感受態(tài)細(xì)胞的制備、質(zhì)粒DNA的轉(zhuǎn)化和提取流程

1、感受態(tài)細(xì)胞的制備過(guò)程 LB 液體培養(yǎng)基:胰蛋白胨, 1%(W/V ;酵母提取物, 0.5%(W/V ; NaCl , 1%(W/V ,用固體 NaOH 調(diào)節(jié) pH 為 7.07.2,分裝于三角瓶中,滅菌后存于 室溫。搖動(dòng)三角瓶,如果發(fā)現(xiàn)變渾濁,表明已染菌,應(yīng)棄掉重新配制; 0.1 mol/L CaCl2:稱取 1.47 g CaCl22H 20(Amresco 分裝溶于 100 mL去離子 水中,滅菌后存于 4; 離心管(50 mL或 80 mL或 100 mL ,滅菌; 培養(yǎng)試管,滅菌; 1 mL槍頭,滅菌; 1 mL加樣槍; 濾紙,用牛皮紙包好后滅菌; 10 mL量筒,滅菌; 5 mL移液

2、管,用棉花塞入管口,卷于報(bào)紙中滅菌; 冰,離心管架; 恒溫?fù)u床,可見(jiàn)分光光度計(jì),玻璃比色杯。1.接種空白大腸桿菌于 3 mL LB培養(yǎng)基中, 37劇烈震蕩培養(yǎng)過(guò)夜;2.將已培養(yǎng)好的種子液轉(zhuǎn)入 100 mL LB培養(yǎng)基中擴(kuò)大培養(yǎng)至 OD 650=0.3后,將 培養(yǎng)好的細(xì)菌置于冰上冷卻 10 min;3. 4, 4 000 rpm離心 10 min收集細(xì)菌,倒出上清,將離心管倒置于一干凈濾 紙上,將培養(yǎng)基控干;4.用 40 mL 冰預(yù)冷的 CaCl 2懸浮細(xì)菌,用加樣槍沖吸,使菌體盡可能分散。冰 上放置 30 min;5. 4, 4 000 rpm離心 10 min收集細(xì)菌,倒出上清,再用 4 m

3、L冰預(yù)冷的 CaCl 2懸浮細(xì)菌,這些細(xì)菌可以立即使用,或者于 4放置 1224 h以增加其敏感性 后使用。6.如果證明所制備的感受態(tài)細(xì)胞可用,可以在冰上分裝為 100 L每管,再加入 100 L甘油(注意:甘油非常黏稠,吸取時(shí)應(yīng)該多一點(diǎn)。 ,于液氮或 -70冰箱中存放。 存于低溫下的感受態(tài)細(xì)胞, 一定不能融解。 如果已經(jīng)融解, 應(yīng)丟棄, 而不能再凍結(jié)保存而繼續(xù)使用。注意事項(xiàng):1.本實(shí)驗(yàn)室所用空白大腸桿菌菌株為 JM109?？瞻拙梢杂谄桨迳蟿澗€后,用 Parafilm 包好后存于 4,也可將液體培養(yǎng)物存于 4。但如果要長(zhǎng)期保存, 則應(yīng)將細(xì)菌保存于 50%的甘油中,存于 -20或 -70。當(dāng)接

4、種的細(xì)菌是來(lái)自于 -20或 -70存放的液體培養(yǎng)物時(shí),接種應(yīng)迅速,不等解凍,立即從表面刮下 一塊冰后,將菌種迅速放回低溫存放;2. 一般于 3 mL LB培養(yǎng)基中過(guò)夜培養(yǎng) 12 h后, 菌體已很濃, 可以進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)。 于 100 mL培養(yǎng)基中培養(yǎng) 23 h后,即可達(dá)到對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期。但有時(shí)如果由于存 放過(guò)久,或者已經(jīng)過(guò)數(shù)次解凍,造成細(xì)菌生活力下降,則倍增時(shí)間會(huì)延長(zhǎng); 3.對(duì) OD 值的監(jiān)測(cè),當(dāng)肉眼看到菌體已很濃時(shí),于超凈臺(tái)上取 3 mL測(cè) OD 值。 開(kāi)始可以每 30分鐘檢測(cè)一次,越到后面檢測(cè)的時(shí)間就應(yīng)該縮短;4.感受態(tài)細(xì)胞的制備應(yīng)該再嚴(yán)格無(wú)菌的條件下進(jìn)行。因此,所有操作均應(yīng)在超 凈臺(tái)上。 也可

