分裂素信號轉(zhuǎn)導的雙元組分系統(tǒng),已經(jīng)有很多綜述對其進行了系統(tǒng)全面的介紹和討論 (Hwang et al., 2002; 鄭丙蓮等, 2003; Kakimoto, 2003b; Ferreira and Kieber, 2005。下面將著重討論關于AHKs、AHPs和ARRs功能的一些最新研究進展以及細胞分裂素與其它信號途徑之間的交叉反應。2.1 組氨酸激酶AHK在擬南芥中, 目前發(fā)現(xiàn)有3個組氨酸激酶是細胞分裂素的受體, 分別為AHK2、AHK3和CYTOKININ R ESPONSE 1(CRE1(又名AHK4和WOODEN LEG, WOL。其中, 最

38、先發(fā)現(xiàn)的CRE1是因為其功能缺失型突變體的外植體在含有適當濃度的細胞分裂素和生長素時不能形成綠色愈傷和不定芽而被分離鑒定到的(Inoue et al., 2001。CRE1蛋白以依賴于細胞分裂素的方式特異地互補酵母和大腸桿菌相關組氨酸激酶缺失突變體的表型(Inoue et al., 2001; Suzuki et al., 2001。此外, 表達CRE1的酵母細胞膜提取物具有與細胞分裂素特異的高親和力(Yamada et al., 2001, 因此, CRE1是一個細胞分裂素受體。在原生質(zhì)體的瞬時表達系統(tǒng)中, 過量表達CRE1導致細胞分裂素標記基因(marker gene對細胞分裂素超敏感(H

39、wang and Sheen, 2001, 而在幼苗中, 細胞分裂素對根伸長的抑制作用在cre1突變體中明顯減弱, 說明CRE1作48423(5圖2 細胞分裂素信號轉(zhuǎn)導模式圖位于質(zhì)膜上的受體AHK2、3和4在結合細胞分裂素后, 其激酶區(qū)中保守的組氨酸發(fā)生自磷酸化, 之后磷酸基團轉(zhuǎn)移至其信號接收區(qū)中保守的天冬氨酸, 進而傳遞至胞質(zhì)中的AHP1-5上將其激活。磷酸化的AHP進入細胞核后將磷酸基團傳遞至核內(nèi)的A型和B型ARR上, 以激活下游的細胞分裂素反應。其中, AHK4/CRE1受體不僅具有激酶活性, 也具有磷酸酶活性, 可以將磷酸基團從磷酸化的AHP轉(zhuǎn)移到自身的天冬氨酸上。B型ARR的信號接收

40、區(qū)可以抑制自身的活性, 而細胞分裂素啟始的磷酸傳遞可以解除這種抑制作用, 進而激活A型ARR等細胞分裂素初級反應基因的表達。而A型ARR又可以反過來抑制B 型ARR的活性。B型ARR也可以激活CRF的表達, 而細胞分裂素又可以通過AHK及AHP誘導CRF進入細胞核與B型ARR一起共同調(diào)節(jié)部分細胞分裂素初級反應基因的表達。AHP6作為細胞分裂素的負調(diào)控因子, 可以抑制磷酸基團由AHP1-5到B型ARR的傳遞, 其自身的表達又受到細胞分裂素的抑制(AHP6的定位及細胞分裂素抑制其表達的機制仍不清楚。此外, CKI1和CKI2可能通過受未知信號的激活而參與細胞分裂素信號轉(zhuǎn)導。Fig. 2 A mod

41、el of the cytokinin signaling pathwayUpon binding by cytokinin, the cytokinin receptors AHK2, 3 and 4 are autophosphorylated at the conserved His residues in the kinase domain. The phosphoryl group is then transferred to the conserved Asp residues located in the receiver domain of the receptors, fol

42、lowed by transferring to the His residues of AHP1-5 in the cytoplasm. The phosphorylated AHPs are subsequently translocated into the nuclei, and transfer the phosphoryl group to the A-type ARR and B-type ARR proteins, leading to the activation of the downstream components. Note that, the AHK4/CRE1 r

43、eceptor has both kinase and phosphatase activities, which can transfer a phosphoryl group from an AHP to the Asp residue of the receptor. The receiver domain of the B-type ARR proteins negatively regulate their own activities, whereas cytokinin-activated phosphorelay relieves the repressive effect,

