圖像分析基本原理及分析過程

1、圖像分析基本原理及分析過程概述在生物及醫(yī)學研究中，對圖像的判讀與分析特別是對顯微鏡下微觀圖像的觀察研究從來都是重要的研究手段。隨著技術的進步，分析圖像的方法也從眼觀尺量進入到了使用電腦軟件進行定量分析的階段。電腦軟件的發(fā)展速度呈加速前進，采集圖像的設備也不斷更新，這使得我們能有更多的手段來分析測量復雜的生物圖像?，F(xiàn)在我們可以使用CCD數(shù)碼相機來采集圖像。使用功能比較強大的圖像分析軟件來進行圖像分析測量。相比之下，在不太久遠的十來年前使用的圖像分析儀及單色的圖像采集攝像機已經(jīng)過時了。而圖像分析的手段也比以前豐富。簡單地引用以前的分析方法未必就是最正確的方法，在許多情況下，需要我們依據(jù)軟件及相機的

2、情況設計與研究目標相適應的分析方法。分析測量圖像絕不僅僅是一個軟件使用的問題，而是從實驗設計開始，就要綜合考慮研究目標、樣品制作方法、拍攝方式、選擇視野等各方面因素，最后才是通過軟件實現(xiàn)最有效的圖像分析測量。一個完整的圖像分析過程應該包括：1.明確需要測量分析的對象。2.使用適當?shù)姆椒ㄅ臄z下這個對象，包括進行適當?shù)娜旧叭?，采集到突出顯示的測量對象的照片。3.分析照片上的圖像元素,確定能反映測量對象的圖像圖形4.測量照片上的圖形的測量參數(shù),進而得到測量對象的測量數(shù)據(jù)5.對測量對象進行統(tǒng)計分析。圖像分析的最正確效果，是利用圖像分析軟件可以自動地判斷測量目標，準確分析測量出目標對象的數(shù)值。由于生

3、物圖像的復雜性，軟件往往作不到這一點。此時只能退而求其次，采取抽樣統(tǒng)計，手工選擇等方法進行近似的測量。測量方法本身有時候也能成為一個研究課題。一、把研究目標轉換到圖像分析問題上。在丁香園混了好幾年了，雖然很喜歡與大家討論圖像分析的問題，但是卻經(jīng)常對一些求助視而不見，例如：請問用IPP怎么分析雙染的結果？謝謝！最近正要測腎小球面積以及球內PAS染色陽性面積粉紫色，不會操作，希望各位老師及同仁多多指教，非常感謝！傳張片子上來，請指導一下哦！免疫熒光定量分析選什么軟件好？是IPP嗎？這個軟件可以做雜交結果的分析嗎？具體如下：雜交后獲得陽性結果和陰性對照的結果，如何分析結果呢？下面是陽性和陰性的圖。謝

4、謝您的解答。 我做的是臍靜脈內皮細胞管道形成實驗，需要計算整張圖片上內皮細胞管道的數(shù)目以及管道的總長度，這個怎么用IPP計算??？希望能夠提供詳細步驟附有圖片。謝謝！我們在對免疫組化照片的陽性區(qū)域，進行最后的的統(tǒng)計學分析時，用的應該是哪個參數(shù)呢？-上面這些提問我是沒法答復的，除非是正好作過相關的研究，知道其來龍去脈。否則即使有圖片提交，也看不出哪里是腎小球內PAS，哪里是管道。不知道需要分析的對象在哪里，當然也就不會作了。所以一個完整的圖像分析過程應當是前面所述的五條，其中最重要的卻不在圖像分析上，而在于確定所要分析的目標以及如何把這個研究目的轉換成圖像分析的問題。這是圖像分析的關鍵之處。當然，