5、以在實(shí)驗(yàn)臺(tái)上進(jìn)行, 但應(yīng)在后面放一酒精燈, 所有操作都不能遠(yuǎn) 離火焰。 最好每次恰好做感受態(tài)之前, 將所有的槍頭和管子都滅一下菌, 用酒 精棉球?qū)⒓訕訕尩那岸瞬潦靡槐?5.感受態(tài)細(xì)胞的細(xì)胞膜比較脆弱,因此一當(dāng)用冰冷的 CaCl 2懸浮以后,即不能 劇烈震蕩或快速抽吸;6.根據(jù)我們的經(jīng)驗(yàn),純度較高的含結(jié)晶水的 CaCl 2可以得到好的實(shí)驗(yàn)結(jié)果;7.所有的槍頭和管子均應(yīng)干凈。如果有可能,都盡量用新的。如果是用的回收 的槍頭,一定要看管壁是否干凈。8.擴(kuò)大培養(yǎng)用的液體培養(yǎng)基體積可以調(diào)整。調(diào)整后的 CaCl 2溶液體積也按比例 作相應(yīng)的放大或縮小。9.以本方法制備的感受態(tài)細(xì)胞的感受效率將隨低溫保存時(shí)間

6、的延長(zhǎng)而下降,所 以最好是現(xiàn)做現(xiàn)用。 存于低溫下的感受態(tài)細(xì)胞應(yīng)該在一個(gè)月內(nèi)使用。 而對(duì)于轉(zhuǎn) 化 PCR 連接產(chǎn)物,建議用其它的感受效率更高的制備方法。本節(jié)后的附 4介 紹了一種高感受效率感受態(tài)細(xì)胞的制備方法。質(zhì)粒 DNA 的轉(zhuǎn)化 LB 液體培養(yǎng)基:見(jiàn)感受態(tài)細(xì)胞的制備; LB 固體培養(yǎng)基:于液體培養(yǎng)基中加入 1.5%的瓊脂粉。 不用在滅菌前溶化瓊脂 粉,滅菌完后,輕輕搖勻。注意不能劇烈搖動(dòng),否則可能會(huì)使培養(yǎng)基暴沸; LB 平板:將滅菌后的固體培養(yǎng)基冷至 60左右時(shí), 倒入 90 mm的培養(yǎng)皿中 (約 30 mL。如果先前已加入了抗生素,則還應(yīng)在超凈臺(tái)上晃動(dòng)培養(yǎng)皿幾次; 200 L槍頭, 1.5

7、mL Ep管,滅菌; 42水浴;10 L, 200 L加樣槍; 培養(yǎng)試管,滅菌; 恒溫?fù)u床,恒溫培養(yǎng)箱; 菌液推棒; 抗生素儲(chǔ)液,本實(shí)驗(yàn)室所有的質(zhì)粒篩選所用的抗生素有兩類,氨卞青霉素 (Amp (儲(chǔ)液, 100 mg/mL,溶于無(wú)菌水中,工作濃度 100 g/mL,即每毫升 培養(yǎng)基取 1 L儲(chǔ)液 ;四環(huán)素(Tet (儲(chǔ)液, 5 mg/mL,先用 1/2體積的乙醇 溶解, 再加入 1/2體積的無(wú)菌水, 工作濃度 50 g/mL, 即每毫升培養(yǎng)基取 10 L儲(chǔ)液。儲(chǔ)液全部于 -20保存 ; 冰;1.如果是凍存的感受態(tài)細(xì)胞,先于冰上溶解;2.加入用于轉(zhuǎn)化的質(zhì)粒 DNA 1 L;3.冰上放置 30 m