44、resulting in the expression of cytokinin primary responsive genes (e.g., A-type ARRs. A-type ARRs, in turn, negatively regulate B-type ARRs by an unknown mechanism. Whereas the B-type ARRs can also activate the CRF expression, cytokinin induces nuclear-localization of CRFs in an AHK- and AHP-depende

45、nt manner. Together with B-type ARRs, CRFs regulate the expression of cytokinin primary responsive gene. AHP6 is a negative regulator of the cytokinin response by inhibiting the transfer of phosphoryl groups from AHP1-5 to B-type ARRs. Expression of AHP is repressed by cytokinin by an unknown mechan

46、ism (subcellular localization of AHP6 is unclear. CKI1 and CKI2, activated by unknown stimuli, may also be involved in the cytokinin signaling.485 2006鄧巖等: 細胞分裂素:代謝、信號轉(zhuǎn)導、交叉反應與農(nóng)藝性狀改良為細胞分裂素受體在細胞分裂素信號轉(zhuǎn)導中起正調(diào)控作用。AHK2和AHK3也被陸續(xù)證明能在體外和體內(nèi)特異地結合細胞分裂素(Yamada et al., 2001。3個受體的胞外區(qū)均具有保守的CHASE結構域, 被認為是細胞分裂素的結合區(qū)(An

47、antharaman and Aravind, 2001; Pas et al., 2004。細胞分裂素3個受體基因的大多數(shù)單突變體和雙突變體對外源激素的敏感性有不同程度的降低, 但在正常生長條件下均無明顯的生長發(fā)育缺陷,表明其功能的冗余性。對a h k2/ ahk3、ahk2/cre1和ahk3/cre1雙突變體的研究發(fā)現(xiàn), 雙突變體與各自的單突變體相比對細胞分裂素的敏感性均有進一步的降低。雖然外源細胞分裂素對根伸長的抑制作用在cre1突變體中明顯減弱, 但ahk2和ahk3單突變體以及ahk2/ahk3雙突變體的反應與野生型沒有明顯區(qū)別, 表明細胞分裂素在根中的作用可能主要是通過CRE1行

48、使的(Higuchi et al., 2004; Nishimura et al., 2004。相反, 雖然ahk2/ahk3雙突變體表現(xiàn)出地上部分生長缺陷(包括葉子變小和莖變短等, 但ahk2/cre1和ahk3/cre1雙突變體均沒有明顯的發(fā)育異常, 說明細胞分裂素在植物地上部分的作用可能主要是通過AHK2和AHK3行使的(Higuchi et al., 2004; Nishimura et al., 2004。ahk2/ahk3/cre1三突變體對外源細胞分裂素的反應幾乎被完全阻斷, 同時其植株生長遲緩,根、葉生長發(fā)育嚴重受阻, 育性也受到了嚴重的影響 (Higuchi et al.,

49、2004; Nishimura et al., 2004。上述結果說明細胞分裂素在植物生長發(fā)育中起著重要的作用, 而功能冗余的AHK2、AHK3和CRE1在細胞分裂素信號轉(zhuǎn)導途徑上起正調(diào)控的作用, 但其功能具有一定的特異性(見下述。細胞分裂素的主要生理功能之一是延緩葉片衰老 (Mok and Mok, 2001。衰老與光信號也密切相關。通常, 離體葉片在黑暗中會加速衰老。在篩選可以延緩黑暗誘導的離體葉片衰老的突變體時, Kim等(2006分離鑒定了一個AHK3的功能獲得型突變體。進一步研究發(fā)現(xiàn),過量表達AHK3的轉(zhuǎn)基因植物同樣可以延緩黑暗誘導的離體葉衰老, 而AHK3的功能缺失型突變體則會加速

50、離體葉的衰老, 同時細胞分裂素對葉片衰老的抑制作用在ahk3突變體中也出現(xiàn)了大幅的減弱(Kim et al., 2006, 說明AHK3在細胞分裂素調(diào)節(jié)的葉片衰老過程中起到了正調(diào)控作用。AHK3在調(diào)控衰老中的作用表現(xiàn)出高度的特異性: 與ahk3突變體不同, 細胞分裂素對ahk2和cre1突變體的葉片衰老的抑制作用沒有受到明顯的影響 (Kim et al., 2006, 表明在細胞分裂素調(diào)節(jié)葉片衰老的過程中, AHK3起到了主要的調(diào)控作用。在研究細胞分裂素受體作用的分子與生化機理方面, 最近也取得了突破性進展。如前述,大部分ahk4的等位突變體(包括功能完全缺失的突變體在正常生長條件下沒有明顯的

