蛋白組學(xué)技術(shù)

1、蛋白質(zhì)組學(xué)研究技術(shù)蛋白質(zhì)組學(xué)研究技術(shù)12生物制藥第一組生物制藥第一組主要內(nèi)容主要內(nèi)容蛋白質(zhì)組學(xué)研究背景蛋白質(zhì)組學(xué)研究背景1蛋白質(zhì)組學(xué)定義及內(nèi)容蛋白質(zhì)組學(xué)定義及內(nèi)容2蛋白質(zhì)組學(xué)研究技術(shù)蛋白質(zhì)組學(xué)研究技術(shù)3蛋白質(zhì)組學(xué)研究進(jìn)展蛋白質(zhì)組學(xué)研究進(jìn)展4 人類(lèi)基因組計(jì)劃結(jié)束給科學(xué)工作者極大鼓舞，同時(shí)也引出了更多的問(wèn)題： 大量涌現(xiàn)出的新基因，它們有什么功能？編碼什么蛋白？在生命過(guò)程中發(fā)揮什么樣的作用？ 這些問(wèn)題靠傳統(tǒng)的研究方法不可能解決。蛋白質(zhì)組（proteome)和蛋白質(zhì)組學(xué)（proteomics)的概念就是在這個(gè)基礎(chǔ)上提出的。一、蛋白質(zhì)組學(xué)研究背景一、蛋白質(zhì)組學(xué)研究背景二、蛋白質(zhì)組學(xué)定義及內(nèi)容二、蛋白質(zhì)組

2、學(xué)定義及內(nèi)容 蛋白質(zhì)組學(xué)是蛋白質(zhì)和基因組研究在形式和內(nèi)容兩方面的完美組合，該技術(shù)致力于研究某一物種，個(gè)體，器官，組織或細(xì)胞在特定條件，特定時(shí)間所表達(dá)的全部蛋白質(zhì)圖譜。2.1 2.1 蛋白質(zhì)組學(xué)定義蛋白質(zhì)組學(xué)定義 1994年，Marc Wilkim在Siena雙向凝膠電泳(twodimensional electrophoresis，2-DE)會(huì)議上最早提出了蛋白質(zhì)組(proteome)概念-是由一個(gè)基因組或一個(gè)細(xì)胞，組織表達(dá)的所有protein。2.1.12.1.1蛋白質(zhì)組蛋白質(zhì)組2.1.2 2.1.2 蛋白質(zhì)組學(xué)（蛋白質(zhì)組學(xué)（proteome)proteome)2.2 蛋白質(zhì)組學(xué)研究?jī)?nèi)容蛋白

3、質(zhì)組學(xué)研究?jī)?nèi)容 2.2.12.2.1蛋白質(zhì)鑒定：蛋白質(zhì)鑒定： 分子量及等電點(diǎn)分析 western blot 或者免疫共沉淀等技術(shù)初步鑒定蛋白質(zhì)種類(lèi) 質(zhì)譜技術(shù)分析蛋白質(zhì)的氨基酸序列 在數(shù)據(jù)庫(kù)中對(duì)比確定蛋白質(zhì)的家族歸屬2.2.2 2.2.2 蛋白質(zhì)的修飾：蛋白質(zhì)的修飾： 真核生物蛋白質(zhì)翻譯后會(huì)進(jìn)行修飾：乙?；?磷酸化 糖基化 這些修飾是調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)功能的重要方式2.2.3 2.2.3 蛋白質(zhì)功能確定：蛋白質(zhì)功能確定： 研究蛋白質(zhì)的功能，蛋白質(zhì)相互作用 酵母雜交技術(shù) 噬菌體展示技術(shù) RNA干擾技術(shù) 三、蛋白質(zhì)組學(xué)研究技術(shù)三、蛋白質(zhì)組學(xué)研究技術(shù) 雙向電泳技術(shù)雙向電泳技術(shù)(2DE)(2DE) 熒光差異顯示

4、雙向電泳技術(shù)熒光差異顯示雙向電泳技術(shù)(2DDIGE)(2DDIGE) 蛋白質(zhì)質(zhì)譜分析技術(shù)蛋白質(zhì)質(zhì)譜分析技術(shù)(ESIMS)(ESIMS)1975 年,意大利生化學(xué)家OFarrell （奧法雷爾）發(fā)明了雙向電泳(2-DE)技術(shù)。該技術(shù)應(yīng)用兩個(gè)不同分離原理為依據(jù)進(jìn)行分離，即利用蛋白質(zhì)分子的等電點(diǎn)(PI)和相對(duì)分子量的不同進(jìn)行分離第一向電泳是蛋白質(zhì)的等電聚焦，根據(jù)蛋白質(zhì)等電點(diǎn)差異進(jìn)行分離，該分離技術(shù)采用固定pH梯度技術(shù)(IPG)可以實(shí)現(xiàn)等電點(diǎn)只差001pH單位的蛋白質(zhì)的分離；第二向電泳是利用蛋白質(zhì)相對(duì)分子量差異進(jìn)行分離，可分離相對(duì)分子量在100103150103的蛋白質(zhì)。3.1 3.1 雙向電泳技術(shù)雙