8、in;4.于 42熱擊 60 s;5.迅速放于冰上, 5 min后進(jìn)行下一步;6.將已攝取了外源遺傳物質(zhì)的感受態(tài)細(xì)胞加入培養(yǎng)試管,該培養(yǎng)試管有已預(yù)熱 至 37的 LB 液體培養(yǎng)基,使總體積為 1 mL,溫和震蕩(200 rpm左右培養(yǎng) 1 h;7, 將復(fù)蘇的培養(yǎng)物倒入一 Ep 管中, 4, 4 000 rpm離心 10 min, 將培養(yǎng)基倒掉,用殘留的培養(yǎng)基懸浮,然后用加樣槍將菌液加到 LB 平板上,用推棒涂布直至 培養(yǎng)基表面無(wú)可見(jiàn)的液體,將有培養(yǎng)基的一面向下培養(yǎng)約 30 min 后,倒置培 養(yǎng)過(guò)夜。注意事項(xiàng):1.熱擊時(shí)間要根據(jù)所用管子的傳熱效率,薄壁管子的傳熱效率高,熱擊時(shí)間可 以縮短到 4

9、5 s;2.熱擊時(shí),要使水浴盡可能不要流動(dòng),熱擊后應(yīng)迅速放回冰上;3.于 37復(fù)蘇細(xì)菌時(shí),不能加抗生素,搖動(dòng)也不能太過(guò)于劇烈;4.對(duì)照的設(shè)置對(duì)于評(píng)價(jià)轉(zhuǎn)化結(jié)果非常重要,將 10 L感受態(tài)細(xì)胞分別涂布于不 含抗生素或含有抗生素的平板上, 如果感受態(tài)細(xì)胞沒(méi)有問(wèn)題, 則應(yīng)該在不含抗 生素的平板上生長(zhǎng),而在含有抗生素的平板上不能生長(zhǎng)。5.一般轉(zhuǎn)化細(xì)胞可以用其中的 1/3涂布一個(gè)平板, 2/3涂布一個(gè)平板。不過(guò),對(duì) 于多拷貝質(zhì)粒,也可以不用離心,取 50 L涂布一個(gè)平板足矣。質(zhì)粒 DNA 的提取 儲(chǔ)液:100 mL 1 mol/L Tris-HCl (pH 8.0:稱取 Tris 12.1 g, 用濃 H

10、Cl 調(diào)節(jié) pH 為 8.0, 然后定溶至 100 mL, 滅菌后存于 4; 100 mL 0.5 mol/L EDTA (pH 8.0:稱取 18.6 g 二水乙二胺四乙酸二鈉,加 80 mL 去離子水,加熱溶解,用固體 NaOH 調(diào)節(jié) pH 為 8.0, 然后定溶至 100 mL, 滅菌后存于 4; 100 mL 10% SDS, 稱取 10 g十二烷基硫酸鈉于 80 mL去離子水中, 加熱溶解后存于室溫; 2 mol/L NaOH 10 mL, 稱取 0.8 g固體 NaOH 溶解, 定溶至 10 mL, 于塑料瓶中室溫存 放,可以不滅菌。 溶液 I :每配制 100 mL, 稱取葡萄糖

11、 0.9 g (50 mmol/L, 1 mol/L Tris-HCl (pH 8.0 2.5 mL (25 mmol/L, 0.5 mol/L EDTA (pH8.0 2 mL (10 mmol/L,定溶至 100 mL ,滅菌后存于 4; 溶液 II :現(xiàn)用現(xiàn)配,每 100 L需要 2 mol/L NaOH 10 L (0.2 mol/L, 10% SDS 10 L (1%,然后加 80 L無(wú)菌水; 溶液 III :每 100 mL 稱取 KAc 49.1g, 于 70 mL 去離子水中溶解,然后加入冰 乙酸 11.5 mL,定溶至 100 mL后,滅菌存于 4; TE (pH 8.0:每