51、生長發(fā)育缺陷, 但其中的2個等位突變wooden leg (wol 和wol-2卻出現(xiàn)了嚴重的根維管組織的發(fā)育缺陷(Mahonen et al., 2000; de Leon et al., 2004,其表型與ahk2/ahk3/ahk4三突變體的表型類似(Higuchi et al., 2004; Nishimura et al., 2004。由于任意一個或任意組合的受體雙突變體沒有明顯的根發(fā)育缺陷, 因此wol和wol-2突變可能抑制所有3個受體啟動的信號轉(zhuǎn)導。有趣的是在wol/wol-2雜交的F1代中, wol-2可以互補wol 根的發(fā)育缺陷, 但不能互補wol對細胞分裂素敏感性減弱的表

52、型(de Leon et al., 2004, 即表現(xiàn)為部分的等位間互補(i n t e r-a l l e l i c complementation。此外, 在篩選wol的抑制突變體中分離鑒定的16個突變體中有13個是WOL基因本身的突變, 即WOL基因中的另一個突變抑制或互補了wol的表型(Mahonen et al., 2006a,即等位內(nèi)互補(i n t r a-a l l e l i c complementation。上述遺傳學研究表明CRE1/AHK4/WOL本身可能具有負反饋或自調(diào)控的機制。進一步的生化實驗表明, 細胞分裂48623(5素存在時, CRE1表現(xiàn)出自磷酸化的激酶

53、活性, 并將磷酸基團由ATP轉(zhuǎn)移至不同的AHP上。而在沒有細胞分裂素時, CRE1表現(xiàn)出磷酸酶活性,將磷酸基團從不同的AHP上轉(zhuǎn)移回CRE1上的天冬氨酸 (Mahonen et al., 2006a。因此, CRE1是一個雙功能的酶, 它不僅具有組氨酸激酶活性, 也具有可以將AHP去磷酸化的磷酸酶活性,說明細胞分裂素介導的磷酸基團傳遞是雙向的可逆的過程 (Mahonen et al., 2006a。根據(jù)這一模型, 不難解釋在wol突變中觀察的等位內(nèi)和等位間互補現(xiàn)象。wol突變發(fā)生在細胞分裂素結合的胞外區(qū), 使其不能與細胞分裂素結合。因此, 無論細胞分裂素存在與否, WOL突變蛋白始終維持在磷酸

54、酶活性狀態(tài), 從而阻斷了磷酸基團向下游的傳遞(包括AHK2和AHK3啟動的信號轉(zhuǎn)導, 導致嚴重的發(fā)育缺陷(Mahonen et al., 2006a。如果WOL突變蛋白的功能喪失(例如類似wol突變的抑制子突變中的情況, 則解除了其負調(diào)控或組成型的磷酸酶活性狀態(tài), 從而恢復正常的細胞分裂素信號轉(zhuǎn)導。值得指出的是, AHK2和AHK3均表現(xiàn)出磷酸激酶的活性,但不具備可檢測到的磷酸酶活性 (Mahonen et al., 2006a, 這進一步表明功能高度冗余的3個受體在功能及作用機制等方面存在著一定的特異性。除上述3個細胞分裂素受體外, 2個組氨酸激酶CYTOKININ INDEPENDENT1

55、 (CKI1和CKI2可能也參與了細胞分裂素信號轉(zhuǎn)導的調(diào)控。CKI1編碼一個具有跨膜結構的組氨酸激酶, 但其胞外區(qū)不具備保守的CHASE結構域。此外, 在體外實驗中CKI1不能與細胞分裂素結合, 因此, 一般認為CKI1可能不是細胞分裂素受體。cki1-D功能獲得性突變體表現(xiàn)出典型的細胞分裂素表型(Kakimoto, 1996, 其功能缺失型突變體表現(xiàn)為雌配子不育表型(Pischke et al., 2002; Hejatko et al., 2003。但在胚胎發(fā)育以及之后的生長發(fā)育過程中, cki1功能缺失型突變體在生長發(fā)育以及對外源激素的反應性上均無明顯表型(鄧巖和左建儒, 待發(fā)表。CKI