5、向電泳技術(shù)(2DE)(2DE)例如：番茄種子空間搭載與地面后代葉片的差異蛋白質(zhì)組研究。例如：番茄種子空間搭載與地面后代葉片的差異蛋白質(zhì)組研究。CK-2CK-2是對(duì)照組，是對(duì)照組，MIR-2MIR-2是實(shí)驗(yàn)組。是實(shí)驗(yàn)組。圖1用不同裂解液裂解后的CK-2雙向電泳圖左圖裂解液中的去垢劑用的是CHAPS,右圖裂解液中的去垢劑是NP-40。圖2 對(duì)照樣品CK以及和平號(hào)搭載樣品MIR 的雙向電泳結(jié)果圖 樣品MIR-2和對(duì)照組CK-2的雙向電泳結(jié)果進(jìn)行了IMAGE MASTER 軟件分析, 共找到了42個(gè)表達(dá)差異2倍以上的蛋白質(zhì)點(diǎn),對(duì)其中26個(gè)差異比較明顯的蛋白質(zhì)點(diǎn)進(jìn)行了ESIQ-TOF MS /MS質(zhì)譜分

6、析, 共鑒定出10個(gè)蛋白質(zhì)點(diǎn), 鑒定的蛋白質(zhì)在對(duì)照組均表現(xiàn)為上調(diào), 在空間站搭載樣品中表現(xiàn)為下調(diào)。3.23.2熒光差異顯示雙向電泳技術(shù)熒光差異顯示雙向電泳技術(shù)(2DDIGE)(2DDIGE) 熒光差異顯示凝膠電泳(2D-DIGE)是一種新出現(xiàn)的熒光標(biāo)記的定量蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)，比經(jīng)典的2-DE 具有更高的動(dòng)力學(xué)范圍和靈敏性。該方法通過(guò)引入內(nèi)標(biāo)使得多個(gè)樣品在一塊膠上分離，進(jìn)而減少了實(shí)驗(yàn)條件不一致引起的誤差。DIGE 技術(shù)可檢測(cè)到表達(dá)差異小于10的蛋白，統(tǒng)計(jì)學(xué)可信度達(dá)到95以上。 DIGE 系統(tǒng)基于熒光差異凝膠電泳(2D-DIGE)技術(shù)，是利用電荷和分子量的差異分離蛋白質(zhì)混合物，并通過(guò)多通道激光掃描分

7、析不同蛋白質(zhì)的第二向SDS-PAGE 凝膠圖像。 DIGE 系統(tǒng)結(jié)合了新型熒光技術(shù)、樣品多路技術(shù)(sample multiplexing)和圖像分析等特有的技術(shù)，是一套優(yōu)于經(jīng)典的2-DE 的完整的系統(tǒng)。 DIGE的試驗(yàn)流程的試驗(yàn)流程3.3 3.3 蛋白質(zhì)質(zhì)譜分析技術(shù)蛋白質(zhì)質(zhì)譜分析技術(shù)(ESIMS)(ESIMS) 質(zhì)譜分析技術(shù)是利用質(zhì)譜儀使物質(zhì)離子化成離子并通過(guò)適當(dāng)?shù)碾妶?chǎng)、磁場(chǎng)將它們按空間位置、時(shí)間先后或者軌道穩(wěn)定與否實(shí)現(xiàn)質(zhì)荷比分離，并檢測(cè)其強(qiáng)度，從而對(duì)物質(zhì)進(jìn)行分析的技術(shù)。 質(zhì)譜是帶電原子、分子或分子碎片按質(zhì)荷比的大小順序排列的圖譜。質(zhì)譜分析技術(shù)的基本原理IonizerSample+_Mass

8、AnalyzerDetector MALDI SELDI Electro-SprayIonization (ESI) Time-Of-Flight (TOF) Quadrapole Ion-Trap ElectronMultiplier(EM)四、蛋白質(zhì)組學(xué)的研究進(jìn)展四、蛋白質(zhì)組學(xué)的研究進(jìn)展4.14.1 在基礎(chǔ)研究方面在基礎(chǔ)研究方面 近兩年來(lái)蛋白質(zhì)組研究技術(shù)已被應(yīng)用到各種生命科學(xué)領(lǐng)域，如細(xì)胞生物學(xué)、神經(jīng)生物學(xué)等。在研究對(duì)象上，覆蓋了原核微生物、真核微生物、植物和動(dòng)物等范圍，涉及到各種重要的生物學(xué)現(xiàn)象，如信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、細(xì)胞分化、蛋白質(zhì)折疊等等。在未來(lái)的發(fā)展中，蛋白質(zhì)組學(xué)的研究領(lǐng)域?qū)⒏訌V泛。4.2 4.2 在應(yīng)用研究方面在應(yīng)用研究方面 蛋白質(zhì)組學(xué)將成為尋找疾病分子標(biāo)記和藥物靶標(biāo)最有效的方法之一。在對(duì)癌癥、早老性癡呆等人類(lèi)重大疾病的臨床診斷和治療方面蛋白質(zhì)組技術(shù)也有十分誘人的前景，目前國(guó)際上許多大型藥物公司正投入大量的人力和物力進(jìn)行蛋白質(zhì)組學(xué)方面的應(yīng)用性研究。4.3 4.3 在技術(shù)發(fā)展方面在技術(shù)發(fā)展方面 蛋白質(zhì)組學(xué)的研究方法將出現(xiàn)多種技術(shù)并存，各有優(yōu)勢(shì)和局限的特點(diǎn)，而難以象基因組研究一樣形成比較一致的方法。除了發(fā)展新方法外，更強(qiáng)調(diào)各種方法間的整合和互補(bǔ)，以適應(yīng)不同蛋白質(zhì)的不同特征。另外，蛋白質(zhì)組學(xué)與其它學(xué)科的交叉也將日益顯著和重要，這種交叉是新技術(shù)