12、 100 mL取 1 mol/L Tris-HCl (pH 8.0儲(chǔ)液 1 mL (10 mmol/L, 0.5 mol/L EDTA (pH 8.0 0.2 mL (1 mmol/L,定溶至 100 mL后,滅菌存于 4; 無(wú) DNase 的 RNaseA :將 RNaseA 溶于 10 mmol/L Tris-HCl (pH7.5, 15 mmol/L NaCl 中,使終濃度為 10 mg/mL,于 100加熱 15分鐘,緩慢冷至室溫,然后 存于 -20; Tris 飽和酚 (pH 8.0; 氯仿 /異戊醇(24:1 ; 100%乙醇與 70%乙醇,均于 -20存放; 1.5 mL Ep管

13、, 200 L及 1 mL槍頭,滅菌;40 L, 200 L, 1 mL加樣槍; 濾紙, 1.5 mL Ep管; 冰;1.接種一單菌落于 3 mL 含相應(yīng)抗生素的培養(yǎng)試管中,于 37劇烈振蕩培養(yǎng)過(guò) 夜;2.將全部培養(yǎng)物分兩次倒入 1.5 mL Ep管中 ,12 000 g 離心 1 min收集細(xì)胞 ;3.將 Ep 管倒置于一干凈濾紙上,將培養(yǎng)基盡可能流盡;4.將細(xì)菌沉淀重懸于 200 l冰預(yù)冷的溶液 I 中,劇烈振蕩使細(xì)菌沉淀分散;5.加 400 L新配制的溶液 II ,蓋緊管口,輕柔的快速顛倒 Ep 管 510次,然 后將 Ep 管于冰上放置 5 min;6.加 300 L用冰預(yù)冷的溶液 I

14、II ,蓋緊管口,將 Ep 管顛倒混合 15次左右,然 后將 Ep 管于冰上放置 5 min;7. 2, 12 000 g 離心 5 min ,將上清轉(zhuǎn)入另一 Ep 管,加等體積的酚 /氯仿,振 蕩混勻, 2, 12 000 g 離心 5 min;8.吸出上清,再加等體積的氯仿抽提;9.在吸出的上清中加入 2倍體積冰冷的乙醇于室溫沉淀 2 min;10. 2, 12 000 g 離心 5 min,倒出上清,沉淀用 70%乙醇洗兩次。然后倒置于一濾紙上,讓乙醇揮發(fā)干凈;11.高拷貝質(zhì)粒溶于含 5 L RNaseA的 50 l TE中;低拷貝數(shù)質(zhì)粒減半。注意事項(xiàng):1.細(xì)菌培養(yǎng)時(shí)間不宜過(guò)長(zhǎng),一般以

15、1216 h 為宜,如果培養(yǎng)時(shí)間過(guò)長(zhǎng),培養(yǎng)物 會(huì)非常粘稠,這會(huì)導(dǎo)致離心沉淀的困難;2.一般細(xì)菌培養(yǎng)好以后,應(yīng)該馬上提取。如果不能馬上提取,于 4存放時(shí)間 不能過(guò)長(zhǎng);2.加溶液 I 分散細(xì)菌沉淀比較關(guān)鍵,如果分散不好,將直接影響產(chǎn)率;3.溶液 I 加入后,溶液會(huì)非常渾濁,加入溶液 II 顛倒幾次后,溶液變清,打開(kāi) 管口,會(huì)發(fā)現(xiàn)溶液呈鼻涕樣,加入溶液 III 顛倒后,會(huì)發(fā)現(xiàn)有沉淀物形成,該 沉淀物位于溶液上層。 如果發(fā)現(xiàn)沉淀不能自動(dòng)聚集, 而是呈爛棉花狀, 且離心 后不能沉到管底,則預(yù)示著實(shí)驗(yàn)的失敗;4.培養(yǎng)基的成分非常復(fù)雜,如果去除得不太干凈,則有可能影響到后面的酶切 效果;5.乙醇必須去除干凈

