促凋亡基因bad在皮膚血管瘤組織中的表達(dá)

1、促凋亡基因bad在皮膚血管瘤組織中的表達(dá)         08-03-17 10:39:00     作者：李輝 張端蓮 陜聲國    編輯：studa20【關(guān)鍵詞】  bad；,血管瘤；,凋亡；,免疫組織化學(xué),摘  要：  目的：探討促凋亡基因bad在皮膚血管瘤中的表達(dá)及其與臨床的關(guān)系。方法：采用免疫組織化學(xué)方法檢測人皮膚血管瘤增生期、退化期及正常皮膚組織中bad的表達(dá)水平，利用計(jì)算機(jī)圖像分析技術(shù)測量不同

2、時(shí)期血管瘤組織和正常皮膚組織bad表達(dá)的平均光密度和平均陽性面積。結(jié)果： 圖像分析結(jié)果顯示,增生期組的平均光密度為0.0496±0.0152；退化期組的平均光密度為0.1751±0.0349；正常皮膚組的平均光密度為0.0524±0.0164。增生期組的陽性面積率為0.1047±0.0103；退化期組的陽性面積率為0.2943±0.0371；正常皮膚組的陽性面積率為0.1103±0.0132 。經(jīng)q檢驗(yàn)，退化期組與增生期組、退化期組與正常皮膚組之間，bad的平均光密度及陽性面積率有顯著性差異（P0.01）, 增生期組與正常皮膚組之間平

3、均光密度及陽性面積率的差異無顯著性（P0.05）。結(jié)論： bad通過誘導(dǎo)血管瘤內(nèi)皮細(xì)胞的凋亡而促進(jìn)血管瘤由增生向退化的轉(zhuǎn)變。關(guān)鍵詞：  bad；  血管瘤；  凋亡；  免疫組織化學(xué)    血管瘤是嬰幼兒最常見的一種良性腫瘤，其發(fā)病率約為10%，男女比例為1:3。目前成人病例也不少見。這種良性腫瘤在嬰幼兒出生后通過內(nèi)皮細(xì)胞的增生而快速生長，雖然部分血管瘤可以自行消退，但仍有部分未退化的血管瘤。如果位于顏面、顱內(nèi)及口腔可引起明顯的畸形及功能障礙，持續(xù)發(fā)展則可產(chǎn)生潰瘍、出血、感染等一系列并發(fā)癥；位于顏面及口腔的血管瘤可引起明顯的

4、外觀畸形及功能障礙，嚴(yán)重影響患者的身心健康。臨床治療手段主要包括：手術(shù)切除、冷凍、栓塞、硬化劑注射治療、激素、干擾素治療、各種激光治療等1,2。這些治療手段普遍存在損傷大，有一定副作用等缺點(diǎn)。不但效果欠佳而且給病人帶來極大痛苦。如皮質(zhì)激素被認(rèn)為是治療血管瘤的首選藥物，對增生期血管瘤有效率為30%903，但是同時(shí)它存在的副作用有延遲骨架生長、損害機(jī)體的免疫能力等4。因此尋找一種有效的治療手段對血管瘤患者有重要意義。細(xì)胞凋亡（apoptosis）是多細(xì)胞有機(jī)體為調(diào)控機(jī)體發(fā)育、維持內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定由基因調(diào)控的細(xì)胞主動死亡過程。血管瘤自發(fā)消退的過程中無炎癥反應(yīng)，無組織壞死，非常符合凋亡的過程，因此許多研究者

5、推測可能是由于增殖的血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡導(dǎo)致血管瘤自發(fā)消退。促凋亡基因bad是bcl2家族中的一員,其對血管瘤的發(fā)生、發(fā)展及其退化的研究尚未見文獻(xiàn)報(bào)道。為此我們應(yīng)用免疫組織化學(xué)方法和圖像分析技術(shù)檢測血管瘤增生期、退化期以及正常皮膚組織中bad的表達(dá)水平，以探討bad基因在血管瘤發(fā)生、發(fā)展過程中的作用機(jī)制。1  材料與方法11  材料111  材料來源  收集武漢大學(xué)人民醫(yī)院病理科20022006年皮膚血管瘤存檔蠟塊50例，其中男性25例，女性25例。血管瘤所在的部位主要有頭皮、前額、眼瞼、耳背、頸部、背部、上臂、大腿、手和足的皮膚等?；颊咝g(shù)前均未做任何輔助性