5、如果是常用的分析測量，是已經(jīng)有比較成熟的方法的，以免疫組化樣品為例：免疫組化的分析對象分析測量的目標是組織切片上特定蛋白的表達量。為了到達這個測量目標，先用特定抗體與切片反應，使之與切片上的特定蛋白結合，然后用DAB對結合了蛋白的抗體進行染色。這樣，DAB的染色深淺及范圍就能反應切片上相應蛋白的表達量了。所以免疫組化技術就是把切片上“蛋白表達量”這個研究目標轉換成了切片上“黃色染色物的分布”這個圖像分析問題。熒光標記的免疫組化圖片與此類似。另一個例子：利用凝膠電泳方法來測量RT-PCR產(chǎn)物的分子量及質量重量，研究目標是樣品中各種DNA片段的分子量與質量。通過電泳把加樣孔中的樣品分布到泳道之中后

6、，不同分子量的產(chǎn)物成份會分布到泳道的不同位置，形成條帶。用EB染色后，在紫外燈照射下各條帶發(fā)出熒光，就能顯示出條帶的位置與強度信息。這樣就把研究目標產(chǎn)物的各組分分子量與該組分的量重轉換成了凝膠圖像上的條帶的位置與光密度這個圖像分析問題。具體到前面提到的那些沒法答復的問題，實際上就是提問的信息不夠，沒法確定如何把研究目標轉換為圖像分析問題。當然，這類分析方法往往是從文獻上查找到的，是已經(jīng)有的分析方法，這時候就要仔細學習參考文獻上相關的表達，弄明白文獻上的方法是把分析目標轉換成什么樣的圖像分析目標。明確了這一點后，才能考慮如何通過圖像分析軟件實現(xiàn)正確的測量。甚至進一步改良測量方法。 二、正確地處理

7、樣品并進行拍攝。處理樣品主要是指對切片作正確的染色。雖然染色的方法基本上有一個標準的程序，但進行圖像分析的時候，根據(jù)分析目標對染色方法作適當?shù)膬?yōu)化能讓分析測量更加方便準確。在免疫組化切片染色時，由于要分析比較染色深淺，所以在制片時就要強調以同樣條件制作所有的組織切片。曾經(jīng)遇到一位，在染色時，遇到陰性樣品就有意延長一下顯色時間，讓片子黃一點，結果是陰性結果的光密度測量數(shù)值與陽性樣品一樣大。如果要分析細胞核，就得特別注意蘇木青藍染的深淺要適當，一般情況下，淺淺的藍色只能標記出細胞核的位置，明顯的藍色才適合于進行細胞核尺寸的測量或對細胞進行計數(shù)。而在進行細胞核上蛋白的免疫組化分析時，過淺的藍染會導致

8、細胞核選擇困難，過深的藍染則會掩蓋免疫組化產(chǎn)物的顏色。關于熒光免疫組化的染色就更復雜了，單染色的樣品要注意樣品熒光與背景熒光的比照度要足夠高。雙染色的樣品還要注意兩種染料的熒光強度應當適配，不要一種顏色的熒光特別強，另一種特別弱。最常見的是紅色熒光特別亮，而FITC的綠色卻很弱。結果是在拍攝時綠色的熒光實際上是紅色熒光圖像的綠色分量。拍攝樣品時影響的因素更多，更容易出錯。在拍攝大體物品時要特別注意背景與物體之間的比照。在拍攝離體組織器官時，把組織塊放在干凈的白紙或黑紙上以保證組織圖像與背景之間有清晰的分界線，在兩側各用燈光照明以防止留下影子。在缺乏照明條件的時候，也可以選擇在室外背光處拍攝，既