16、,否則會(huì)造成電泳點(diǎn)樣時(shí)上漂;但樣品又不能干燥太久, 否則有可能使得質(zhì)粒 DNA 沉淀難于溶解在 TE 中。6. SDS 在低溫下會(huì)析出結(jié)晶,因此配制溶液 II 時(shí)應(yīng)先于 60溶解;7.如果一次要提多個(gè)樣品,可以先一起配制溶液 II ,而后加入每管。但配制時(shí) 應(yīng)略大于所需要的量;附:1.苯酚的平衡 重蒸苯酚 8-羥基喹啉 水浴鍋 固體 Tris 50 mmol/L Tris-HCl (pH 8.0: 稱取 6.055 g Tris,溶于 800 mL蒸餾水中,用濃HCl 調(diào) pH 為 8.0,定容到 1 L。1.將重蒸酚于 65水浴融化;2.取 100 mL融化的重蒸酚于一 250 mL燒杯中,

17、馬上加至少等體積的蒸餾水, 同時(shí)加入 0.1%苯酚體積的 8-羥基喹啉,然后加入少量的固體 Tris ,當(dāng) Tris 溶 解后,可看到液面分層出現(xiàn),加 Tris 用 7.68.5的精密 pH 試紙調(diào) pH 為 8.0 (待加入的 Tris 溶解充分后,停止攪拌,待分層完全出現(xiàn)后,再用 pH 試紙測(cè) 上相的 pH 值 。3.將上清吸出,加入 100 mL 50 mmol/L Tris (pH 8.0,充分?jǐn)嚢韬?測(cè)定上清的 pH 值。如果不到 8.0,則還需要調(diào)節(jié)。4. 將上清吸出, 再加入 100 mL 50 mmol/L Tris (pH 8.0, 充分?jǐn)嚢韬? 吸出上清, 但要在液面上保留

18、一層液體。倒入棕色瓶中,于 4保存。這樣的飽和酚可以 使用 2個(gè)月。 如果超出 2個(gè)月, 則應(yīng)倒入專用的盛裝回收酚的棕色瓶中, 再重 新平衡。注意:1. 酚有強(qiáng)烈的腐蝕性,所以操作時(shí)一定要小心,注意不能溢出或?yàn)R出,并且要 戴手套。如果 不小心濺到皮膚上,用大量的水沖洗,切忌用乙醇! !2. 由于酚的腐蝕性,所以不用 pH 計(jì)調(diào) pH 值,只能用 pH 試紙。3. Tris一定要溶解充分后,再測(cè)定 pH 值。2.核酸樣品中蛋白質(zhì)的去除 3 mol/L NaAC(pH 5. 2 :稱取 40.824 g NaAc3H 2O 或無(wú)水 NaAc 24.6 g,溶于 30 mL水中, 加 HAc 調(diào) p

19、H 至 5. 2, 用水定溶至 100 mL(調(diào) pH 時(shí),愈到后面, 愈應(yīng)小心 。然后滅菌存于 4。如果是濃縮 RNA ,還要用 DEPC 處理后再滅 菌。 槍頭和管子:根據(jù)純化樣品的不同而采取不同的處理方式,純化 DNA 時(shí)只需 滅菌,純化 RNA 時(shí)則需要 DEPC 處理后再滅菌。 Tris 飽和酚 (pH 8.0; 氯仿 /異戊醇(24:1 ; 凍存于 -20的無(wú)水乙醇和 70%乙醇1. 在核酸樣品中加入 1/2樣品體積的 Tris 飽和酚和 1/2樣品體積的氯仿 /異戊醇, 混勻后,于 2, 12 000 rpm離心 5 min,將上清轉(zhuǎn)入一新管中,重復(fù)酚 /氯仿 抽提直至界面無(wú)可見(jiàn)

20、的沉淀物為止。2. 加入 1倍樣品體積的氯仿 /異戊醇, 混合均勻后, 于 2, 12 000 rpm離心 5 min, 將上清轉(zhuǎn)入另一新管。3.加入 1/10終體積的 3 mol/L NaAC (pH 5. 2 ,再加入 2倍體積的冰冷的無(wú)水 乙醇,于 -20至少沉淀 3 h。4. 2, 12 000 rpm離心 15 min。沉淀用 70%的乙醇表面潤(rùn)洗 2次,將管倒置于 一濾紙上,空氣中干燥。然后將樣品溶于適量體積的溶劑中。注意:1.混勻方式要根據(jù) DNA 和 RNA 而有所不同:RNA 混勻時(shí),可以劇烈震蕩, 而 DNA 只能用手顛倒混勻。2.吸取上清液應(yīng)根據(jù)待純化的樣品是 DNA 還