56、2編碼的組氨酸激酶不含有跨膜區(qū), 其功能缺失型突變體在正常生長條件下也沒有明顯的表型(Mizuno, 2005。關于CKI1和CKI2的作用機制仍有待進一步研究。2.2 磷酸轉(zhuǎn)運蛋白AHP在擬南芥中存在著5個AHP基因(AHP1到AHP5, 它們編碼了一類約150個氨基酸的蛋白,并含有保守的組氨酸磷酸轉(zhuǎn)移結構域。因為可以互補酵母的組氨酸磷酸轉(zhuǎn)運蛋白突變體的表型(Wurgler-Murphy and Saito, 1997; Suzuki et al., 1998, 且在體外實驗中可以從大腸桿菌的膜提取物和CRE1(或AHK2, AHK3, CKI1, CKI2上接收磷酸基團并轉(zhuǎn)移至ARR上(I

57、mamura et al., 1999; Mahonen et al., 2006a, AHPs被確定為有功能的組氨酸磷酸轉(zhuǎn)運蛋白。AHPs本身的表達不受細胞分裂素誘導。在原生質(zhì)體瞬時表達系統(tǒng)中, 細胞分裂素處理導致AHPs由胞質(zhì)轉(zhuǎn)移至細胞核內(nèi), 推測AHPs將磷酸基團由膜上的受體最終轉(zhuǎn)移至細胞核內(nèi)的ARRs上(Hwang and Sheen, 2001。通過酵母雙雜交分析及體外檢測AHKs激酶活性的研究, 發(fā)現(xiàn)不同的AHP和不同的AHK以及ARR之間存在著廣泛的互作(Imamura et al., 1999。由于功能的冗余性, AHPs與細胞分裂素的聯(lián)系一直缺乏遺傳學的證據(jù)。雖然過量表達AH

58、P2使轉(zhuǎn)基因植物的根和下胚軸對細胞分裂素的敏感性略為上升 (Suzuki et al., 2002, 但在外植體中, 過量表達AHP1、AHP2和AHP5均不能促進細胞分裂素對標記基因ARR6的誘導(Yamada et al., 2001。此外, ahp單突變體對外源細胞分裂素的敏感性也沒有明顯的改變。但最近的研究發(fā)現(xiàn), ahp1,2,3三突變體對外源細胞分裂素敏感性降低, ahp1,2,3,4,5五突變體不僅表現(xiàn)出了對細胞分裂素的不敏感性而且伴有嚴重的發(fā)育缺陷 (Ferreira and Kieber, 2005; Mizuno, 2005, 從而證明了AHPs是一類功能高度冗余的、在細胞分

59、裂素信號轉(zhuǎn)導途徑中起487 2006鄧巖等: 細胞分裂素:代謝、信號轉(zhuǎn)導、交叉反應與農(nóng)藝性狀改良正調(diào)控作用的因子。除AHP1-AHP5外, 在擬南芥基因組中還發(fā)現(xiàn)了一個高度同源的基因AHP6/APHP1。在AHP1-AHP5中高度保守的組氨酸在AHP6中變成了天冬酰胺, 因而AHP6可能不具備磷酸轉(zhuǎn)運蛋白的功能。在酵母及體外實驗中發(fā)現(xiàn), AHP6的確不具備磷酸轉(zhuǎn)運蛋白的活性, 相反卻抑制磷酸基團從AHP1到ARR1的傳遞, 并可能同時抑制磷酸基團從AHKs的組氨酸到天冬氨酸的傳遞。事實上, ahp6的缺失突變體是在篩選wol表型的抑制子突變體中獲得的, 即ahp6可部分抑制wol表型。此外, ahp6對外源細胞分裂素敏感性明顯增強, 而外源細胞分裂素可以抑制AHP6的表達(Mahonen et al., 2006b。因此, 生化和遺傳學的證據(jù)都表明AHP6可能是細胞分裂素信號轉(zhuǎn)導的負調(diào)節(jié)因子。2.3 反應調(diào)節(jié)因子ARR擬南芥基因組中共發(fā)現(xiàn)