9、有足夠的照明也能防止明顯的陰影。一般的組織切片只要正確選擇視野并拍攝清楚就行了。而免疫組化的樣品卻額外要注意拍攝時的曝光：以同樣的曝光條件拍攝樣品。特別是熒光，一個對照組的弱熒光樣品，就應該拍攝得光強較弱，陰性的甚至拍攝出一張黑照片。如果有意延長弱樣品的曝光，照片雖然漂亮，但其表現(xiàn)的光密度就與陽性樣的強熒光差不多了。所以在我介紹免疫組化樣品的分析方法之前，都是先強調如何拍攝樣品。在使用倒置顯微鏡拍攝活細胞的時候，很多人并未注意到在顯微鏡上方的燈光筒下邊有一個長方形可推移的板，上面有三四個大小不一的園孔，這幾個孔的位置是與物鏡的選擇有關的。高倍鏡要使用小孔，低倍鏡用大點的孔。選擇不對的時候，觀察

10、圖像的反差不好。拍攝彩色照片的時候，相機色彩也是常被無視的。最常見的是拍攝的照片色彩偏藍。這對分析免疫組化圖片的影響非常大。偏藍的照片不僅降低了黃色深色的深淺程度，而且會使較淺的黃色變成了白色甚至淺藍色。 三、確定圖片上的測量目標在分析圖片時，雖然我們嘴上說的是測量細胞、細胞核或胞漿。但是心里應該有一個概念，就是實際上我們測量的是圖片上的一片黃色，一個藍色的園斑，或者一些邊界線圍成的區(qū)域，或者是某種色彩組成的區(qū)域。有了這個概念，才能真正地把研究目標轉換到圖像分析的目標。進而進行正確的測量。生物圖像幾乎沒有直線、正方或圓形這樣規(guī)則的圖形。因此，要測量對象的長度，面積，直徑這些指標時，是需要考慮該

11、如何進行近似測量或等效測量的。軟件可以準確測量不規(guī)則曲線的長度與不規(guī)則區(qū)域的面積。其他的指標往往就需要作等效計算或近似計算。例如：測量細胞的半徑。可以先測量細胞的面積，然后利用area=pi *r2公式計算其等效半徑。也可以通過細胞中心畫一組放射線，測量細胞在這些放射線方向上的直徑，然后取平均值作為它的近似測量值。這種測量等效值或近似值的方法在幾何測量中經(jīng)常用。我個人認為測量等效值更準確一些。選擇測量目標的另一個原則是要保證測量的可重復性。即使是手工測量，也應當保證兩次獨立的重復測量數(shù)值不會有太大的差異。 四、使用軟件測量說到這里，才算是提到了圖像分析軟件了。實際上Image-pro plus

12、不過是許多種圖像分析軟件中的一種。它是一種通用的圖像分析軟件，不僅是用在生物圖像分析上，在其他場合用得更多。其優(yōu)勢當然是功能強大，操作也順手。缺點只有一個，就是貴。請大家不要在此場合討論非正版軟件的問題，這不符合丁香園網(wǎng)站的規(guī)定。通用的軟件適合于多種場合下的應用，專用的軟件則有特定的應用場合，比方凝膠電泳分析軟件，它的功能范圍遠比不上通用的圖像分析軟件，但是在分析凝膠電泳圖片時，它卻非常方便。這次既然提到了關于RT-PCR凝膠圖片的分析及Western blot膜的分析，就得提到Image-pro plus的姊妹軟件：gel-pro。如果使用IPP來分析電泳圖片，恐怕會相當麻煩而且結果會比較粗

13、糙。用gel-pro來分析就輕松得多了。Image J也是圖像分析軟件。與IPP的功能類似，操作當然有不同。優(yōu)點是能自己編制處理功能，但要作到這一點卻是有難度的。專門分析凝膠圖片的軟件是很多的。常用的除了gel-pro之外，還有bandscan，quantity one, visionworks等，它們大多是與凝膠拍攝系統(tǒng)一起購買使用的。分析原理都一樣，操作上略有不同，功能基本上都差不多，用哪個都行的。用慣了IPP，再用gel-pro會熟悉一些。使用凝膠電泳分析軟件可以分析DNA凝膠圖片，RNA凝膠圖片，蛋白質的凝膠電泳圖片，Western blot膜的照片，化學發(fā)光作的Western blo