6、治療。112  材料分組  蠟塊切片厚5m，貼片于涂有多聚賴氨酸的潔凈載玻片上，置于烤箱烤干待用。常規(guī)HE染色和免疫組織化學(xué)SP法檢測增殖細(xì)胞核抗原（proliferating cell nuclear antigen，PCNA），按Mulliken分類標(biāo)準(zhǔn)并結(jié)合PCNA的表達(dá)進(jìn)行分組：增生期血管瘤22例，退化期血管瘤28例。另取瘤組織周圍正常皮膚組織5例作對照。12  主要試劑和儀器121  主要試劑  即用型鼠抗人PCNA單克隆抗體（北京中山生物技術(shù)有限公司）； 即用型兔抗人因子相關(guān)抗原多克隆抗體（北京中山生物技術(shù)有限公司）； 濃縮型鼠抗人

7、bad單克隆抗體（美國Santa Cruz公司）； 超敏即用型SP通用型免疫組織化學(xué)試劑盒（福州邁新生物有限公司）； DAB顯色試盒及多聚賴氨酸（北京中山生物技術(shù)有限公司）。122  主要儀器  YWY781型醫(yī)用微波儀(250W，50Hz)，浙江臨安電子器材廠生產(chǎn)；家用高壓鍋。13  方法131  常規(guī)HE染色  取材、固定、脫水、透明、切片和HE染色。132  免疫組織化學(xué)SP法檢測bad、PCNA和因子相關(guān)抗原  主要步驟： 組織切片5m，常規(guī)脫蠟至水，蒸餾水洗； 3%過氧化氫37孵育10min以抑制內(nèi)源性過氧化物酶活

8、性，PBS洗4×5min； bad采用微波抗原修復(fù)（3檔，10min），PCNA采用高壓抗原修復(fù)，因子相關(guān)抗原采用胃酶消化修復(fù)抗原，PBS洗4×5min； 正常羊血清37孵育10min以減少非特異性反應(yīng)； 一抗（bad，1: 150；)37孵育1 h，PBS洗4×5min； 生物素標(biāo)記的二抗，37孵育10 min，PBS洗4×5min； 鏈霉菌抗生物素蛋白過氧化物酶復(fù)合物37孵育10 min，PBS洗4×5min； DAB顯色液顯色，自來水沖洗終止反應(yīng)； 蘇木精復(fù)染，脫水，透明，封片。用PBS代替一抗作為陰性對照，人扁桃體作為bad的陽性對照，

9、人正常皮膚表皮作為PCNA的陽性對照。133  免疫組織化學(xué)結(jié)果判斷   bad和因子相關(guān)抗原以胞膜或胞漿出現(xiàn)棕黃色顆粒為陽性反應(yīng)，PCNA以細(xì)胞核出現(xiàn)棕黃色顆粒為陽性反應(yīng)。陰性對照除細(xì)胞核染成藍(lán)色外，胞核和胞漿內(nèi)無棕黃色反應(yīng)物。采用HPIAS2000高清晰度彩色病理圖文報(bào)告管理系統(tǒng)（同濟(jì)千屏影像公司）對bad的表達(dá)進(jìn)行定量分析，每張切片隨機(jī)選取5個(gè)完整而不重疊的高倍鏡視野（×400），測定每個(gè)視野下陽性反應(yīng)的平均光密度、陽性反應(yīng)面積和所有細(xì)胞總面積，計(jì)算陽性面積率。以每例5個(gè)視野的平均光密度、陽性面積率的平均值作為該例的測量值。（陽性面積率單位面積中陽

10、性反應(yīng)的總面積/單位面積中細(xì)胞的總面積×100）134  統(tǒng)計(jì)學(xué)處理  對各組免疫組織化學(xué)反應(yīng)陽性顆粒的平均光密度、陽性面積率作單因素方差分析和SNKq檢驗(yàn)，檢驗(yàn)水準(zhǔn)為0.05。2  結(jié)果21  PCNA的表達(dá)增生期血管瘤內(nèi)皮細(xì)胞核內(nèi)彌漫分布棕黃色顆粒，PCNA表達(dá)強(qiáng)。退化期血管瘤內(nèi)皮細(xì)胞核被蘇木精染成藍(lán)色，胞核內(nèi)有少量棕黃色顆粒，PCNA表達(dá)弱。 22  因子相關(guān)抗原的表達(dá)增生期和退化期血管瘤內(nèi)皮細(xì)胞胞漿內(nèi)彌漫分布棕黃色顆粒。23  bad的表達(dá)退化期血管瘤內(nèi)皮細(xì)胞胞漿內(nèi)棕黃色顆粒較多；增生期血管瘤內(nèi)皮細(xì)胞胞漿內(nèi)無棕黃色顆粒；正常皮膚組織血管內(nèi)皮細(xì)胞胞漿內(nèi)無棕黃色顆粒。圖像分析結(jié)果顯示：增生期組的平均光密度為0.0496±0.0152；退化期組的平均光密度為0.1751±0.0349；正常皮膚組的平均光密度為0.0524±0.0164。增生期組的陽性面積率為0.1047±0.0103；退化期組的陽性面積率為0.2943±0.0371；正常皮膚組的陽性面積率為0.1103