21、是 RNA 而有所不同:DNA 吸取 要緩慢, RNA 則可以不加注意。3.所加乙醇的體積是以加了鹽后的體積計(jì)算的。4. 如果待純化的核酸樣品量太少 (1g 或樣品太稀 (0.01g/l, 則所加乙醇的 量應(yīng)擴(kuò)大到 2.53倍。3.核酸的濃縮以上所述的去除核酸中的蛋白質(zhì)后, 再用乙醇沉淀即為核酸的濃縮。 如果核酸樣 品已經(jīng)很純,則沉淀時(shí)無(wú)必要加入醋酸鹽;如果核酸樣品中還有雜質(zhì)需要去除, 則還應(yīng)加入醋酸鹽(NaAc, KAc或 NH 4AC 。4.高感受效率感受態(tài)細(xì)胞的制備 E. coli JM109或其它菌種 LB 液體培養(yǎng)基 50 mL離心管 LB 固體培養(yǎng)基 LB 平板200 L槍頭, 1

22、.5 mL Ep管,滅菌; 42水浴;10 L, 200 L加樣槍; 培養(yǎng)試管,滅菌; 恒溫?fù)u床,恒溫培養(yǎng)箱; 菌液推棒; 抗生素儲(chǔ)液,本實(shí)驗(yàn)室所有的質(zhì)粒篩選所用的抗生素有兩類,氨卞青霉素 (Amp (儲(chǔ)液, 100 mg/mL,溶于無(wú)菌水中,工作濃度 100 g/mL,即每毫升 培養(yǎng)基取 1 L儲(chǔ)液 ;四環(huán)素(Tet (儲(chǔ)液, 5 mg/mL,先用 1/2體積的乙醇 溶解, 再加入 1/2體積的無(wú)菌水, 工作濃度 50 g/mL, 即每毫升培養(yǎng)基取 10 L儲(chǔ)液。儲(chǔ)液全部于 -20保存 ; 冰; SOB 培養(yǎng)基 (1L; 蛋白胨 20 g, 酵母抽提物 5 g, NaCl 0.58 g, K

23、Cl 0.38 g,100鎂離子母液 (每 100 mL含 MgCl 26H 2O 20.33 g, MgSO47H 2O 24.65 g 10 mL。 用 1 mol/L NaOH調(diào) pH 至 7.0。 SOC 培養(yǎng)基:SOB+20 mmol葡萄糖(每 100 mL SOB培養(yǎng)基中加入 50%的葡 萄糖溶液 720 L。 0.5 mol/L CaCl2:7.35 g CaCl22H 2O 溶于 100 mL ddH2O 中。 用 0.22 m 的微孔 濾膜過(guò)濾除菌。 1 mol/L KCl:7.45 g KCl溶于 100 mL ddH2O 中,高壓滅菌。 0.45 mol/L MnCl2;

24、 8.9 g MnCl24H 2O 溶于 100 mL ddH2O 中,高壓滅菌。 0.5 mol/L(K-MES :9.76 g 2(-N-嗎啡啉乙磺酸溶于約 80 mL ddH2O 中,用 KOH 調(diào) pH 為 6.2,加水定容至 100 mL,用 0.22 m 的微孔濾膜過(guò)濾除菌。 分裝后于 -20o C 保存。 二甲基亞砜(DMSO 。 TB 緩沖液:10 mmol/L K-MES (pH 6.2 (0.5 mol/L K-MES (pH 6.2 2 mL , 45 mmol/L MnCl 2 (0.45 mol/L MnCl 2 10 mL, 15 mmol/L CaCl 2 (0.5 mol/L CaCl 2 3 mL , 250 mmol/L