14、t膠片等。具體的軟件操作步驟不是本講座的重點。在另外文章里，有關于Image pro plus以及 gel-pro軟件的詳細具體的操作方法。五測量數(shù)據(jù)的統(tǒng)計分析。實際上統(tǒng)計分析測量數(shù)據(jù)依然是把研究目的轉換成圖像分析的問題的一部分。雖然是最后進行的工作，但在一開始就需要考慮對測量數(shù)據(jù)該如何處理。在最理想的情況下，使用軟件能準確地識別圖像上的測量對象，識別準確了，測量也就準確了。生物圖像本身是相當復雜的。軟件不能識別測量對象的情況非常普遍。往往只能手工選擇測量對象，這當然會有誤差。在更多的情況下，測量對象有許多，手工無法全部選擇上，這時候還得更退一步，選擇部分對象進行抽樣測量，這就必須要統(tǒng)計分析。

15、實際上，在分析組織切片的時候，拍攝照片本身就是一種抽樣。你不可能把切片全部拍攝下來，而是選擇幾個視野拍攝下照片。在哪里拍攝就有講究了。再深一步探究，就連在組織塊的哪個部位作切片也是一種抽樣。這是圖像分析軟件所無能為力的。所以從根本上來說，如何進行測量數(shù)據(jù)的統(tǒng)計分析并不是圖像分析的問題，而是實驗設計的問題。與圖像分析有關的是，實驗設計時必須考慮到圖像分析的因素。才能實現(xiàn)最終的實驗目標。有句俗話叫“功夫在詩外”。要想寫出好詩，關鍵并不在于寫詩的技巧有多高，而在于詩人的境界有多高。類似的，要想應用好圖像分析軟件，關鍵并不在于對軟件的操作技術有多熟悉，更重要的卻在于實驗設計上。在設計實驗的過程中就要考

16、慮如何利用圖像分析來得到有意義的實驗結果。有的時候，通過圖像分析能得到眼睛看不出來的有意義的實驗結果。免疫組化技術是當今廣泛應用的檢測組織切片內特定蛋白的實驗手段。利用圖像分析軟件來判讀切片圖像上蛋白表達程度是隨著軟件技術的發(fā)展逐步應用到免疫組化技術中的。組織上的蛋白表達程度，在圖片上表現(xiàn)為免疫染色的深淺及面積大小。用肉眼只能定性地進行判讀，最多粗略地作一個主觀的分級評價。使用圖像分析軟件則可以對圖片染色的程度作一個定量的測量。這個測量結果與切片上的蛋白表達強度有理論上的線性相關性。所以能客觀定量地反映它。在圖像分析的方法中，使用灰度來表示一個點的明暗程度，而圖片上一個點的明暗程度是與切片上免

17、疫染色物的“光學密度OD，Optical Density ”決定的，再往下追蹤一步，就是與組織切片上這個點的蛋白表達程度決定的。這有點類似于分光光度計的情形，比色皿里液體樣品的吸光度與液體中吸光成分的濃度相關，符合朗伯-比爾定律。圖片上一個點的光密度則與該點上的蛋白表達程度正相關近似為正比。所以測量一個點的光密度值，就是在測量這個點上蛋白表達程度的一個相對的量值。朗伯-比爾定律：A = lg(1/T) = kbCA為吸光度,T為透射比,是投射光強度比上入射光強度c為吸光物質的濃度 b為吸收層厚度請注意：郎伯比爾定律中的指數(shù)關系表現(xiàn)在吸光度A與透射率T之間。吸光度A就是光密度OD。它與樣品濃度是

18、線性關系。所以圖片上光密度值與蛋白表達之間的關系理論上也是線性的。但它與灰度值之間的關系是指數(shù)的。因此，測量光密度值能更緊密地與蛋白表達程度相關，而灰度值則類似于透光率，它與蛋白表達程度的關系是朗伯比爾定律的反向的指數(shù)關系。這就是我一再強調要測量光密度值的原因。在分光光度法中，我們需要作標準曲線來定量分析樣品的實際濃度，但在組織切片的情形下，是沒法作標準曲線的。所以我們只能測量到一個相對值。能對不同點的蛋白表達程度進行比較，但不能測量到這個點的蛋白量具體是多少微克。把一片區(qū)域內所有的點的光密度值累加起來，就得到一個積分光密度IOD, Integrate Optical Density 。 圖片

19、上一片片的染色斑塊的深淺與范圍反映了切片上的特定蛋白表達的程度，它可以由圖片上的積分光密度來相對定量地來表示。光密度值是一個相對的數(shù)值，所以它是沒有單位的！所以后面的積分光密度值與平均光密度值都是沒有單位的。這種相對的測量數(shù)值對我們設計圖像分析方法有直接的影響。我們沒法通過圖像分析的方法測量出切片上有多少測定的蛋白。只能通過比較的方法來判斷實驗組樣品與對照組樣品之間的蛋白表達差異。 無論使用什么圖像分析軟件，測量原理都是一樣的。就是測量圖片上一個區(qū)域內的黃色染色物的積分光密度。但是具體測量哪些區(qū)域的積分光密度以及最后要如何作統(tǒng)計分析，就不是一個簡單的圖像分析問題了，而是與研究目標密切關聯(lián)的實驗

20、設計問題。這也就是我無法說出該選擇什么樣的測量區(qū)域來計算區(qū)域面積與區(qū)域內光密度值的原因。我只能總結出一個規(guī)律，就是要計算一個平均光密度指標來進行實驗組樣品與對照組樣品的統(tǒng)計比較。也就是計算出測量區(qū)域內的積分光密度值，然后對這個區(qū)域的面積進行平均。以這個平均光密度值作為統(tǒng)計比較的依據(jù)。 例如：根據(jù)實驗設計選擇的測量指標：注意上一帖的右圖是陰性對照的典型圖片。在測量這種圖片上的平均光密度的時候，IOD會是一個極小的數(shù)值。但是在選擇測量區(qū)域的時候，則需要與陽性樣品一樣選擇一個較大的測量區(qū)域，所以最后計算出來的平均光密度值會也是一個極小的數(shù)值。一個常見的錯誤是對這種陰性樣品進行測量時，以染色區(qū)域面積作

21、為計算平均光密度值時使用的面積。要知道雖然整張照片的染色很淺。但某些細小的點上的密度卻不小。如果只計算這些染色的小片區(qū)域，最后計算出來的平均光密度值將是一個不小的錯誤數(shù)值。 直接比較整張圖片的積分光密度值。實際上測量面積就是整張圖片的面積。 比較特定區(qū)域的平均光密度值。在一張圖片上有許多區(qū)域的時候，可以只抽取其中部分試樣來測量的。這影響到的是抽樣量。當然，應當盡可能地測量圖片上全部應當測量的區(qū)域。 同一張圖片上不同的區(qū)域之間進行比較。這時候一張圖片上能得到一對數(shù)據(jù)，全部樣品測量數(shù)據(jù)可以作配對T-檢驗。 測量圖片上一個特定區(qū)域內的平均光密度。注意選擇測量區(qū)域的時候，選得不太準不要緊，這仍然是個抽樣的問題，它對平均光密度值的影響是很小的。 測量區(qū)域就是染上了顏色的細胞，此時在測量黃色的IOD值的時候能同時測量出面積來。不必另外去選擇測量區(qū)域。根據(jù)實驗設計可以有多種測量指標供選擇：每個細胞的面積，積分光密度，平均光密度，照片上的細胞數(shù)量其實就是細胞密度等等。 測量了圖片上特定區(qū)域的IOD之后，還需要測量這個區(qū)域的面積。然后計